微生物-10-2、3第十章-微生物的遗传变异和育种.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二节 基因突变与自然选育,突变是工业微生物产生变种的根源，是育种的基础，但也是菌种发生退化的主要原因。,突变,泛指微生物细胞内遗传物质的结构或数量突然发生的可遗传的变化。,基因突变的特点：自发性、不对应性、稀有性、独立性、可诱变性、稳定性、可逆性。,一、突变,1.突变包含,狭义,的突变和,广义,的突变。,狭义的突变专指基因突变，也称,点突变,，涉及一对或少数几对核苷酸的增加、减少或取代。,同义突变：,突变后密码子编码的仍是同一种氨基酸；,错义突变：,编码另外一种氨基酸；,无义突变：,突变后为终止密码；,移码突变：,突变点后遗传密码的阅读框架发生移动。,1.自然选育的概念,自然选育：,在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的,自然突变,(Spontaneous Mutation),而进行的菌种筛选过程，又叫自然分离。,二、自然选育,自然突变的原因：,（1）多因素低剂量的诱变效应,由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如充斥空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的低浓度诱变物质、微生物自身代谢产生的诱变物质如H,2,O,2,等的作用。,（2）互变异构效应,胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)的第六位上可以,酮式或烯醇式,出现，胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)第六位可以,氨基式或亚氨基式,出现，平衡一般倾向于,酮式和氨基式,，但在偶然情况下，会出现稀有的烯醇式和亚氨基式，使DNA双链结构中常出现的AT和GC碱基对变成GT和AC，发生突变，几率约为10,-8,10,-9,。,2.自然选育的目的,发酵工业使用的,生产菌株,，几乎都是经过人工诱变处理后获得突变株，遗传特性往往不够稳定，,容易继续发生变异,，变异的方向一个是菌种衰退，造成发酵产量的降低，另一个是菌种变异获得优良性状，使发酵产量提高。经常进行,自然选育工作，可以淘汰衰退的菌株，保存优良的菌株，稳定和提高发酵产量,。,3.自然选育的一般程序：,采用单菌落分离法,单细胞或单孢子悬浮液要求有良好的分散度：,细菌应转种到新鲜肉汤液体中培养，取得分散的菌体,放线菌或霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振荡打散孢子后在过滤,对粘性大的孢子，可以加入0.05%的分散剂(如Tween 80，一种非离子活性剂),4.自然选育的特点,简单易行；,效率低、进展慢、难以使生产水平大幅度提高，需要与诱变育种结合交替使用。,第三节 突变的诱发与微生物诱变育种,微生物育种过程分为,三个阶段,：菌种基因型改变筛选菌种，确认并分离出具有目的基因型或表型的变异株产量评估，全面考察变异株在工业化生产上的接受性。,一、突变诱发过程,从诱变剂进入细胞到突变型出现的整个过程都会有一些因素,影响突变的诱发,。,1 诱变剂接触DNA分子前,2 DNA损伤的修复,五种修复方式,：,光复活作用；切补修复；重组修复；SOS修复系统；DNA多聚酶的校正作用。,（D）SOS修复系统,这是一种能够造成误差修复的“呼救信号”修复系统。当DNA受到诱变剂损伤而阻断DNA复制过程时，,DNA损伤相当于一个呼救信号，促使细胞中的有关酶系解除阻遏，而进行DNA的修复。,在修复过程中，DNA多聚酶,在无模板的情况下,进行DNA的修复,（E）DNA多聚酶的校正作用,除了上述种种修复作用以外，细胞还具有对复制过程中出现的差错加以校正的功能。大肠杆菌中的DNA复制依赖于三种DNA多聚酶的作用，,这三种酶除了对于多核苷酸的多聚作用以外，还具有3到5核酸外切酶的作用。,一般认为依靠DNA多聚酶的这一作用，,能在复制过程中随时切除不正常的核苷酸。,如果DNA多聚酶发生突变而使其核酸外切酶活性减弱，那么它切除不正常核苷酸的能力减弱，菌体的突变率相应地提高，成为,增变突变型,，DNA多聚酶为DNA修复作用所必需，所以增变突变型对于诱变剂的作用格外敏感。,3 从前突变到突变,诱变剂造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为,前突变,。前突变可以通过影响DNA复制而成为,真正的突变,，也可以经过修复,不发生突变。,一般认为,光复活作用、切补修复和DNA多聚酶的校正作用具有校正功能而不利于突变,的诱发，而,重组修复和SOS修复系统具有引起差错的性质而有利于突变,的发生。,一切影响DNA修复系统中酶活性以及与突变相关的酶活性的因素都能影响由,前突变向突变的转变。,例如：咖啡碱能抑制切补修复系统，从而增强诱变作用；SOS修复系统和重组修复依赖于蛋白质合成，因而利于蛋白质合成的因素有利于提高突变率；Ba,2+,（,钡）,通过对DNA多聚酶的3核酸外切酶活性的抑制提高突变率。,4 从突变到突变型,表型的改变落后于基因型改变的现象称为,表型延迟,。,分离性延迟和生理性延迟,分离性延迟：,经诱变后，细胞中野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中，突变型基因由于,属于隐性基因而没有表达,，需要经过复制、分离，在细胞中只有突变型基因，没有野生型基因时，其性状才得到表达。,生理性延迟：,在突变基因已经为纯的状态后，突变表型还不一定出现，必须等到,原有基因的产物稀释到某一程度才表现出来，,而这些原有基因产物的浓度降低到能改变表型的临界水平前，细胞已经分裂多次，经过多个世代。（如噬菌体菌株的表达会出现）,二、诱变育种的方案设计,诱变育种包括,三个环节,：,突变的诱发、突变株的筛选、突变高产基因的表现,，根据这三个环节进行方案设计。,制定筛选目标,对于随机,出现的多种变异性状，筛选的目标除了要求高产量之外，还应从生产的角度考虑其它,有利性状,如：,生长速度快、产孢子多；消除某些色素或无益组分等。,但是所定的筛选目标不可太多。,工作量大，考虑实现目标的可能性。,诱变育种的步骤和方法,包括：出发菌株的选择，菌悬液的制备，诱变剂及诱变剂量的选择，诱变的处理方式方法，纯化分离等。,三、诱变育种的步骤与方法,（一）出发菌株,出发菌株的选择是决定诱变效果的重要环节。,对菌种的,遗传背景、稳定性、纯一性以及形态、生理、生化等特性研究,，都有利于提高诱变效果。,2 出发菌株的纯化,确定诱变出发菌株之后，就要进行纯化。,纯种分离方法，常用,划线分离法,和,稀释分离法,。,采用显微操纵仪分离单个孢子，培养形成单菌落，这样可以得到完全真实的纯菌株。,稀释平板分离法,：倾注平板法和涂布平板法。,基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程,涂布,倾注,梯 度 稀 释 过 程,10,-1,10,-2,10,-3,10,-4,10,-5,10,-6,（二）单孢子悬浮液的制备,供试细胞,在生理活性方面既要同步，又要处在最旺盛的对数期。,菌悬液中的菌体应该是,单细胞或单核的孢子。,生理盐水或缓冲液配制。,（三）诱变剂,其他诱变剂,诱变剂,物理因素,化学因素,紫外线,激光,离子束,X射线,r射线,快中子,与碱基反应的物质,碱基类似物,改变DNA结构的物质,烷化剂,亚硝酸类,吖啶,类,“生物化学统一性”法则：,人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。,诱变剂的共性原则：,化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比,超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用,90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用,（四）影响突变率的因素,a.菌种的生理状态与诱变效果有密切关系,b.诱变前后的培养条件对诱变效果有明显影响,c.其他外界条件,如温度、氧气、pH、可见光等对诱变也有影响,（五）突变株的筛选,菌体细胞经诱变处理后，要从大量的变异菌株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来，需要明确的筛选目标和筛选方法。,育种工作中常用随机筛选和理性筛选这两种方法。,1 随机筛选,随机筛选即菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选菌落，从中筛选出高产菌株。,a.摇瓶筛选法,b.琼脂块筛选法,c.筛选自动化和筛选工具微型化。,2 理性化筛选,由于诱变后出现正突变株的几率小，用随机筛选的方法要耗费大量的人力物力，因而筛选方法逐渐转向理性化筛选。,理性化筛选：,运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的,生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构,来进行设计和采用的一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高突变菌株。,2.1 初级代谢产物高产菌株的筛选,a.降低终产物浓度,筛选终产物营养缺陷型；筛选细胞膜透性改变的突变株；,b.筛选抗反馈突变菌株,筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株；,2.2次级代谢产物高产菌株的筛选(主要是抗生素),a.利用营养缺陷型筛选,b.筛选负变株的回复突变株,c.筛选去磷酸盐调节突变株,d.筛选去碳源分解代谢调节突变株,e.筛选氨基酸结构类似物抗性突变株,f.筛选二价金属离子抗性突变株,g.筛选前体或前体结构类似物抗性突变株,h.筛选自身所产的抗生素抗性突变株,2.3 根据菌株其它生理特性的筛选,用于菌株理性化筛选的除了代谢产物高产菌株的筛选，根据制定的筛选目标，还有其它类型的突变株，包括组成性突变株、,消除无益组分的突变株、能有效利用廉价的发酵原材料的突变株、,细胞形态改变利于分离提取工艺的突变株、,抗噬菌体突变株,等等。这些筛选目标虽然不直接以产量为目标，但它们所具备的优良特性往往能导致产量的提高。,营养缺陷型突变株的筛选方法,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养,（抗生素法）,（菌丝过滤法）,夹层培养法,限量补充培养法,逐个检出法,影印平板法,生长谱法,（六）菌种特性研究,高产菌株选育之后，为了推广到大生产中去，需要研究,菌种的纯度、遗传稳定性、菌落类型、群体的形态、生活能力、产孢子多少，保藏培养基及保藏方法；研究菌种碳、氮源利用情况、菌丝生长速度、菌丝量、发酵液粘度、过滤难易状况；还要注意考察菌种抗生素的组分变化，色素等其他质量问题；还要研究最适移种期、移种量、通气搅拌、温度、pH,等等。对于这些重要发酵条件，一般在小型发酵罐和发酵罐之间摸索其间的相关性，为工业化生产提供更为接近的发酵条件。,The end!,Thanks!,