基因工程的载体和受体优品文档.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,5,学时）,*,2011-9-19,基因工程的载体和受体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,5,学时）,2011-9-19,基因工程的载体和受体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,5,学时）,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的载体和受体,5,学时）,1,一、用于基因克隆的载体,5,学时）,（,1,）携带外源,DNA,进入宿主细胞的工具。,（,2,）能够运载外源,DNA,片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源,DNA,片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类,DNA,分子。,（,3,）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。,1.,载体的概念,2,5,学时）,3,2.,载体的功能（,function of vector,）,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,3.,载体应具备的条件（,characteristics of vector,）,可转移性：,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。,具有与受体细胞相适应的,复制位点,（,ori,，,origin of replication,）或,整合位点。,具有较高的外源,DNA,的,装载能力,。,多克隆位点,（,multiple cloning site,MCS,）：具有多种限制性内切酶的,单一切点,。,具有合适的,筛选标记,（,selection marker,）。,安全,，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其他生物细胞中。,5,学时）,4,质粒（,plasmid,）,噬菌体或病毒,DNA,考斯质粒（,cosmid,）与噬菌粒,人造染色体载体,5,学时）,4.,载体的种类,5,（一）质粒（,plasmid,）,1.,质粒的定义,质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳定遗传的一类核酸分子。,质粒常见于原核细菌和真菌中。,绝大多数的质粒是,DNA,型的。,绝大多数质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即,cccDNA,（,covalently closed circularDNA,，,cccDNA,）。,质粒,DNA,的分子量范围：1-300,kb,。,功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。,5,学时）,6,（,1,）质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的,DNA,复制系统进行自主复制。,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒：1-3 拷贝,stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒：10-60 拷贝,relaxed plasmid,但这种对应关系不是绝对的，若细胞生长环境中存在蛋白质合成抑制剂（氯霉素、壮观霉素等）时，细胞的染色体,DNA,的复制受阻，而质粒仍可扩增，使其数量可达数千拷贝。,2.,质粒的基本特征,5,学时）,7,（,2,）质粒的不相容性（,incompatibility,）,任何两种含有,相似复制子结构,的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为,质粒的不相容性,，不相容性的质,粒组成不相容性群。,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1,拥有相似的复制子结构，彼此不相容；,pSC101、F、RP4,拥有相似的复制子结构，彼此不相容；,p15A,及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容。,5,学时）,8,通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如,滚环复制和,复制,。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于,pMB1,质粒或,ColE1,质粒的复制起始位点。,质粒不相容的分子机制,两种含有相似复制子结构的质粒，在复制时受,同一种拷贝数控制系统,的控制而产生,竞争,，致使两种质粒的最终拷贝数不同。其中，,拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,，并逐步将另一质粒,“稀释”淘汰,。,两种含有不同复制子结构的质粒，在复制时,受,各自的拷贝数控制系统,的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。,5,学时）,9,（,3,）质粒的可转移性,据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒：,能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如,F,质粒。,非接合型质粒：,不能在天然条件下独立地发生接合作用如,Col、R,质粒的一些成员。,值得注意的是，某些非接合型质粒（,ColE1）,在接合型质粒的存在和协助下，也能发生,DNA,转移，这个过程由,bom,和,mob,基因决定。,5,学时）,10,（,4,）携带特殊的遗传标记,野生型的质粒,DNA,上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性：,抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成：,细菌毒素、有机碱,这些标记基因对,DNA,重组分子的筛选具有重要意义。,5,学时）,11,3.,几种代表性质粒,F,因子（,fertility factor,）：,又称致育因子或性因子，,6210,6,Dalton,，,94.5 kb,，相当于核染色体,DNA,大小的,2%,，环状双链,DNA,，足以编码,94,个中等大小多肽，其中,1/3,基因（,tra,区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,5,学时）,Figure.Representative FERTILITY PLASMID.,A fertility plasmid carries the genes for,conjugation,as well as a number of other genes.In this figure the fertility plasmid also carries,antibiotic resistant,genes.,12,最初发现于痢疾志贺氏菌（,Shigella dysenteriae,），后来发现还存在于,Salmonella,、,Vibrio,、,Bacillus,、,Pseudomonas,和,Staphylococcus,中。,R,因子由相连的两个,DNA,片段组成，即抗性转移因子（,resistence transfor factor,，,RTF,）和抗性决定,R,因子（,r-determinant,）。,RTF,为分子量约为,1110,6,Dalton,，控制质粒拷贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到,10010,6,Dalton,以上，其上带有抗生素的抗性基因。,R,因子在细胞内的拷贝数：从,12,个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经,氯霉素,处理后，松弛型质粒可达,20003000,个,/,细胞。,5,学时）,R,因子（,resistance factor,）,13,Col,因子（,colicinogenic factor,）,含有编码大肠杆菌素因子的质粒。,大肠杆菌素是由,E.coli,的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、翻译或能量代谢等专一地杀死其它肠道细菌，由,Col,因子编码。,Col,因子可分为两类，分别以,ColE1,和,ColIb,为代表。,ColE1,：分子量约为,510,6,Dalton,，无接合作用，多拷贝；,ColE1,研究得很多，并被广泛地用于重组,DNA,的研究和用于体外复制系统上。,ColIb,分子量约为,8010,6,Dalton,，与,F,因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有,12,个拷贝。,凡带,Col,因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,5,学时）,14,只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可以编码一系列能降解复杂物质的酶，从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解,CAM,（樟脑）质粒，,XYL,（二甲苯）质粒，,SAL,（水杨酸）质粒，,MDL,（扁桃酸）质粒，,NAP,（萘）质粒和,TOL,（甲苯）质粒等。,5,学时）,降解性质粒,近年来在,Rhizobium,（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为,20030010,6,Dalton,，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,巨大质粒（,mega,质粒）,15,Ti,质粒（,tumor inducing plasmid,）,诱癌质粒,存在于根癌土壤杆菌（,Agrobacterium tumefaciens,）中,可引起许多双子叶植物的根癌。,当细菌侵入植物组织后，可以把细菌的,DNA,释放到植物细胞中。这时，,Ti,质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合,，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。,Ti,质粒大小约,200 kb,，是一个大型质粒。当前，,Ti,质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借,DNA,重组技术设法插入到,Ti,质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,5,学时）,16,4.,质粒的改造,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工改造。,5,学时）,17,删除不必要的,DNA,区域，缩小分子量，,提高外源,DNA,片段的装载量,灭活质粒上的某些编码基因,加入易于识别的,选择标记基因,选择标记基因内引入内切酶的酶切位点序列,-,多克隆接头,(Polylinker),加入特殊的,基因表达调控元件,5,学时）,（,1,）质粒改造的策略,18,（,2,）一个合格质粒的组成要素,5,学时）,复制起始位点,Ori,：,控制复制起始的位点。原核生物,DNA,分子中只有一个复制起始点；而真核生物,DNA,分子有多个复制起始位点,抗生素抗性基因：,便于对目的基因的检测，如,Amp,r,、,Kan,r,多克隆位点,MCS,：,克隆携带外源基因的片段,P/E,（,Promoter/Enhancer,）：,启动子,/,增强子,T,（,Terminator,）：,终止信号,poly(A),加尾信号：,稳定,mRNA,19,5.,质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒,突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因,低拷贝质粒,来自,pSC101,，拷贝数小于10，表达某些毒性基因,温敏质粒,在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒,含有测序通用引物互补序列和多酶接头,polylinker,整合质粒,装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合,穿梭质粒,装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆,表达质粒,装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒,装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选,5,学时）,20,21,5,学时）,6.,如何阅读质粒图谱,5,学时）,22,RBS,：,ribosome-binding site,原核,RBS,：,SD sequence,真核,RBS,：,Kozak sequence,5,学时）,23,7.,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,（,1,）,pBR322,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/,cell,用于基因克隆,5,学时）,24,（,2,）,pUC18,/19,拷贝数：,2000-3000/cell,用于基因克隆和测序,多克隆位点（,MCS）,正选择颜色标记,lacZ,：,E.coli,lacZ,基因的,5,端序列，表达半乳糖苷酶的,片段。,LacZ,的上游包括乳糖操纵子上的启动子,Plac,和操纵基因,O,。,5,学时）,25,26,5,学时）,pUC18,/19的正选择标记,lacZ,的显色原理,pUC18,/19,Plac,lacZ,MCS,b,-,半乳糖苷酶的,a,-,肽段,a,b,5-,溴-4-氯-3-吲哚基-,b,-D-,半乳糖苷 （,IPTG,）,X-gal,5,学时）,27,蓝白斑筛选,pUC18,/19质粒上的,LacZ,基因包括一段,-,半乳糖苷酶的启动子、编码,肽链的区段、一个多克隆位点,(MCS),。,MCS,位于编码,肽链的区段中，是外源,DNA,的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码,肽链的功能活性。,当菌体中含有带,lacz,的质粒后，质粒,lacz,基因编码的,肽链和菌株基因组表达的,N,端缺陷的,-,半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整,-,半乳糖苷酶相同的作用，使,X-gal,生成蓝色物质，这种现象即,-,互补。,用这种质粒进行克隆时，如果外源基因破坏了,LacZ,的编码序列，所产生的蛋白产物就会丧失,-,互补能力，在含有,X-gal,和,IPTG,的平板下形成无色菌斑，可用于重组子的筛选。,5,学时）,28,标志补救（,-,半乳糖苷酶法）,lacZ,Amp,r,N,2,H,片段,COOH,片段,lacZ,5,学时）,29,（,LacZ,基因序列）,插入片段,（,LacZ,基因失活）,LacZ,基因,N,端序列,LacZ,酶,5,学时）,30,抗性决定因子大小不固定，从几百万到100106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。,构建策略：将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白基因序列中的CAG密码子突变成UAG。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。,当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。,用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,自主复制繁殖性能，使外源基因在受体细胞中高效扩增,同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体,具有较高的外源DNA的装载能力。,通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体称为插入型载体（insertion vectors）。,载体应具备的条件（characteristics of vector）,最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。,cos site-carrying plasmid,遗传背景清楚，载体、受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定。,（,3,）,pGEM-3Z,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子，用于外源基因的高效表达,装有多克隆位点（,MCS）,正选择颜色标记,lacZ,注意：,T7,和,SP6,启动子特异性地由噬菌体,DNA,编码的,RNA,聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体,RNA,聚合酶，如：,E.coli,BL21（DE3）,等,5,学时）,31,8.,质粒,DNA,的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒,DNA,氯化铯密度梯度离心法,质粒,DNA,纯度高；但周期长，设备要求高，存在溴乙锭污染。,碱裂解法,质粒,DNA,纯度低；优点是快速、操作简便。,沸水浴法,质粒,DNA,纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴之间,5,学时）,32,（,1,）氯化铯密度梯度离心法,用含有,EDTA,的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加,CsCl,和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取,cccDNA,稀释沉淀,cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,ocDNA,：开环,DNA,L-DNA,：线状,DNA,5,学时）,33,（,2,）碱裂解法,用含有,EDTA,的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加,NaOH,和,SDS,的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体,DNA,及大部分蛋白质,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒,DNA,用无,DNase,的,RNase,去除残余的,RNA,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,5,学时）,34,溶液I：调节pH，悬浮菌体，抑制DNase的活性,溶液II：裂解细胞膜（主要是NaOH），临用前配制，SDS是为沉淀染色体DNA作准备,溶液III：中和NaOH，促进SDS沉淀蛋白质和基因组DNA,详见 :/meeting.dxy/77/article/i8082-p2.html,5,学时）,35,5,学时）,36,5,学时）,37,（,3,）沸水浴法,用含有,EDTA,和,Triton X-100,的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,沸水浴40秒,离心，用无菌牙签挑去沉淀物,乙醇或异丙醇沉淀质粒,DNA,5,学时）,38,（二）噬菌体或病毒,DNA,噬菌体（,phage,）或病毒（,virus,）是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得其,DNA,能被开发成为基因工程的载体，因为：,高效率的感染性能，使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能，使外源基因在受体细胞中高效扩增,5,学时）,39,1.,大肠杆菌的,噬菌体,DNA,噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的,“,寄生虫,”,。它本身是一种核蛋白，核心是一段,DNA,，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的,DNA,注入细菌内。,5,学时）,40,(1),噬菌体的生物学特性,l,噬菌体是,大肠杆菌的温和型噬菌体,l,噬菌体由外壳包装蛋白和,l,-DNA,组成,l-,DNA,全长48502个核苷酸,l-,DNA,上至少有61个基因,生物结构,5,学时）,41,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,感染周期,E.coli,吸附,LamB,受体,注入,复制,包装,裂解,5,学时）,42,100个左右的拷贝,体内 包装,野生型,l,-DNA,本身长度为48.5,kb，,包装范围为原,DNA,的75-105%，,即36-51,kb,。,溶原状态,l,噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其,DNA,直接整合到宿主细胞的染色体,DNA,上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种状态称为,溶原状态,。,整合主要由,l,-DNA,上的,cI,和,int,两个基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变,l,-DNA,或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态。,DNA,重组技术一般需要,l,噬菌体进入溶菌状态。,5,学时）,43,噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。,诱导的因素可能很多，实验室常用的是,热诱导,:,某些,噬菌体，在低温时（,30,）保持溶原状态，在高温（,42,）时进入溶菌状态。这些,噬菌体的,cl,基因是温度敏感突变型的，称为,c1,ts,。,cl,ts1857,，可作为组件插入质粒,DNA,内。目的基因插在,cl,ts1857,下游，重组体的目的基因在,42,表达，,30,不表达。这种方法称为,热诱导表达,，使用的是,温敏开关,。,5,学时）,44,（,2,）,DNA,载体的构建,野生型,l,-DNA,包装的上限为,51,kb,，,本身长度为,48.5,kb,，,只有当插入的外源,DNA,片段不大于,2.5,kb,时,，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。,因此需要缩短野生型,l,-DNA,的长度，才能提高装载量。,其实，野生型,l,-DNA,上约有,40-50%,的片段是复制和裂解非必需的。在构建载体时，这些片段可以删除。,根据切除的多少，可将,l,-DNA,分成两大类载体：,插入型载体和取代型载体。,缩短长度,5,学时）,45,插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度,37,kb,插入片段大小,0-14,kb,5,学时）,46,通过特定的酶切位点允许外源,DNA,片段插入的载体称为插入型载体（,insertion vectors,）。,由于,噬菌体对所包装的,DNA,有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入,6 kb,长的外源,DNA,片段，最大,14 kb,。,取代型载体：,必须有外源基因片段的插入,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度,10,kb,（,36-26,）,kb,载体长度,26,kb,插入片段,最大装载长度,25,kb,（,51-26,）,kb,5,学时）,47,插入位点,体外包装,删除重复的酶切位点,野生型的,l,-DNA,链上有5个,Eco,RI,位点和7个,Hin,dIII,位点，不利于重组操作，必须删除多余的酶切位点，每种限制酶只保留1-2个位点。,同时，为了便于各种来源的,DNA,片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。,除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添限制酶位点。,5,学时）,48,加装选择标记,与质粒不同，野生型,l,-DNA,上缺少合适的选择标记，因此,加装,选择标记是,l,-DNA,克隆载体构建的重要内容。,5,学时）,49,Imm,434,标记,imm434,基因编码一种阻止,l,-,噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的,l,-,载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成,浑浊斑,；当外源,DNA,插入到标记基因中，基因灭活，,l,-,重组分子便进入溶菌循环，形成,透明斑,。,lac,Z,标记,lacZ,基因编码,b,-,半乳糖苷酶的,片段，与,b,-,半乳糖苷酶的,片段互补，能催化无色的,X-gal,生成蓝色化合物。当外源基因插入到,lacZ,基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物，形成,白色噬菌斑,；而空载体,l,-DNA,则产生,蓝色噬菌斑,。,X-Gal,：,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-D-,半乳糖苷,是,-,半乳糖苷酶的显色底物,IPTG,：异丙基,-D-,硫代半乳糖苷，半乳糖的类似物，是乳糖操纵子的诱导物。,5,学时）,50,构建琥珀密码子的突变体,琥珀型突变（,sup,),是指由,CAG,（,Gln,）,向,UAG,（,stop,）,的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物,校正,tRNA,能专一性地纠正这一突变。,构建策略：将野生型,l,-DNA,上,D,和,E,两个头部包装蛋白基因序列中的,CAG,密码子突变成,UAG,。,当这种,l,-DNA,进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散。,基因工程实验中使用的受体则是具有,琥珀型突变体校正功能,的菌株。,5,学时）,51,（,3,）,-DNA,载体的主要类型：,插入灭活型载体：,l,gt10,、,l,gt11,取代型载体：,l,EMBL4、Charon,40,5,学时）,52,（,4,）,DNA,重组分子的体外包装,l,-DNA,重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，,方可高效导入受体细胞,。,用于体外包装的蛋白质可直接从感染了,l,噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。,这些包装蛋白通常分为互补的两部分：一部分缺少,E,组份，另一部分则缺少,D,组份。,包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组,l,-DNA,分子混合后，包装才能有效进行。任何一种蛋白包装液被重组,l,-DNA,污染，均不能产生有感染力的噬菌体颗粒，这是基于安全考虑而设计的。,5,学时）,53,（,5,）,DNA,及其重组分子的分离纯化,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期。,加入,噬菌体或重组,噬菌体的悬浮液，37培养1小时。,用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒密度可达10,13,-10,14,/,L，,而大肠杆菌细胞已完全裂解。,超速离心，沉淀噬菌体。,苯酚抽提，释放,-DNA,。,乙醇或异丙醇沉淀,-DNA,。,5,学时）,54,5 kb，相当于核染色体DNA大小的2%，环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。,根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体和取代型载体。,感染寄生缺陷型：防止重组细菌扩散污染（生物武器除外）。,R因子在细胞内的拷贝数：从12个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个/细胞。,该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。,大肠杆菌的噬菌体DNA,5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。,探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选,pUC18/19的正选择标记 lacZ 的显色原理,噬菌体或病毒的上述特性使得其DNA能被开发成为基因工程的载体，因为：,动植物细胞作为受体细胞时，一般选择相应动植物的病毒基因组DNA作为载体。,（,6,）,-DNA,作为载体的特点,l,-DNA,可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌。,l-,DNA,载体的装载能力可达25,kb，,远远大于质粒的装载量。,重组,l,-DNA,分子的筛选较为方便。,重组,l,-DNA,分子的提取较为简便。,l,-DNA,载体适合克隆和扩增外源,DNA,片段，但不适合表达,外源基因,。,5,学时）,55,2.,大肠杆菌的,M13,单链噬菌体,DNA,（,1,）,M13,噬菌体的生物学特性,M13,噬菌体的外型呈丝状,M13,噬菌体由外壳包装蛋白和正链,DNA,组成,M13 DNA,全长6407个核苷酸,M13 DNA,上至少有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M13,噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,5,学时）,56,正链,DNA,（,2,）,M13 DNA,载体的构建,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型,M13 RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13 mp,系列载体,lacZ,polylinker,复制,DNA(replication form DNA,，,RF DNA),5,学时）,57,（,3,）,M13 DNA,载体的特点,使克隆的,DNA,片段以特定单链的形式输出受体细胞外（因为,M13,噬菌体只包装正链），这在,DNA,定向突变中非常有用。,M13,重组分子筛选简便：被,M13,噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成,混浊斑,，易于辨认挑选。,而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大,。,但是，,M13-DNA,载体的最大缺陷是,装载量小,，只有1.5,kb,。,5,学时）,58,动植物细胞作为受体细胞时，一般选择相应动植物的,病,毒基因组,DNA,作为,载体,。,动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：,单链,DNA,病毒,双链,DNA,病毒,单链,RNA,病毒,双链,RNA,病毒,RNA,病毒在自我复制时大多存在相应的,DNA,中间反应物,，这些中间体可作为载体用于,DNA,重组实验。,3.,病毒,DNA,载体,5,学时）,59,（三）考斯质粒,(cosmid),与噬菌粒,(phagemid),l,-DNA,载体和,M13-DNA,载体的装载量最大分别为25,kb,和,1.5,kb,。但在很多情况下，往往需要,克隆更大的外源,DNA,片段，,考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了,进一步提高噬菌体,DNA,的装载量。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体,DNA,的长度，就能同步增加载体的装载能力。,将噬菌体,DNA,上与,包装有关的序列,和质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组,DNA,分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。,注意,：考斯质粒和噬菌粒不携带包装蛋白基因，因此重组,DNA,分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。,5,学时）,60,1.,考斯质粒（,cosmid）,（,1,）考斯质粒载体的构建,考斯质粒是一类人工构建的含有,l,-DNA,cos,序列,和,质粒复制子,的特殊类型的载体。,1978年,Collins,和,Hohn,发明构建,pHC79,6400 bp,Tc,r,l,fragment,cos,ori,Amp,r,Pst,I,Bam,HI,Sal,I,cos,site-carrying plasmid,1.8,kb,的,l,-DNA,片段+,pBR322,片段,装载范围为,3,0-45 kb,pHC79,5,学时）,61,（,2,）考斯质粒载体的特点,能像,l,-DNA,那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45,kb）,且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,5,学时）,62,2.,噬菌粒（,phagemid or phasmid）,（,1,）噬菌粒载体的特点,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体的,包装序列、复制子以及,质粒的复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。,能像,M13-DNA,那样体外包装，并高效转染受体细胞,装载量比常规的,M13 mp,系列载体要大很多（10,kb）,能像质粒那样在受体细胞,中自主复制,重组操作简便，筛选容易,通过克隆双链,DNA,能获得同等长度的单链,DNA,5,学时）,63,（,2,）重要的噬菌粒载体,pUC118,：,pUC18,+,M13,间隔区,IG,pUC119,：,pUC19,+,M13,间隔区,IG,500,个拷贝,3200 bp,MCS,lac,Z,lac,I,ori,Amp,r,M13-IG,pUC118/119,表示,M13,辅助噬菌体：为噬菌粒提供基因,II,产物和包装蛋白，使其能够合成单链,DNA,。,pUC118/119,5,学时）,64,pBluescript,：体外转录载体,pBluescript=pUC,+,f1-,ori,+,P,T3,+,P,T7,2958 bp,MCS,lacZ,P,T7,ori,Amp,r,f1-,ori,pBluescript,P,T3,噬菌体启动子,P,T3,和,P,T7,强化外源基因的转录。,提取出来的单链,DNA,重组分子，在噬菌体,RNA,聚合酶的存在下，可实现外源基因的体外转录。,f1-ori,：线状噬菌体复制起始区,5,学时）,65,（四）人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往,需要,克隆数百,甚至上千,kb,的,DNA,片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的,复制区,、,分配区,、,稳定区,与,质粒,组装在一起，即可构成,染色体载体,。当大片段的外源,DNA,克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能,像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传,。目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人造染色体（,BAC）,酵母人造染色体（,YAC）,5,学时）,66,1.,细菌人造染色体,Bacterial Artificial Chromosome,，,BAC,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌,性因子,F,质粒,的基础上构建的。,装载量：,50,kb,-300,kb,拷贝数：,各种类型的,BAC,在大肠杆菌受体菌中只能维持单一拷贝。,BAC,主要适用于：,克隆大型基因簇（,gene cluster）,构建动植物基因文库（,gene library,）,5,学时）,67,2.,酵母人造染色体,Yeast Artificial Chromosome(YAC),（,1,）酵母人造染色体的组成,pYAC4,CEN4,Eco,RI,URA3,TEL,Bam,HI,TEL,ori,Amp,r,TRP1,ARS1,两个来自嗜热四膜虫的末端重复序列,(,TEL,),：保持重组,YAC,为线状结构,酵母染色体的着丝粒序列,(centromere4,CEN4,),酵母选择标记：,URA3,、,TRP1,大肠杆菌的复制子：,ori,大肠杆菌的选择标记：,Amp,r,YAC,载体的装载量为,350 kb-400 kb,酵母染色体的复制子,(autonomously,replicatingsequence,，,ARS,),5,学时）,68,克隆位点：,Eco,RI,。,该位点位于酵母菌,Sup4 tRNA,基因内。,Sup4,基因编码产物抑制赭色表型,(,成为白色,),。如果用不含外源,DNA,片段的,pYAC4,载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。而带有插入的外源,DNA,片段的,pYAC4,重组载体，其,Sup4,已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。这种插入失活选择标记的应用，大大简化了阳性克隆工作。,（,2,）酵母人造染色体的使用,pYAC4,CEN,Eco,RI,URA,TEL,Bam,HI,TEL,ori,Ap,r,TRP,ARS,Eco,RI,Eco,RI,Eco,RI,Bam,HI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,在利用,pYAC4,载体克隆,DNA,片段时，要将,pYAC4,载体线性化,，分离纯化带有染色体末端序列的两个臂，同时分离纯化大分子,DNA,片段，连接后用于转化酵母菌感受态细胞。,5,学时）,69,Target DNA,5,学时）,70,二、用于基因转移的受体菌或细胞,5,学时）,各种基因工程受体的特性,实验室常用的基因工程受体,受体细胞应具备的条件,71,作为基因工程的受体细胞，,应利于外源,DNA,的转化或转导,，同时又要有,较好的安全性,。,野生型的大肠杆菌并不是理想的受体细胞，因其,自身具有限制和修饰系统,，对未经甲基化处理的外源,DNA,分子有一定的降解作用，导致外源,DNA,的转化或转导效率低下。,此外，野生型大肠杆菌对其他生物种群可能存在,潜在的致病性,。,因此必须通过适当的诱变手段,对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造,，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株。,5,学时）,72,（一）受体细胞应具备的条件,限制性缺陷型：,外切酶和内切酶活性缺陷（,hsd,R,-,）,重组整合缺陷型：,用于基因扩增或高效表达的受体细胞,（,recA,-,，,recB,-,，,recC,-,）,具有较高的转化效率,具有与载体选择标记互补的表型,感染寄生缺陷型：,防止重组细菌扩散污染（生物武器除外）。,5,学时）,73,限制与修饰系统,限制与修饰系统是维持野生型细菌种属特异性的保护系统，其限制与修饰作用分别由限制性核酸内切酶和修饰甲基化酶来完成。当外源,DNA,分子进入细菌细胞内部时，限制系统产生限制作用，将来自不同生物的外源,DNA,分子或重组,DNA,分子降解破坏。而对于自身,DNA,分子则由修饰系统加以甲基化修饰，免于限制系统的限制作用。这是导致外源重组,DNA,转化或转导效率低下的,主要原因之一,。,应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞，以提高外源,DNA,分子的转化或转导效率。,大肠杆菌的限制系统主要由,hsdR,基因控制，因