噬菌体展示技术的原理及应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,噬菌体展示技术的原理及应用,一,、噬菌体展示技术的原理,Lead,Hv,Link,Lv,E,PIII,融合蛋白,PIII,基因型,表达型,噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。,选择方法：,淘选（Panning),而不是,筛选（Screening),非展示系统 展示系统,Solid phase selection with immunotubes,B,B,B,B,B,B,v,v,Immunotube,coated with,antigen,coated with,steptavidin and,biotinylated antigen,B,biotin,antigen,Solution phase selection with biotinylated antigen,Bind to Streptavidin,coated microtitre wells,Wash to remove unbound phage particles.,Elute bound phage,Amplify eluted phage,Repeat selection,Analyze,a)ELISA,b)Specificity,c)Sequencing,d)Affinity,e)Activity,E.coli,感染,和扩增,固相,淘选系统 完整细胞,组织，器官,常规法,淘选方法 正负法,竞争法,噬菌体展示技术最关键的优势有三：,第一，淘选的高效率使得在极低的存在 水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；,第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；,第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。,噬菌体（M13,T7,T4,),病毒（反转录病毒，杆状病毒）,表面展示系统 细菌（葡萄球菌，E.Coli),酵母,体外共价连接（蛋白DNA,蛋白RNA),诊断,被动免疫,抗体 蛋白质结构分析,药物导航,蛋白质纯化,应用范围：,受体配体,信息传递,蛋白质蛋白质 诘抗剂,蛋白质DNA 抑制剂,蛋白质其他,多肽 诊断,基因表达控制,中和活力,药物及药物导航,酶及底物,噬菌体抗体库的构建,Antibody IgG structure,Antibody IgG structure,C,L,V,L,V,H,C,H,1,V,L,C,L,V,H,C,H,1,C,H,2,C,H,2,C,H,3,C,H,3,Antibody IgG structure,V,H,V,L,C,L,C,H1,C,H2,C,H3,Hinge,(Fab),2,Fab,Fc,Membrane,Extension,Antibody IgG structure,V,H,V,L,C,L,C,H1,C,H2,C,H3,Antibody IgG structure,V,H,V,L,C,L,C,H1,C,H2,C,H3,Fv,Fv,V,H,V,L,sc,Fv,V,H,V,L,Single Chain Fragment variable,单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术,宿主细胞:杂交瘤 细菌,筛选范围:10,3,10,7,10,9,时间:几个月 几周,操作:繁杂 相对简单,免疫:必须 可避免,人源抗体:+,费用:高 低,生产量:有限 无限,基因获取:再克隆 直接,应用前景:有限 不可估,二、噬菌体展示技术的应用现状,抗体,：,抗狂犬病毒的单链抗体,，抗,HIV-1,囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被,HIV-1,感染并表达有,gp120,的淋巴细胞,中和响尾蛇毒素的单链抗,，,等等,。,疫苗：,展示在噬菌体表面的,HIV-1,的,gp120-V3,环 可象天然抗原一样引起显著的免疫应答,等等。,3.多肽类药物：,如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒-bungarotoxin；从CX,7,C 多肽库中掏选到一个多肽能与 Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性；等等。,肿瘤药物导航载体：,用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药物的定向输送工具。一个成功的实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的特异性亲和力。将此多肽与细胞毒素,doxorubicin,偶联。结果显示，此偶联物具有更强的抑制肿瘤的效果,.,5,.,酶,：,例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等,底物与抑制剂,：,主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。,信息传递研究,:,利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶,、,黑皮质素受体、,CD80,和一个,Hantaviral,受体；受体的配体，如血管促生素,、,-bungarotoxin,，,和一些大蛋白分子中的折叠区域，如,SH2,、,SH3,和,WW,区域,。,从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽,因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白,。,8.DNA结合蛋白,：,锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干扰病毒感染生活周期。,1,9.蛋白质组学,：,噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文库的滴度可达10,12,。蛋白质组学的基本点就是利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术正好能符合这种要求。例：将噬菌体展示cDNA 文库制成蛋白点阵，成功的应用于寻找与过敏症有关的蛋白质。,疾病的发生给我国水产养殖业带来了巨大的经济损失。而疾病防治技术的开发仍远远不能满足渔业发展的要求。,我国水产病害的防治目前主要以抗生素及各种消毒化学品为主。,寻找新的病害防治途径。,三、噬菌体展示技术应用于水产养殖业,5.展望,九十年代末，生物技术、基因和蛋白质、生物信息和分子文库系统的发展，大大促进了新药发现的技术革命，其中噬菌体展示技术表现出独特的优越性，由此而发展出的一些新方法更是大大的扩展了新药的发现和利用范围,。,随着噬菌体展示技术在寻找新药道路上的不断成功，这种方法不仅限于人类医药的发现，也可以用于植物病虫害的防治，畜牧业病害的防治以及水产养殖业病害的防治，特别是在水产养殖业中，可避免滥用抗生素和化学药品，防止水体进一步地污染。,很明显，噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其有特异结合力的多肽和蛋白，这将极大地促进生物学和医学研究，,因为蛋白质与其它分子的结合和相互作用是生命现象的主要过程。,随着该技术的不断发展和创新，所获得的信息越来越多，如果能与生物芯片技术以及生物信息技术结合起来，其应用范围和能力将会得到更大的发展。,结合水生所的发展方向，我认为噬菌体展示技术可以作为一个技术平台应用于如下几个研究领域：,1.水体有毒化合物的检测以及水生动,物,DNA,损伤和修复的机理的研究。,2.重要养殖水生动物病原体的抗体制,备以及免疫机制的研究。,3.,细胞发育及分化的研究。,思考题：,1、噬菌体展示技术的优点是什么？其技术,核心是什么？,2、试论噬菌体展示技术应用于您将从事的,研究领域或你们研究所研究领域的可能,性。,谢谢！,