第19章--核酸和蛋白质的生物合成.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,遗传信息传递的中心法则,转录,翻译,复制,逆转录,RNA,复制,蛋白质,基因就是指,DNA,中能编码蛋白质和功能,RNA,的特定核苷酸序列。,DNA,RNA,*,DNA,通过基因表达，决定了蛋白质的结构、功能,*,DNA,通过复制，将基因信息代代相传,*,RNA,参与,DNA,遗传信息的表达,*,RNA,也可作为某些病毒遗传信息的载体,第一节,DNA,的生物合成,复制的基本规律,复制的酶学和拓扑学变化,DNA,生物合成过程,逆转录和其他复制方式,DNA,损伤,（,突变）与修复,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,C,C,A,C,T,G,G,G,G,T,G,A,C,C,A,G,G,T,A,C,T,G,T,C,C,A,T,G,A,C,T,C,C,A,T,G,A,C,A,G,G,T,A,C,T,G,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,+,母链,DNA,复制过程中形成的复制叉,子代,DNA,2.,半保留复制的实验依据,二,2.,半保留复制的意义,1,、使亲代,DNA,所含的信息以极高的准确度传递给子代,DNA,分子。,2,、,DNA,通过复制和基因表达这两种主要功能，决定了生物的特性和类型并体现了遗传过程的,相对保守性,。,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但,不是绝对的。,（,二,）,双向复制,1.,双向复制的定义,复制时，,DNA,从,起始点（,origin）,向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为,双向复制,（,bidirectional replication）,。,复制中的放射自显影图象,3.,真核生物的双向复制,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。,习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个,复制子,(replicon),。,复制子是独立完成复制的功能单位。,（,三,）,复制的半不连续性,DNA,合成的方向只能是,53,。,在,DNA,复制时，,1,条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可以连续复制，叫作,前导链,（,leading strand）；,而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段（,冈崎片段）,合成，称之为,滞后链,（,lagging strand）。,前导链,连续复制而,滞后链,不连续复制，就是复制的,半不连续复制,。,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,领头链,(leading strand),随从链,(lagging strand),（,四,）,复制的高保真性,DNA,复制的精确度极高，误差率很低，以保证物种在维持遗传保守性的同时，还要通过变异不断进化。,DNA,复制的高度忠实性至少要依赖三种机制：,1,、遵守严格的碱基配对规律；,2,、,DNA,聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；,3,、复制出错时，,DNA,聚合酶的即时校读功能。,复制的保真性和碱基选择,DNA,聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。,二、复制的酶学和拓扑学变化,（一）复制的化学反应,1.,复制的反应体系,（1）,底物：四种,dNTP：,dATP、dTTP、,dGTP、dCTP,（2）,聚合酶：依赖,DNA,的,DNA,聚合酶，,DNA-pol；,（3）,模板：指解开成单链的,DNA,母链；,（4）,引物：提供,3,OH,末端，使,dNP,可以依,次聚合；,（5）,其他酶和蛋白质因子。,2,复制的化学反应,在聚合酶的作用下，一个核苷酸,5-P,和相邻的核苷酸上核糖的,3-OH,生成磷酸二酯键而逐一聚合的形成多核苷酸链。,（,dNMP）,n,dNTP（dNMP）,n+l,ppi,DNA,链生成过程，,DNA,新链生成需,引物,和,模板,；只能从,5-,端向,3,-,端延长。,(dNMP),n,+,dNTP (dNMP),n+1,+,PPi,复制的化学反应,（,二,）,参与复制的主要酶类,DNA,聚合酶,解链解旋酶,引物酶,DNA,连接酶,1.DNA,聚合酶,全称：依赖,DNA,的,DNA,聚合酶（,DDDP）,缩写：,DNApol,活性：,1.5,3,的聚合活性,2.,核酸外切酶活性,5 A G C T T C A G G A T A,3,|,3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5,3,5,外切酶活性,5,3,外切酶活性,?,能切除,RNA,引物和突变的,DNA,片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,（1）,原核生物的,DNA,聚合酶,DNA-pol I,DNA-pol II,DNA-pol,DNA,聚合酶,结构特点,单一多肽链，从,N,端到,C,端有,3,个酶促活性结构域依次排列：,53,外切酶、,35,外切酶和,DNA,聚合酶。,DNA Pol I,在蛋白酶的作用下，可分为大、小两个片段。小片段具有,5,3,外切酶活性。大片段（又称为,Klenow,片段,）具有聚合酶活性及,35,外切酶活性，它对核酸技术十分有用。,323,个氨基酸,小片段,5,核酸外切酶活性,大片段,/Klenow,片段,604,个氨基酸,DNA,聚合酶活性,5,核酸外切酶活性,N,端,C,端,木瓜蛋白酶,DNA-pol ,Klenow,片段是实验室合成,DNA,，,进行分子生物学研究中常用的工具酶。,1,）,53,聚合酶的活性：对复制和修复中出现的空隙进行填补。,2,）,35,外切酶活性：对复制中错误进行即时校读，保证复制的准确性。,3,）,53,外切酶活性：可去除,RNA,引物和突变碱基。,DNA-pol I,在活细胞内的功能,DNA-pol II,53,聚合酶活性,35,外切酶活性,无,53,外切酶活性,它只是在无,pol I,及,pol,的情况下才起作用，其真正的功能也未完全清楚，可能在,损伤修复中有特殊作用。,DNA pol-,结构特点,由,10,种亚基（,）,组成不对称异源二聚体。,核心酶（,）,亚基：,53,聚合酶活性,亚基：,3 5,外切酶活性和碱基选择功能，,是复制保真性所必需,亚基,:,可能起组装作用,亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动,复合物：促进全酶组装至模板及增强核心,酶活性,DNA-pol ,(250kD),53,聚合酶的活性：,是在复制延长中真正催化新链核苷酸聚合的酶。,35,外切酶活性：,对复制中错误进行即时校读，保证复制的准确性,。,DNA-pol,在活细胞内的功能,催化,DNA,聚合,参与,DNA,损伤的应急状态修复,修复合成、切除引物、填补空隙,功能,20,40,400,分子数,/,细胞,10,1,1,亚基数,+,5,外切酶活性,+,+,+,5,外切酶活性,+,+,+,5,聚合酶活性,pol III,pol II,pol I,E.Coli,中的,DNA,聚合酶,（2）,真核生物的,DNA,聚合酶,DNApol，。,DNApo1,：,延长领头链和随从链；,DNApoI,：,合成,RNA,引物；,DNApol,：,校读、修复和填补缺口。,DNApol,：,在没有其他,DNApol,时,发挥催化功能。,DNApo1,：,催化线粒体,DNA,真核生物的,DNA,聚合酶,真核生物的,DNA,聚合酶,2,.,与复制起始及解链解旋相关的酶类,在复制起始时需要多种酶和蛋白因子，共同起解开、理顺,DNA,链，维持,DNA,在一段时间内处于单链状态的作用。,DnaA,蛋白,DnaA,蛋白是由相同亚基组成的四聚体。,复制起始时，,DnaA,蛋白辨认并结合,E.coli,上,复制起始点,oriC,，,1020,个,DnaA,蛋白相互靠近形成,DNA,蛋白质复合体结构，促使,oriC,局部解链,（,2,）,DnaB,蛋白,解螺旋酶、复制蛋白,rep,，,利用,ATP,供能，作用于氢键，使,DNA,双链解开成为两条单链。,Dna B,Dna C,解链方向,DnaC,蛋白,Dna C,蛋白的作用是将具有解链酶活性的,Dna B,蛋白运送到复制模板，并协同,Dna B,蛋白的作用,GATCTNTTNTTT,TTATCCACA,解链过程中，,DNA,分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。,（2,）DNA,拓扑异构酶（,DNA topoisomerase）,DNA,拓扑异构酶，改变,DNA,分子构象，理顺,DNA,链，使复制能顺利进行。,分类：拓扑酶,和拓扑酶,作用特点：对,DNA,分子的作用是既能水解，又能连接磷酸二酯键。,DNA,分子一边解链，一边复制，拓扑酶是在复制全过程中都是有作用的。,作用机制,拓扑异构酶,切断,DNA,双链中,一股,链，使,DNA,解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，,DNA,变为松弛状态,。,反应,不需,ATP,。,拓扑异构酶,切断,DNA,分子,两股,链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。,利用,ATP,供能，连接断端，,DNA,分子进入负超螺旋状态。,2,单链,DNA,结合蛋白,单链,DNA,结合蛋白（,single stranded DNA binding protein，SSB）,的作用是在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,模板的,DNA,总要处于单链状态，而,DNA,分子只要符合碱墓配对，又总会有形成双链的倾向，以使分子达到稳定状态和免受胞内广泛存在的核酸酶降解。,3 引物酶,DNA,聚合酶不能从头合成,DNA,链，只能延长已有的,DNA,或,RNA,引物链。,引物酶,（,primase）,在复制起始时催化,引物,（,primer）,合成，提供,3,-OH,末端，使,DNA-pol,能够催化,dNTP,聚合。,引物酶属,DNA,指导的,RNA,聚合酶，但不同于催化转录过程的,RNA,聚合酶。在,E.coli，,引物酶是,dnaG,基因的产物,DnaG,。,4,DNA,连接酶（,DNA ligase）,连接,DNA,链,3-OH,末端和相邻,DNA,链的,5,P,末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的,DNA,链连成完整的链。,特点：连接酶连接碱基互补基础上的双链中的单链缺口，它并没有连接单独存在的,DNA,单链或,RNA,单链的作用。,功能：在复制中起最后接合缺口的作用，在,DNA,修复、重组、剪接中也起缝合缺口作用，也是基因工程的重要工具酶之一。,三种酶催化生成磷酸二酯键的比较,三,DNA,生物合成过程,（,一）,、原核生物,DNA,生物合成,复制的起始,复制的延长,复制的终止,1.,复制的起始,DNA,解链,引发体的形成并合成引物,超螺旋的转型,DnaA,蛋白辨认起始点,形成起始复合物,DnaB,蛋白解螺旋,DnaC,蛋白协助,DnaB,在多种蛋白质参与下，,DNA,解开成单链,HU,蛋白促进起始,SSB,维持单链稳定,引物的合成,Dna A,Dna B、Dna C,DNA,拓扑异构酶,引物酶,OH,SSB,3,5,3,5,引物酶,OH,含有解螺旋酶、,DnaC,蛋白、引物酶和,DNA,复制起始区域的复合结构称为,引发体,。,引发体的蛋白质部分在,DNA,链上可以移动，并需由,ATP,供给能量。引发体到达适当位置就可按照模板的配对序列，催化,NTP（,不是,dNTP）,的聚合，生成,引物,。,DNA,复制是半不连续，一股链是可以连续进行的，另一股链是不连续复制的，在不连续复制的链上，引发体需多次生成。,3,超螺旋的转型,解链将导致下游发生打结现象或,DNA,超螺旋的其他部分过度拧转。,拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用，实现,DNA,超螺旋的转型，即把正超螺旋变为负螺旋。,实验证明，负超螺旋比正超螺旋有更好的模板作用。,复制起始的过程,1,DnaA,蛋白辨认结合,oriC,的重复序列，并与,DNA,形成复合物，引起解链；,2,DnaB,在,DnaC,的辅助下结合于初步打开的双链，并用其解螺旋酶活性开链；,3,拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用，实现,DNA,超螺旋的转型；,4,SSB,结合在已开链的,DNA,模板上，使,DNA,在一定的范围内保持开链状态。,5,引物酶介入，形成的引发体，可按照模板的配对序列，催化,NTP,的聚合，生成引物。,脱氧单核苷酸逐个加入而延长,DNA,新链，其化学反应本质是生成磷酸二酯键。,催化此反应的酶：,原核生物：,DNA-pol,真核生物：,DNA-pol,只合成引物,DNA-pol,催化连续复制,2,复制的延长,复制延长的生化过程,复制起始时，母链即已解开，两股单链都是模板，其作用是按碱基配对规律指引核苷酸加入到新链。,每次加入的单个核苷酸，都是以,dNTP,为原料，复制时子链从,5,向,3,延长。,复制延长速度相当快。,E.coli,每秒钟能加入的核苷酸数达,2500,个。,2.,复制的半不连续性和冈崎片段,复制方向与解链方向不一致可以理解不连续复制的成因,领头链连续复制,顺着解链方向而生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为前导链（,leading strand),。,随从链不连续复制,复制的方向与解链方向相反生成的子链称为,随从链,（,lagging strand）,。,随从链,的复制必须等待模板链解开至足够长度，才能从,53,方向生成引物然后复制。,随从链,在延长时，又要等到下一段暴露出足够长而度的模板，,再次,生成引物而延长。这就是不连续复制。,冈崎片段,随从链不连续复制的片段称为冈崎片段，其大小在,1000,2000,个核苷酸。,每一个不连续复制的片段,5-,端都带有一个,RNA,引物。,片段的复制,完成后，,RNA,引物会被除去而代之以,DNA,片段，因此复制至最后，两股子链都是,DNA,链。,5,3,解链方向,5,3,5,冈崎片段,在同一个复制叉上，前导链的复制先于后随链，但两链是在同一,DNApol,催化下进行。即随从链的模板可折叠或环绕成环状，与前导链正在延长的区域对齐，使领头链和随从链的生长点都处在,DNApol,催化位点上。,解链方向就是酶的前进方向，也是复制叉延伸方向。,复制延长简图,1.DNA,聚合酶把新生链的第一个脱氧核苷酸加到引物的3-,OH,上，开始新生链的合成过程。,A,G,T,A,C,T,A,A,T,DNA,聚合酶,A,C,G,A,C,G,T,T,引物,T,A,G,T,A,C,T,A,A,T,A,G,C,G,A,C,G,G,T,T,T,T,组成,DNA,的脱氧核糖核苷酸一个个连接起来,3,5-磷酸二酯键,引物,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,A,C,G,G,T,T,T,T,A,引物,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,A,C,G,T,T,G,T,T,A,引物,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,A,C,T,G,T,T,A,A,引物,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,A,C,G,G,T,T,A,A,T,引物,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,A,C,G,G,T,T,A,A,T,A,引物,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,C,G,C,G,G,T,T,A,A,T,A,T,引物,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,G,C,G,G,T,T,A,A,T,A,T,C,引物,A,G,T,A,C,T,A,A,T,G,G,C,G,G,T,T,A,A,T,A,T,C,DNA,模板链,DNA,新链,引物,（三）复制的终止,原核生物基因是环状,DNA，,双向复制的复制片段在复制的终止点,(ter),处汇合。,复制的起始点和终止点刚好把环状,DNA,分为两个半圆，两个方向各进行,180,，同时在终止点汇合。,为了定位方便，习惯把,E.coli,的,DNA,分为,100,等分。,E.coli,复制起始点,oriC,在,82,位点，复制终点,ter（termination）,在,32,位点。,Ecoli,基因图,ori,ter,E.coli,82,32,oriC,5,5,DNA-pol,5,OH,P,5,DNA-pol,dNTP,5,5,P,5,5,ATP,ADP+Pi,DNA,连接酶,随从链上不连续性片段的连接,真核生物的,DNA,生物合成,DNA,合成,(synthesis),期,人为分成,起始、延长、终止三个阶段,哺乳动物的细胞周期,G,1,G,2,S,M,（一）复制的起始,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。,复制的起始需要,DNA-pol（,引物酶活性）和,pol（,解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子,(replication factor,RF)。,增殖细胞核抗原,(proliferation cell nuclear antigen,PCNA),在复制起始和延长中起关键作用。,（二）复制的延长,3,5,5,3,前导链,3,5,亲代,DNA,滞后链,引物,核小体,（三）复制的终止,染色体,DNA,呈线状，复制在末端停止。,复制中,冈,崎片段的连接，复制子之间的连接。,染色体两端,DNA,子链上最后复制的,RNA,引物，去除后留下空隙。,端粒,(telomere),指真核生物染色体线性,DNA,分子末端的结构。,功能,维持染色体的稳定性,维持,DNA,复制的完整性,结构特点,由末端单链,DNA,序列和蛋白质构成。,末端,DNA,序列是多次重复的富含,G、C,碱基的短 序列。,TTTT,GGGG,TTTT,GGGG,端粒酶,(telomerase),的组成,端粒酶,RNA(human telomerase RNA,hTR),端粒酶协同蛋白,(human telomerase associated protein 1,hTP1),端粒酶逆转录酶,(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),端粒和端粒酶的生物学意义,端粒特别是端粒酶的活性与细胞的生长、繁殖、衰老凋亡以及肿瘤的发生密切相关。,端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而逐渐变短至消失，可导致染色体稳定性下降，导致细胞衰老凋亡。,体细胞几乎没有端粒酶活性，随多次细胞分裂端粒逐渐缩短，细胞失去增殖能力。而端粒酶活性较高的胚原细胞，端粒长度未缩短。,肿瘤细胞端粒酶重新获得活性，以维持端粒结构致使染色体稳定而成为永生细胞。,肿瘤细胞的端粒比正常人同类细胞显著缩短。,DNA,损伤（突变）与修复,（,一,）,突变的定义,（,二,）,突变的意义,（,三,）,引发突变的因素,（,四,）,突变的分子改变类型,（,五,）,DNA,损伤的修复,（,一,）,突变的定义,个别脱氧核糖核苷酸残基甚至片段,DNA,在构成、复制或表型功能上的异常变化，称为突变（,Mutation），,也称为,DNA,损伤（,DNA damage）。,遗传物质结构改变引起遗传信息的改变,（,二,）,突变的意义,（）突变是进化、分化的分子基础,自发突变或自然突变,（二）突变导致基因型改变,多态性：个体之间的基因型差别。,（三）突变导致死亡,突变发生在对生命过程至关重要的基因上，可导致个体、细胞的死亡。,（四）突变是某些疾病的发病基础,有害的突变,（,三,）,引发突变的因素,（一）自发突变,（二）诱发突变,1,物理因素：主要指紫外线和各种辐射，如紫外线可引起,DNA,链上相邻的两个嘧啶碱基发生共价结合，生成嘧啶二聚体。,2,化学因素：化工原料、化工产品和副产品，各种工业的排放物、农药、食品防腐剂或添加剂，以至汽车排放的废气。,嘧啶二聚体的形成与解聚,（,四,）,突变的分子改变类型,错配,(mismatch),缺失,(deletion),插入,(insertion),重排,(rearrangement),框移,(frame-shift),错配（,mismatch）,DNA,分子上的碱基错配称,点突变,(point mutation),。,点突变发生在基因的编码区域，可导致氨基酸的改变。,1.,转换：,发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,2.,颠换：,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,缺失、插入和框移突变,缺失：,一个碱基或一段核苷酸链从,DNA,大分子上消失。,插入：,原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到,DNA,大分子中间。,框移突变：三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同。,谷 酪 蛋 丝,5 ,G,C,A,G U A,C A U,G U C,丙 缬 组 缬,正常,5 ,G A G,U A C,A U G,U C,缺失,C,缺失引起框移突变,重排（,rearrangement,DNA,分子内发生较大片段的交换，称为重组或重排。,移位的,DNA,可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。,（,五）,DNA,损伤的修复（,DNA repairing,修复是指针对已发生了的缺陷而施行的补救机制。,修复的主要类型：,光修复,(light repairing),切除修复,(excision repairing),重组修复,(recombination repairing),SOS,修复,光修复,光修复过程是通过光修复酶（,photolyase）,催化而完成的，仅需,300,600nm,波长照射即可活化，普遍存在于各种生物，人体细胞中也有发现。,通过此酶作用，可使嘧啶二聚体分解为原来的非聚合状态，,DNA,完全恢复正常,光修复酶,(photolyase),UV,切除修复（,excision repairing）,细胞内最重要的修复机制，包括去除损伤,DNA，,填补空隙和连接。,1,、原核生物,DNA,损伤修复：,UvrA，UvrB,辨认及结合,DNA,损伤部位；,UvrC,在解螺旋酶的协助下切除损伤部位。,DNA-pol,和连接酶填补空隙和连接。,2,、真核生物,DNA,损伤修复：,XP,类蛋白辨认和切除损伤,DNA,部位，切除后留下的空隙，则由,DNA-pol,及,加以修复。,E.coli,的切除修复方式,UvrA,UvrB,UvrC,OH,P,DNA,聚合酶,OH,P,DNA,连接酶,ATP,重组修复（,recombination repairing）,当,DNA,分子的损伤面较大，还来不及修复完善就进行复制时，损伤部位因无模板指引，复制出来的新子链会出现缺口，这时，就靠重组蛋白,RecA,的核酸酶活性将另一股健康的母链与缺口部分进行交换，以填补缺口。,损伤链移到己完成复制的链上，如果损伤又只发生在双链,DNA,中的一股单链，则下一轮的复制损伤链就只占,DNA,的,1,4,，不断复制后，其比例就越来越低，称为把损伤链“稀释”掉。,SOS,修复,是一类应急性的修复方式。由于,DNA,损伤广泛至难以继续复制，由此而诱发出一系列复杂的反应。,在,E.coli，,各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子,(regulon),的网络式调控系统。,特点：反应特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过,SOS,修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而，,DNA,保留的错误会较多，引起较广泛、长期的突变。,第二节,RNA,的生物合成（转录）,一、,DNA,指导下的,RNA,的合成,二、,RNA,的转录后加工,三、在,RNA,指导下,RNA,和,DNA,的合成,一、,DNA,指导下的,RNA,的合成,定义,：,RNA,的生物合成就是转录，即以,DNA,为模板，在依赖于,DNA,的,RNA,聚合酶的催化下，以4种,NTP（ATP、CTP、GTP,和,UTP,为原料，合成,RNA,的过程。,合成部位,：细胞核,合成原料,：四种,NTP,（,一）,DNA,指导,RNA,聚合酶,定义：以,DNA,为模板，催化三磷酸核苷（,NTP）,聚合形成,RNA,的酶。,作用特点：,DNA,为模板,不需引物，两游离,NTP,或一游离,NTP,与,RNA,链聚合.,3-,OH,与5-,P,聚合形成磷酸二酯键。,方向：5,3,。,核心酶(,core enzyme),全酶(,holoenzyme),核心酶:转录延长;,全酶：转录起始。,70,是辨认典型转录起始点的蛋白质。,32,是辨认热休克蛋白,(,Hsp,),转录起始点的蛋白质。,RNA,聚合酶全酶在转录起始区的结合,（启动子和转录因子）,启动子(,promoter):RNA,聚合酶识别、结合和开始转录的一段,DNA,序列。,转录因子：,RNA,聚合酶起始转录需要的辅助因子。,RNA,聚合酶保护法,开始转录,T T G A C A,A A C T G T,-35 区,(,Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,1,-30,-50,10,-10,-40,-20,5,3,3,5,原核生物启动子保守序列,RNA-pol,辨认位点,(,recognition site),5,5,RNA,聚合酶保护区,结构基因,3,3,原核生物启动子结构特点：,一致性序列(,concensus,保守序列)：,碱基序列相对稳定，不易发生突变。,TTGACA：-35,区，,RNA,聚合酶的辨认位点，,亚基结合位点。,TATAAT：-10,区，,Pribrow,盒，,RNA,聚合酶的稳定结合位点。,亚基的结合位点。,（三,）,终止子和终止因子,终止子 ：提供转录停止信号的,DNA,序列,终止因子：协助,RNA,聚合酶识别终止信号的辅助因子（,nusA,）,通读：,抗终止因子：,终止信号位于：,茎环结构终止转录的机理,使,RNA,聚合酶变构，转录停顿；,末端,polyU,使转录复合物趋于解离，,RNA,产物释放。,5,pppG,5,3,3,5,RNA-pol,1.非依赖,Rho,因子的转录终止,DNA,模板近终止处，有特殊的碱基序列，转录出,RNA,产物形成特殊的结构终止转录。,发夹结构：反向碱基互补序列,末端,PolyU：U:A,不稳定.,A T P,2.依赖,Rho,因子的转录终止：具有控制转录终止作用的蛋白质因子。机制：,Rho,因子与,RNA3-OH,的,poly C,结合，抑制聚合酶活性，激活解螺旋活性。,45,S-rRNA，5S-rRNA：,核糖体,RNA,成分。,hnRNA：mRNA,的前体。,snRNA：,参与,mRNA,剪切。,真核生物的,RNA,聚合酶,CAAT,盒,GC,盒,增强子,顺式作用元件,结构基因,-,GCGC-CAAT-TATA,转录起始,真核生物启动子保守序列,461,(四)转录过程,The Process of Transcription,RNA,合成过程,起始,双链,DNA,局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达,基因终点,延长阶段,5,3,RNA,启动子,终止子,RNA,聚合酶,5,3,5,5,3,离开,转录起始,转录起始需解决两个问题：,RNA,聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。,DNA,双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,转录起始过程：,辨认起始位点：,亚基辨认启动子的-35区，,RNA,聚合酶全酶(,2)与模板疏松结合。酶滑行到-10区，通过亚基与模板牢固结合。,2.,DNA,双链解开:,RNA,聚合酶挤入,DNA,双链中，解链长度约20个核,苷酸，拓扑异构酶参与。,3.在,RNA,聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物。,RNApol(,2,)-DNA-5pppGpN-OH 3,转录起始复合物:,RNA,聚合酶-,DNA,模板-四磷酸二核苷酸,5,-,pppG-OH +NTP,5,-pppGpN-OH 3,+ppi,转录延长,1.,亚基脱落，,RNApol,聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着,DNA,模板前移；,2.在核心酶作用下，,NTP,不断聚合，,RNA,链不断延长。,(,NMP),n,+,NTP,(NMP),n+1,+,PPi,3.转录空泡的形成：,DNA,解开的两条单链与,RNA,聚合酶及其转录产物,RNA,构成的转录复合物。,3,3,RNA-DNA,杂交螺旋,聚合酶的移动方向,新生,RNA,复链,解链,有义链,模板链（反义链）,延长部位,模板链(,template strand),反义链,DNA,双链中，能按碱基配对规律指引转录，生成,RNA,的一股单链。,编码链(,coding strand),有义链,DNA,双链中碱基序列与,RNA,一致的一股链。,反义核酸：以编码链为模板合成的核酸，称为反义核酸（反义,RNA、,反义,DNA）。,序列与模板链一致，能抑制,mRNA,表达。,5,3,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,转录方向,转录方向,不对称转录(,asymmetric transcription),在,DNA,分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录。,模板链并非永远在同一条单链上。,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,5,3,DNA,RNA,RNA,聚合酶,依赖,Rho,(,),因子的转录终止,非依赖,Rho,因子的转录终止,RNA,聚合酶在,DNA,模板上停止前进，转录产物,RNA,链从转录复合物上脱落。,转录终止,1、转录单位：启动子 终止子,2、不对称转录：两条,DNA,链不同时进行转录的现象。,编码链或反意义链；模板链或有意义链,3、,RNA,聚合酶：,转录特点：,全酶：有,5,个亚基组成作用 识别启动子，引发,RNA,的 合成。,核心酶：不含,亚基，延长,RNA,链,二、,RNA,的转录后加工,原核生物中,rRNA,前体的加工,甲基化作用,专一核酸内切酶,30,S,前体,17,S,tRNA,25,S,专一核酸外切酶,16,S rRNA,23,S rRNA,5,S,rRNA,专一核酸外切酶,二、,tRNA,的转录后加工,tRNA,前体,RNA pol,TGGCNNAGTGC,GGTTCGANNCC,DNA,RNAaseP、,内切酶,5前导序列：,RNAaseP,中部内含子：内切酶,tRNA,核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,碱基修饰,（2）还原反应,如：,U,DHU,（3）核苷内的转位反应,如：,U,（4）脱氨反应,如：,A,I,如：,A,A,m,（1）甲基化,真核细胞,mRNA,的加工,5端接上一个“帽子”(,CAP),结构,3端添加,PolyA“,尾巴”,由,RNA,末端核苷酸转移酶催化,剪接：剪去内含子(,intron)，,拼接外显子(,extron,断裂基因(,splite gene)：,真核生物基因的编码区和非编码区互相间隔,又连续镶嵌而成，这些基因称为断裂基因。,C,A,B,D,编码区,A、B、C、D,非编码区,三、在,RNA,指导下,RNA,和,DNA,的合成,（一）,RNA,的复制,（二）,RNA,的逆转录,（二）,逆转录和其他复制方式,1,逆转录病毒和逆转录酶,逆转录 在逆转录酶的作用下以,RNA,为模板合成,DNA,的过程。此过程中，核酸合成与转录（,DNARNA）,过程遗传信息的流动方向相反（,RNADNA），,故称为,逆转录（,reverse transcription)。,逆转录病毒,RNA,病毒的基因组是,RNA,而不是,DNA，,其复制方式是逆转录，故称为,逆转录病毒（,retrovirus）。,病毒基因的整合可能是病毒致癌的重要方式。,逆转录酶,能催化以单链,RNA,为模板合成双链,DNA,的反应的酶称为,逆转录酶（,reverse transcriptase),。,它兼有三种酶的活性：,RNA,指导的,DNA,聚合酶，,DNA,指导的,DNA,聚合酶和,RNase H,活性。,逆转录酶和其他,DNA,聚合酶一样，合成,DNA,的方向为,53,，并且不能从头合成,DNA，,也需要引物，是病毒本身的一种,tRNA,。,RNA,模板,逆转录酶,DNA-RNA,杂化双链,RNA,酶,单链,DNA,逆转录酶,双链,DNA,2,逆转录过程,逆转录酶,A AA A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为,cDNA,法。,以,mRNA,为模板，经逆转录合成的与,mRNA,碱基序列互补的,DNA,链。,试管内合成,cDNA,3逆转录酶和逆转录现象的生物学意义,（,1）逆转录酶和逆转录现象是分子生物学研究中的重大发现,RNA,同样兼有遗传信息传代与表达功能。,（2）对逆转录病毒的研究，拓宽了病毒致癌理论。,（3）分子生物学研究应用逆转录酶（,cDNA,法,),，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一。,四、基因工程简介,基因工程亦称遗传工程，即利用,DNA,重组技术的方法，把,DNA,作为组件，在细胞外将一种外源,DNA（,目的基因）和载体,DNA,重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因,DNA,在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（,cloning，,克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。,Foreign DNA to be inserted,Plansmid vector,Joining,Recombinant DNA molecule,Introduction into host cells by transformation of viral infection,Host chromateme,Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule,Cloning,+,1、体外基因重组,目的基因的制备,载体的构建：质粒或噬菌体,目的基因与载体重组,2、重组体,DNA,的转化增殖和表达,转化,筛选,增殖和基因表达,五、,PCR,技术,原理,示意图,靶序列,变性和引物复性,循环,1,循环,2,循环,3,变性和引物复性,链延伸,Tag,酶,链延伸,第三节蛋白质的生物合成,一、蛋白质生物合成体系,二、蛋白质生物合成过程,三、蛋白质合成后加工和输送,一、蛋白质生物合成体系,参与蛋白质生物合成的物质,翻译模板,mRNA,及遗传密码,核蛋白体是肽链合成的装置,tRNA,与氨基酸的活化,（一）参与蛋白质生物合成的物质包括：,三,种,RNA,20种氨基酸（,AA）,作为原料,酶及众多蛋白因子，,如,IF、eIF,ATP、GTP、,无机离子,（二）翻译模板,mRNA,及遗传密码,遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为,顺反子(,cistron),。,原核生物的一段,mRNA,常常编码几种功能相关的蛋白质，这种,mRNA,被称为,多顺反子,（,poly cistron）,。,真核生物的一段,mRNA,常常只能编码一条多肽链，这种,mRNA,被称为,单顺反子,（,single cistron）。,mRNA,分子上从5,至3,方向，由,AUG,开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为,三联体密码,（,triplet code）,起始密码（,initiation coden）:AUG,终止密码（,termination coden）:UAA，UAG，UGA,UCAG,UCAG,UCAG,UCAG,遗传密码的特点：,1、连续性（,Commaless）,移码突变（框移突变）,2、简并性（,Degeneracy）,色氨酸和甲硫氨酸,3、摆动性（,Wobble）,密码子与反密码子配对，有时会出现不遵从碱基配对规律的情况，称为遗传密码的摆动现象,4、通用性（,Universal）,反密码子,第一位碱基,密码子,第三位碱基,I U G,A,C,U A,G U,C,A U C,1 2 3,从,mRNA 5,端起始密码子,AUG,到3,端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编