实用细胞培养技术.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实用细胞培养技术,在细胞培养中注意的一些问题,细胞培养的实验程序,细胞的复苏,细胞的计数,细胞(贴壁)的传代培养,细胞的冻存,悬浮细胞的培养方法,在细胞培养中注意的一些问题,环 境,由于体外培养细胞没有抗感染能力，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致污染。因而，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠，特别是实验环境更为重要。,1.培养室和超净台的消毒,培养室,无菌培养室每天都要用速消净或0.2的新洁而灭（苯扎溴铵）拖洗地面一次（拖布要专用），紫外线照射消毒3050min。,超净工作台 台面每次实验前要用 75酒精擦洗，然后紫外线消毒30 min。消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果。一些操作用具如移液器、废液缸。污物盒、试管架等用75酒精擦洗后置于台内同时紫外线照射消毒。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线。,2.培养前准备,在开始实验前要制定好详细的实验计划和操作程序，有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置到培养室、超净台内，然后开始消毒。这样可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。,3.培养条件,气体环境：95空气加5CO,2,混和气体,环境中。,PH值：7.27.4,温度：37,培养实验用品的前期处理,1.清洗和浸泡:,(1),玻璃器皿:,新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质，使用前必须彻底清洗。首先用自来水初步刷洗，5稀盐酸溶液中浸泡过夜。然后用流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。,（2)塑料器皿:,塑料器皿经冲净后，晾干，用2NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，5盐酸浸泡30min，流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。针头式滤器不能泡酸液,用2NaOH泡612小时,或者煮沸20分钟,常规冲洗干净，烘干（60以下）备用。使用前要包装，首先要装好滤膜，安装时注意光面朝上(凹向上)，然后用注射器回抽注入检查膜是否破损，安装好膜后将螺旋稍微,拧松一些，放入铝盒内（或用牛皮纸包装）外层用纸包装备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧；胶塞的处理：按常规冲洗干净烘干后，用2氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞要置入单蒸水中浸泡，再用沸水处理30钟），自来水洗净，烘干然后再泡入1稀盐酸液中30分钟，用自来水彻底冲洗3-5遍，蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸漂洗2遍，烘干备用。,2.包装：,在消毒前必须进行严格包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等。,3.消毒:,在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）和无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品被污染）来完成。,（1）消毒灭菌的方法,:,物理方法:湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线照射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物.,化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。,(2)消毒灭菌的时间：,干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到 160，保持90120 min方能杀死芽孢。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。,湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒，要求是：,不能装太满，保持消毒器内气体流通。,在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出。关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。,一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是 15磅20 min；常规使用液体：消毒 15磅 15 min。橡胶和塑料用品：如滤器、EP管、离心管等高压10磅15 min。,紫外线消毒：,主要用于实验室房间里的空气、操作 台表面及桌椅等消毒。时间为30min2h左右。,过滤除菌消毒：,适用于组织细胞培养使用的液体 如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。,4.细胞培养用液及培养基（液）:,（1）水：,双蒸水、三蒸水，可高压除菌。,（2）平衡盐溶液（PBS)：,PH为7.27.4，不含钙镁离子，可高压除菌。,（3）消化液：,胰蛋白酶液：,常用胰蛋白酶的浓度为025，pH值7.2左右。需过滤除菌。,EDTA液：,常用浓度为 002，配制时采用无Ca,2+,、Mg,2+,平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。,胰蛋白酶EDTANa2:,需过滤除菌。胰蛋白酶和EDTANa,2,联合使用可提高消化率，但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。,胶原酶：,适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。可用BSS或含血清的培养液配制，这样实验操作简便同时提高细胞成活率。,但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。胶原酶的常用剂量为 200 Uml（约为 lmgml）或 00303。,(4)培养基（液）过滤除菌,常用022pm微孔滤膜。,（4）,l640培养液(常用)（5）DMEM、F12培养液（6）Ham培养液,(无血清培养中常用的基础培养基),（7）Hepes：,具有较强的缓冲能力，能常时间恒定缓冲液的PH值。使用浓度可根据缓冲要求而定。,（8）3%L-谷氨酰胺：,可作为细胞能量来源，使用量1。但其在溶液中极不稳定，需重新加入。,（9）丙酮酸钠、葡萄糖：,是属碳水化合物的成分，是细胞生命的能量来源。,（10）抗生素：,最终浓度为青霉素 100 Uml，链霉素100Uml（青霉素为80万U瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml；链霉素为100万U瓶，将其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。,（11）细胞生长液：,是用以维持细胞生长增殖的液体。其是配方：基础培养基 8090 血清 1020 双抗 100u/ml,（12）细胞维持液：,用以维持细胞缓慢生长或不死的培养液。其是配方：基础培养基 95 血清 25 双抗100u/ml,（13）冻存液：,其是配方：,10DMSO,40小牛血清（30FBS）,1的5.6NaHCO,3,1双抗,48（58）基础培养液。,（14）MEM培养液:,其是配方：63%MEM液 20的乳蛋白水解物 10的小牛血清 1的双抗（P、S）用5.6NaHCO,3,溶液调pH至7.27.4。,细胞培养的实验程序,细胞培养,动物组织原代培养 细胞株的体外培养,血管、骨髓、羊水、胸水、腹水内 细胞株贮存在液氮灌或80,细胞及皮肤、粘膜、神经、胚胎、以下的低温冰箱中,肿瘤等组织,分离,复苏,组织切成1cm,3,小块，方法根据样本而异。细胞复苏时速度要快，立即放入,有机械分散法、剪切分离法、消化分离法 37 水浴箱中充分溶解，立即,（胰酶消化分离法、胶原酶法）离心500 1000r/min1 2min，,弃掉上清液。,获得细胞悬液种入 接种入瓶中培养,培养瓶中培养,37培养箱（或5%CO,2,培养箱）中培养,24小时后换液,去处对细胞生长有毒物质，如DMSO、细胞组织残渣、细胞代谢产物,贴壁细胞,悬浮细胞,直接去掉上清液 离心去掉上清液，必要时做细胞饲养层以净化细胞,传代,细胞生长,80,以上覆盖培养瓶底，根据细胞生长周期不同而异，,23天或1周左右一代,贴壁细胞 悬浮细胞,.,消化法，用胰酶EDTANa2消化，直接吹打或离心法、自然沉淀法，,时间根据细胞而定 吸一半液到另一瓶,冻存,冻存程序,细胞冻存管写好标签：细胞名称，时间及保存人。,取对数生长期的细胞（25 1O,5,cellsml），收集细胞前24h换液；,吸出培养液，用PBS洗细胞一次，除去，加入消化液胰蛋白酶EDTANa,2,（消化时间根据细胞而定），去掉消化液，加入培养液充分混匀，1000rp离心1min,去掉上清液；,重悬浮于冻存液中，大约15 10,6,cellsml；,每个冻存管中加入lml细胞悬浮液，拧紧盖子。,冷冻细胞应缓慢降温，可用装有异丙醇的冷冻盒30min 1h后,再放入-20,0,C冰箱中2h左右，然后转至-80,0,C冰箱，可保存数月，如需长期保存，应在-80,0,C冰箱中放3h 8h后转至液氮中。,细胞计数,一、原理,细胞计数结果以细胞数/毫升表示。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做,细胞活力,，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。,用台盼（酚）兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。,二、仪器、用品与试剂,1、仪器与用品：,普通显微镜、血球计数板、EP管、毛细吸管等。,2、试剂,：,SP20细胞、0.4台盼（酚）兰其配方是：台盼（酚）兰 0.4g加双蒸水100ml等。,3、材料：,细胞悬液,细胞悬液的制备：,用毛吸管吸5滴细胞悬液到EP管中，加入1滴0.4台盼蓝染液或苯胺黑，混匀，静置23min,活细胞不会被染色，而死细胞着蓝色，这样加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。,三、,操作步骤,1、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。,2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。,3、静置3分钟。,4、镜下观察，计算计数板四个大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：,（细胞悬液的细胞数）/ml（四个大格子细胞数/4)稀释倍数,10,4,/ml,四、细胞计数要点：,1.要求悬液中细胞数目不低于10,4,个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；,2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。,3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以求计数准确；,4.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让,悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。,5,.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚,集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格,线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不,计右线。,体外细胞的复苏与培养,概述,复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。,用品和试剂,培养液、吸管、离心管、培养瓶、,CHO,/Hela细胞等。,操作步骤,（图）,注 意,存取冻存管时都要佩戴防护眼镜和手套，冻存管投入存放温水的器皿中后应立即把盖子扣上，以防发生意外。,离心后上清夜一定要吸干净，以免因DSMO的毒性造成细胞活力下降而难以复活。,细胞传代培养,一、原理,在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和（细胞增值达到一定密度后），为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。,二、材料和试剂,细胞：贴壁细胞株,CHO,试剂：0.25胰酶、1640培养基（含10小牛血清）。,仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等。,三、操作步骤,将,长满,细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。,加入0.51ml 0.25胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。,瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底,发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为13分钟。,用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶盖），置37下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。,四、注意事项,形成的单层细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被覆盖时要立即进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。,传代时不同的细胞消化时间不同，因而要根据需要注意观察及时进行处理。以免因消化过头而产生过多的细胞碎片，影响细胞生长。,吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤。,防止由于培养细胞污染等因素造成细胞系的绝种,，要及时冻存细胞。,细胞档案要记录好，如组织来源，生物学特性，培养液要求、传代、换液时间和规律，细胞的遗传学标志，生长形态，常规病理染色的标本等。,附1,1640基础培养基配置方法:,1640粉 10.4g,Hepes 2.38g,葡萄糖,2.5g,丙酮酸钠,110mg NaHCO,3,2g,双（三）蒸水加至1000ml,附2：,消化液配制方法：,称取0.25g胰酶蛋白酶（活力为1：250），加,100ml无Ca,2+,、Mg,2+,的Hanks液(或PBS液)溶解，,滤器过滤除用前可在37下回温。胰酶溶液中,也可加入EDTANa,2,，使最终浓度达0.02。,细胞的冻存,一、概述,冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水,部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性，引起细胞能量代谢的障碍。,细胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损伤部分。如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞的死亡。因此在细胞冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。,目前多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂。这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高胞膜对水的通透性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成所造成的细胞损伤。这样可以最大限度的保存细胞活力。,二、用品和试剂,0.25胰蛋白酶。,含1020(胎牛)血清培养液。,吸管、离心管、2ml冻存管（如质量不好，有时密封不严，使用时炸裂；因而使用前要仔细检查）。,酒精灯（或其他安瓶封口设备）、封口胶等。,冻存液,:,DMSO液：10DMSO 1双抗（过滤）40小牛血清（30FBS）48（58）基础培养液(无菌)1的5.6NaHCO,3,(无菌)无色新鲜甘油（1磅蒸汽高压消毒）,三、操作步骤,（图）,（1）取生长状态好的细胞即选择对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存。,（2）离心洗涤 用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管加入基础培养液并计数，离心 1000 rpmmin2 min。去除胰蛋白酶及旧的培养液。,（3）加含10DMSO冻存液 加入配制好的冻存培养液（含10DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为15 10,6,ml左右。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管或安瓶中，每只安瓶或冻存管加液l15ml。,（4）冻存管用封口胶膜封口，同时注意冻存管必须旋紧确保密封。冻存管上应写明细胞的名称、冻存时间等信息。装入已做标记的小袋或支架同时作好记录。(5）封好的冻存管即可直接冻存 标准的冻存程序为降温速率l2min；当温度达25以下时，可增至510min；到100时，则可迅速浸入液氮中。,要适当掌握降温速度。各种细胞对冷冻的耐受性不同，一般来讲上皮细胞和成纤维细胞耐受性大；骨髓细胞差一些，以不超过23min合适；而胚胎细胞耐受性最小。总之，在开始时温度下降速度不能超过10min。,要精确控制冷冻速度需要细胞冻存器，如无此设,备一般可以采用以下的冻存方法来控制冷冻速,率：,首先将冻存管直立放置于塑料盒内，置4冰箱,中23h,然后再放入-20冰箱中23h,最后置,70冰箱中，经过2h 8h左右后，取出冻存,管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操,作以免冻伤。,（6）,记录,PC-3,ECV,LNCaP,LNCaP,CHO,80以上,sp20,HL-60,HL-60,悬浮细胞的传代培养,一、材料和试剂,HL-60细胞,、,SP20细胞,RPMI1640生长液,培养瓶、无菌吸液管（5ml、1ml）、弯头,毛细滴管、废液缸等,二、操作步骤,选生长良好的HL-60细胞一瓶 轻轻加入等量的生长液。,用无菌吸液管轻轻吹打，使HL-60细胞均匀悬浮 然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养瓶中。,375CO2孵箱中培养2448h。,如果细胞比较浓，可按1:3分配传代培养。,4,2 3h,冰箱,弃上清,混匀,HeLa,4,