细胞周期于凋亡.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞术,多参数流式细胞术,DNA/RNA同步分析法,成熟促进因子MPF:,正常有丝分裂的启动因子,细胞分裂周期基因cdc,MPF:,p34cdc2/28，CDKs(细胞周期素依赖性蛋白激酶),细胞周期素 Cyclins,二.肿瘤发生、发展研究与生命复制研究的会合,癌基因时代,抑癌基因时代,多基因时代、癌基因蛋白网络时代,肿瘤多步骤理论、DNA修复理论、细胞凋亡理论,细胞周期核心理论,三、肿瘤与细胞周期研究的重大突破,肿瘤是多基因变化导致细胞周期紊乱，细胞失控性生长所致的一类疾病。,肿瘤是多步骤发生、多基因突变的进化性疾病。,1.,“二次打击学说”,：,视网膜母细胞瘤,具有一种遗传缺陷的子代只是易患肿瘤，还需要另外的基因缺陷，才发生肿瘤。,肿瘤抑制基因从结构破坏到功能丧失。,2.,肿瘤发生发展是一个,细胞克隆进化,的过程,结肠癌：APC(肿瘤抑制基因),ras（信号转导途径),p53（肿瘤抑制基因)，DCC（粘附因子),基因阶段性突变,癌基因、抑癌基因的功能效应，都从不同的途径最终会聚到细胞周期机制上来，直接参与调控或作为细胞周期调控机制的主要成分。,肿瘤是一类,多步骤、多基因突变,所致的,细胞周期调控机制破坏、细胞克隆性、进化性疾病。,细胞周期调控核心：蛋白激酶,M期,：CDC2 cyclin B1；,G2期,：CDK2 cyclin A；,S期,：CDK2 cyclin E;,G1期,:CDK4,6-cyclin D1,D2,D3,细胞周期过程中，某一CDK含量恒定，活化与非活化CDK的总量不变。,一、Cyclins是调控CDKs活性的最基本成分,特异性区域：,细胞周期素盒,cyclin box：结合并激活CDK；,特别区间,：引导CDKs到特定底物亚细胞部位。,Cyclin蛋白功能：,激活CDKs并加强CDKs对底物的作用。,Cyclin功能的调控：,依赖其蛋白质水平的细胞周期特异性起伏。,细胞周期调控蛋白的降解，控制着细胞周期内一系列事件的运行顺序、方向和协调。,1.蛋白质降解：,1983年首次提出；,1989年进一步实验证实；,1991年实验确认。,2.泛肽化介导的,蛋白质水解,：,多个,泛肽链接在底物上，被蛋白酶体识别、降解,E1 激活酶：E1泛肽羟基 硫酯结合；,E2 结合酶：,E3 连接酶：靶蛋白的赖氨酸残基,SCF,：,G,1,/S,期,APC,(anaphase promoting complex),：,M,期,3.G1-S转换中的蛋白质,水解,SCF复合物：,S,kp1、,C,dc53/cullin、,F,-box(Protain),有丝分裂的关键调控蛋白,Weel,也同样受到SCF系统的调控：当Weel降解后，伴随着DNA复制的完成，细胞进入有丝分裂期。,SCF系统的两类底物：cdc4 Sicl,4.有丝分裂中蛋白质水解,APC,：,有丝分裂后期促动因子复合物,Cdc16,Cdc23,Cdc27,Cyclin B/Cdk1,：,1）驱动着细胞进入有丝分裂期，阻滞细胞完成有丝分裂；,2）灭活机制：APC催化Cyclin B降解;,CDK抑制物Sic1与Cyclin BCdk1复合物结合;,CyclinB降解,Cfi1：细胞间期，核仁，直接与Cdc14结合；使Cdc14磷酸化失活；,Cdc14：1）磷酸酶，使转录因子Swi5去磷酸化，产生新的Sci1，后者被Cyclin B/Cdk1磷酸化而降解；,2)使Sci1去磷酸化，降低CyclinB/Cdk1 活性，通过Cdh1去磷酸化，能与APC结合，使Cyclin B降解，Cyclin B/Cdk1复合物彻底失活。,APC 激活，使Cyclin B降解，Cyclin B/Cdk1复合物灭活和Sci1累积，使细胞出有丝分裂后期，完成有丝分裂，进入早G1期。,二、Thr 160/161 磷酸化,Thr160/161磷酸化是CDK激活的重要条件。,CAK,(CDK-activating kinase,)：,CDK激活性蛋白激酶,1),催化亚单位蛋白激酶MO1(CDK7);Cyclin H；,2),一种CAK能使所有主要的CDK-Cyclin底物,磷酸化而激活；,3),活性在细胞周期中无起伏状态；,4),不是限速步骤。,灭活CDK-Cyclin复合物重要机制：,1）Cyclin的去除；,2）Thr160/161 去磷酸化,.,三、Thr14/Tyr15 磷酸化和去磷酸化,是CDK 激活及失活的重要环节,。,磷酸化,蛋白激酶,Weel,使 CDC2上的 Thr14/Tyr15 磷酸化；,磷酸酶,CDC25 使CDC2上的 Thr14/Tyr15 去磷酸化。,CDC2的激活过程,：,Cyclin B1与CDC2结合；,Weel对Thr14/Tyr15进行磷酸化，抑制CDC2的活性；,CAK对Thr160/161进行磷酸化;,CDC25 激活，使Thr14/Tyr15 去磷酸化；,CDC2被激活。,CDK激活条件：,1.与特定Cyclin结合；,2.Thr14/Tyr15磷酸化及去磷酸化；,3.CAK 使Thr160/161磷酸化；,4.Cyclin-CDK活性高于CKI。,CDK失活条件：,1.Cyclin 降低；,2.Thr14/Tyr15磷酸化；,3.Thr160/161去磷酸化；,4.TGF-,1,存在（Cyclin D,E-CDK2,A）；,5.CKI结合并失活Cyclin-CDK。,四、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物,调控CDKs活性机制：,Cyclins、CAK、Weel/Cdc25 的磷酸化和去磷酸化、CKIs（细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物）,CKI家族两大类：,1),Cip/Kip 家族：p21 p27 p57,N端:与CDK结合的相同结构域；,与CDK结合后，抑制G1、S期Cyclin-CDK,是控制G1/S转换的CDK的抑制剂；,C端:结构与功能各不相同。,特点：p21 C端有PCNA结合结构域，,p21 有两个p27结合位点,2),INK4家族,：,p15 p16 p18 p19,主要与CDK4、CDK6的抑制密切有关。,特点：p16不随细胞周期时相变化；,p19 随细胞周期规律性震荡。,TGF-1能促进 p15 mRNA 表达，抑制细胞增殖。,CKIs所识别的是多数CDK-Cyclin复合物，不是CDK单体；p16 INK4a同CDK4 单体结合。,当 DNA损伤及细胞衰老，具有转录因子作用的 p53增高，诱导 p21Cip1的转录增强，后者与相应的 CDK-Cyclin 复合物结合，抑制蛋白激酶的激活，阻滞细胞周期的进行。,第三节 细胞周期调控的两大机制,一系列Cyclins 时相性起伏，相应CDKs依次激活，驱动细胞通过G1、S、G2期，到达M期。,一、,细胞周期的启动机制,主要调控点：G1期,酵母：“起始点”START，细胞内外信号,人类细胞：“限制点”restriction point，,早期应答基因（c-Fos,c-Jun),延迟应答基因(Cyclin D),信号转导 细胞周期的联结途径：,Cyclin D-Cdk4/6,Cyclin E-Cdk2,G1期限速步骤,生长信号（信号途径、早期应答基因）,Cyclin D,Cyclin D-Cdk4/6,Cyclin D-Cdk4/6-p27Kip1复合物,Cdk4/6摄取、转移磷酸基团,1）pRB低磷酸化状态：pRB与E2F结合，抑制S期必须基因产物表达，阻止G1/S、DNA合成，阻断细胞周期；,2）pRB高磷酸化状态：pRB失活，释放转录因子（如E2F），产生多种蛋白质，驱动细胞周期的进行；Cyclin E升高，Cyclin E-Cdk2复合物，促使p27Kip1减少，Cdk2活化；Cyclin E-Cdk2使p27Kip1磷酸化，成为泛肽化蛋白水解的靶，降解。,正是Rb pathway 的E2F正反馈机制协同 p27Kip1降解机制，使细胞在“restriction point”后，越来越少地依赖生长因子或有丝分裂因子。,二、,细胞周期的监控机制,检测点 checkpoint,功能分类:DNA损伤检测点,时相次序检测点,监控机制:探测部分（特定基因产物）,制动部分（细胞内信号转导）,检修部分,处理部分,1.,DNA损伤检测点,p53 pathway ;Cdc25 pathway,DNA损伤,，,信号传递给p53;,p53,稳定性增高，p53蛋白水平升高;,启动,p21,的转录，p21蛋白迅速升高，与多种,CDK-Cyclin,复合物直接结合,抑制CDKs,的激活,，,阻滞G1/S的过渡,，,为修复DNA提供足够的时间。,ARF-Mdm2-p53 pathway,INK4a基因编码 p16INK4a、ARF/p14ARF）。,Rb pathway激活后，E2F1、Myc等将导致ARF蛋白的积累：,1）,破坏Mdm2的功能（阻断p53转录、使p53泛肽化、强制性使p53转运到胞浆中），结果是p53出现积累，导致细胞周期运行滞留，乃至发生细胞凋亡；,2）,细胞对DNA损伤更为敏感。,G2期检测点：,当DNA损伤，激活hATM/hATR，使,Chk1,蛋白激酶,磷酸化,，,作用于磷酸酶Cdc25(Ser-216磷酸化)，磷酸化后Cdc25与14-3-3蛋白结合、扣留、失活，不能将CDC2蛋白激酶Thr-14/Tyr-15位去磷酸化，使,CDC2不能激活,，导致G2期阻滞。,2.时相次序检测点,有丝分裂与DNA复制严格的时相次序。,1）,有丝分裂促进因子MPF,：,G2、S期，,诱发 有丝分裂；染色体凝集。,2）,S期促进因子SPF,：,诱发G1期细胞核进入S期；,S期CDKs存在于S期的开始到M期的结束；,只启动一次DNA复制。,3）,S期启动,(1)S期开始前组装,pre-RC,（,复制前复合物,）,ORC Cdc6p Mcm,(2),S期,CDKs和DDK,（Cdc7-Dbf4）共同启动DNA的复制。,4）,S期CDKs的双重功能,：,引发DNA复制的启动；防止pre-RC重复组装。,M期CDKs,：,防止pre-RC重复组装,。,5）有丝分裂后期促进复合物,（anaphase-promoting complex,APC,cyclosome),：,调控姐妹染色体的分离和M期Cyclin的降解。,M期CDKs的激活并积累使APC处于活化,状态，一直持续到G1期；G1期CDKs的激活,并积累又抑制了M期Cyclin和APC底物的成熟前累积。,第四节 细胞周期的界面机制,细胞周期与信号转导、基因转录、DNA修复、细胞凋亡、细胞分化等多种生命活动密切相关。,一、,细胞周期与DNA修复,发现DNA损伤/错误的传感器，受损细胞的扣留，修复DNA，决定继续分裂或死亡。,传感器,：人类ATM，p53基因,ATM 编码蛋白激酶，结合在损伤的DNA上，能将某些蛋白磷酸化，中断细胞周期。,信号通路：1）激活Chk1，引起Ser216磷酸化，抑制CDC25，抑制M-CDK，阻断细胞周期；2）激活Chk2，使p53磷酸化，p21表达增加，抑制G1-S期CDK，阻断细胞周期。,低等生物Rad24，Rad17，Mec3，DDC1，Rad9,Rad9，Rad24与单链DNA结合，激活蛋白激酶Mec1，使Rad9、Rad53、Pds1等蛋白磷酸化，导致G2/M期过度的阻滞；Mec1激活Rad53，调节Sml1，导致dNTP合成增加，以供DNA修复需要；Mec1、Rad53及Dun1的激活，使Crt1磷酸化，解除转录抑制，开始DNA修复。,DNA修复的两大类形式,：,1）,切除修复,(excision repair)：,碱基切除修复,BER,：酶切错误的碱基并替换,核苷酸切除修复,NER,：单个核苷酸或一段寡核苷酸切除、修复。,全基因组切除修复,：,蛋白质/DNA直接作用识别、修复，可发生在基因的任何部位；,转录切除修复,：,在转录过程中完成切除、修复,TFIIH，是一个多功能蛋白复合物，由XP-B、XP-D和TTD-A基因的蛋白产物构成，与基因转录的启动密切相关。在CAK的作用下，TFIIH被激活。,TFIIH将细胞周期、基因转录、DNA修复联系在一起。,2）,错配修复,(mismatch repair)：,MSH2基因产物识别;,与DNA直接形成复合物;,内源性核酸酶和核酸多聚酶作用,去除重复错配的DNA链,二、细胞周期与细胞凋亡,不同因素诱导的细胞凋亡，发生在细胞周期的不同时相。,三、细胞周期与细胞分化,角化细胞分化:p21Cip1与细胞分化有关;,角化细胞分化时，p21Cip1水平下降；,当细胞增殖时，p21Cip1能抑制角化细胞分化，同时与DNA多聚酶的主要成分PCNA结合，影响细胞周期中DNA合成期的进行。,Rb的研究中发现，Rb磷酸化时，能释放所“扣留”的转录因子E2F，驱动细胞周期的进行；当Rb处于去磷酸化状态时，促使成肌细胞/脂肪细胞分化,第五节 肿瘤细胞周期机制的破坏,甲状旁腺腺瘤-Cyclin D1基因突变,肝细胞癌-乙肝病毒嵌入Cyclin A基因序列,乳腺癌-Cyclin E 过度表达,从三个方向（细胞分子生物学、肿瘤生物学和临床肿瘤学）、三类基因（癌基因、抑癌基因和肿瘤易感基因）、三种细胞归宿（细胞分裂、细胞分化和细胞死亡）会聚到细胞周期调控机制，对肿瘤发生、发展的认识集中在三个层面：,监控机制/保真性（fidelity）,驱动机制/决策性（decision）,相关生物学/延伸性（expanding）,一、细胞周期监控机制的破坏,肿瘤是一类多基因疾病：,1）遗传物质DNA（或基因）的改变；,2）多步骤、多基因变化；,3）最终导致细胞的失控性生长。,DNA损伤检测点,1）,G1-S过渡期,：,防止DNA受损细胞进入S期，,2）,G2-M过渡期,：,防止受损的DNA和未完成复制的DNA进入有丝分裂。,DNA损伤检测点的主要机制,1）p53依赖性机制,2）p53非依赖性机制,检测点的四部分功能,：,发现detect、制动stop、工作work、决定decision,典型例子-p53基因的突变,DNA病毒（SV40、HPV、腺病毒等），首先导致遗传的不稳定性，通过其产物，结合并使p53蛋白灭活，减弱细胞周期检测点功能；,缺乏p53或AT基因的细胞，经放射线照射后，遗传的不稳定性明显增加，即使该基因是杂合性丢失，也将导致乳腺癌。,二、细胞周期驱动机制的破坏,在正常细胞S期，Cyclin A蛋白与转录因子E2F结合。,研究发现，肝细胞癌的细胞中，乙肝病毒的DNA片段整合到了Cyclin A 基因中；在腺病毒转化的细胞中，Cyclin A与腺病毒转化蛋白EIA结合在一起。,PRAD1与bcl-1基因序列联在一起，在B淋巴细胞白血病时，bcl-1移位到免疫球蛋白基因增强子而被激活；,在甲状旁腺肿瘤细胞中，染色体重排，使PRAD1与甲状旁腺激素基因的增强子并置，导致PRAD1大量表达。,正常情况下，PRAD1产物能激活Cdc2/Cdc2类蛋白激酶（Cyclin D1）。,直接的CKIs、Rb和p53的破坏更常见。,DNA损伤所致的经典途径,p53-p21-CDKs-Cyclins,DNA损伤p53表达增加 p21Cip1转录增加细胞周期运行受阻,p53突变时，丧失了促进p21Cip1转录的功能，导致含有受损DNA的细胞，仍然处于细胞周期运行中复制。,p21Cip1的双重制动作用：,1）抑制CDKs的活性；,2）直接结合，抑制增殖细胞核抗原。,“多肿瘤抑制基因”MTS1（multipletumor suppressor）：,编码蛋白产物为p16，一种蛋白激酶抑制物，1）特异性抑制Cdk4-Cyclin D蛋白激酶的活性；2）不能对其底物Rb进行磷酸化，阻止了G1-S,的过渡；,3）使Cyclin D不能连接生长因子信号转导与细,胞周期调控机制，阻碍 细胞的生长、复,制与分裂。,第六节 问题与展望,细胞周期,核心机制,的精确解剖,细胞周期,界面联系,的精确解剖,第一节 历史回顾,第二节细胞周期机制的核心CDKs调控机制,Cyclins是调控CDK活性的最基本成分,Thr160/161磷酸化,Thr14/Tyr15磷酸化和去磷酸化,细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物,第三节 细胞周期调控的两大机制,细胞周期的启动机制,细胞周期的监控机制,第四节 细胞周期的界面机制,细胞周期与DNA修复,细胞周期与细胞凋亡,细胞周期与细胞分化,第五节 肿瘤细胞周期机制的破坏,细胞周期监控机制的破坏,细胞周期驱动机制的破坏,第六节 问题与展望,第九章 细胞凋亡与肿瘤,1858年 细胞,退化、坏疽、软化、坏死；,1885年,“,染色体裂解,”；,1914年 提出了,平衡机制,，,认为是生理性,清除细胞；,1951年 提出,“,程序化细胞死亡,”；,20年后 提出,“,固缩性坏死,”,1972年 正式以“,细胞凋亡,”（apoptosis）命名,1976-1981年 发现“,梯样,”DNA电泳图谱；,1984年 发现,内源性核酸酶,的激活；,直到20世纪80年代末期，才真正开始认识到细胞凋亡的生物学意义。,第一节,细胞凋亡的特点及其意义,一、细胞凋亡的基本特点及其评价方法,（一）凋亡细胞的,形态学,特征,胞浆空泡，膜发泡，空泡排出，细胞固缩，,细胞体积缩小；细胞膜和核膜保持完整,；线粒体超浓缩、染色质进行性固缩，,核凝聚,；,核周出现块状结构、“致密球体”或葡萄串样小球体或半月形，,凋亡小体,存在。,（二）,非随机性DNA降解,琼脂糖凝胶电泳呈现,DNA梯状图谱,（DNA ladder），是细胞凋亡的重要生物化学标志。,原位末端标记,（in site end labeling，,ISEL）技术,：,根据DNA聚合酶能够填补双链DNA中单链的缺失部分，应用标记的三磷酸核苷酸形成新的DNA。,）DNA缺口平移法：,）原位末端标记法：,）末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法。,（三）,细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻,胆碱类磷脂（磷脂酰胆碱、鞘磷脂）,氨基类磷脂（磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰乙醇胺）,PS外翻现象是早期凋亡细胞重要特征之一。,由于Ca,+,依赖的磷脂结合蛋白,annexin V,能与,PS,高亲和结合，同时结合膜非通透性DNA染料（,PI,）则能从染色细胞中将凋亡和坏死细胞区分开来。,（四）,保持充足的能量代谢直至细胞凋亡末期,在,ATP,存在下，钙亲合剂诱导细胞凋亡；反之，诱导细胞发生坏死。,在预先耗竭ATP的情况下，凋亡诱导剂和Fas配体诱导的T细胞死亡形式由凋亡转向死亡。,（五）,细胞凋亡的结局,凋亡小体（apoptotic body）,细胞凋亡与细胞坏死的,区别,：,1）,形态学,：,细胞体积,细胞膜、细胞器、细胞核,溶酶体、线粒体,2）,生物化学,：,DNA、蛋白质（Caspases）,底物、抗死亡分子,对ATP的需求,3)组织分布、组织反应,特 点,细胞凋亡,细胞坏死,细胞膜,通透性正常,完整性破坏,染色质,凝聚，半月状,絮状,细胞器,完整,损伤,细胞核,固缩，降解,溶解,溶酶体,完整,裂解,线粒体,浓缩，cyto C释放,肿胀、破坏,DNA,核小体间剪切,非特征性剪切,蛋白质,Caspases活化,非特异性降解,ATP,必需,无需,分布,单个细胞,细胞群体,凋亡小体,有,，被吞噬,无，细胞自溶,炎症反应,无,，补释放内容物,有，释放内容物,形态学改变的检测方法,1.普通光学显微镜；,2.荧光显微镜；,3.电镜；,4.凋亡指数和细胞活力定量测定,生物化学方法,（,琼脂糖凝胶电泳,）,免疫学方法,（,ELISA法,）,原位末端转移酶标记技术,（,荧光酶标记,）,靶细胞DNA片段定量分析及细胞溶解试验,流式细胞分析技术,二、流式细胞仪在细胞凋亡研究中的应用,流式细胞仪是,分析细胞学,研究的重要工具。,三、细胞凋亡的生物学意义概述,细胞凋亡具有极其广泛的生物学意义，涉及,胚胎发育,、,形态发生,、,细胞稳定,及,免疫防御机制,等诸多方面,。,细胞凋亡的异常，可引起多种疾病（自身免疫性疾病、神经退行性疾病、恶性肿瘤等发生）。,研究细胞凋亡具有重要的生物学意义：,细胞凋亡在,维持组织及器官的正常形态和功能,方面起着重要作用；,细胞凋亡在,肿瘤形成和治疗,中具有重要作用；,细胞凋亡,与免疫学关系,十分密切。,第二节,Caspases和死亡受体相关的,细胞凋亡途径,细胞凋亡的过程分为三个时期,：,诱导期 效应期 降解期,在研究模型中，发现三个重要基因,：,促进,细胞凋亡基因：,ced-3、ced-4,抑制,细胞凋亡基因：,ced-9,CED-3,：半胱氨酸蛋白酶，激活的CED-3 特异,性降解蛋白底物；,CED-4,：与CED-3结合并促进CED-3激活，,CED-9,：与CED-4结合并阻止它激活CED-3,诱导、调控凋亡的基本机制：,在凋亡诱导信号作用下，,Ced-9,自三体复合物,（,Ced-3-,Ced-4-,Ced-9,）,中解离，导致,Ced-4,激活Ced-3，活化的,Ced-3,特异地降解蛋白底物，最终发生细胞凋亡。,哺乳动物体内，,caspases,与,ced-3,同源,；,Apaf-1,基因与,ced-4,同源,；,Bcl-2,基因家族与,ced-9,在结构和功能上相似(分为促进和抑制亚群),哺乳动物细胞凋亡的主要途径：,死亡受体途径、线粒体途径。,凋亡后期的共同途径：,Caspases激活,一、Caspases的结构和活性特点,1993年，发现白细胞介素-1,转化酶,ICE,（interleukin-1B-converting enzyme）与Ced-3基因存在功能和序列相似性。,1996年，统一命名为,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase),。,ICE,分为2个亚族,ICE亚族,：参与炎症反应,CED-3家族,：参与细胞凋亡,启动者：caspase-8、9，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应；,执行者：caspase-3、6、7，可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化或自剪接的方式激活,Caspase分子是一类在进化上非常保守的蛋白酶类分子。,Caspase的特性表现在两个方面（）为,半胱氨酸蛋白酶,类；（）,切割天冬氨酸的羧基,与下一个氨基酸的氨基形成的肽键。,Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，能特异地剪切割天冬氨酸残基后的肽键。,Caspases家族成员具有,相似,的氨基酸序列、结构和底物特异性。,Caspase前体,：,原结构域、大亚基和小亚基。,Caspase前体的活化，涉及结构域间的蛋白水解和大小亚基整合形成异二聚体。,基于Caspases的严格底物特异性和高度有效性，从而确保了细胞凋亡过程中发生专一性的蛋白消化。,二、死亡受体和Caspases的活化,死亡受体（death receptor,DR）,：,传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白.,肿瘤坏死因子受体,（,TNFR,）,超家族.,分为两大类：,上游始动Caspases,（Caspase-2,-8,-9,-10）,下游效应Caspases,（Caspase-3,-6,-7）,Caspases活化的“级联”模型：,凋亡诱导信号,始动Caspases活化,活化下游Caspases,参与重要底物的剪切,死亡受体结构特点：,1）具有相似的、富集半胱氨酸,胞外结构域,；,2）胞浆区具有同源性,死亡结构域,（death domain,DD,）,TNFR 分为两种亚型,：,1）,TNFR-I 型,，,具有DD，介导刺激和凋亡,2）,TNFR-II型,，,缺乏DD，介导刺激效应,也,能介导凋亡效应。,TNF诱导凋亡主要机制：,TNF-TNFR-I，TNFR-I形成同三聚体，,DD/TNFR-I 与DD/TRADD（TNF receptor-associated death domain）交联;,DED/TRADD,与 DED/上游Caspase结合；,Caspase-8寡聚体下游Caspase细胞凋亡,Fas介导的凋亡途径,Fas-FasL，Fas分子 形成同三聚体；,DD/Fas与DD/适应蛋白结合；,DED/适应蛋白与DED/上游Caspase结合；,caspase-8寡聚体下游caspases细胞凋亡。,死亡诱导信号复合体（DISC）,：,死亡受体 适应蛋白 caspase-8,三、,Caspases 的作用底物,ICE亚家族,：caspase-1，-4，-5；,主要辅助促炎 症反应；,Ced-3亚家族,：caspase-2，-3，-6 -10；,主要参与细胞凋亡过程。,参与凋亡的机制：,1.灭活细胞凋亡抑制蛋白,细胞凋亡时，caspase对ICAD进行剪切，使之失活，CAD游离，进入细胞核内降解DNA。,ICADDFF45,2.以结构蛋白为靶子，导致细胞结构解体,细胞凋亡时，caspase在单一位点剪切核纤层蛋白，导致核板塌陷及染色质浓缩。,3.以效应蛋白为靶子，导致其调节和效应结构域解体,Caspase作用于DNA修复、mRNA拼接及DNA复制相关蛋白；还可剪切某些激酶并使之激活，参与细胞凋亡中的膜重建和发泡等。,第三节 线粒体相关的细胞凋亡信号途径,细胞游离系统 cell-free system,线粒体在细胞凋亡中的作用：,DNA的裂解,依赖线粒体,的存在；,ATP,存在时，caspases的活化依赖细胞色素C自线粒体释放;,线粒体膜,上存在许多,调控凋亡分子,.,一、细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的变化,生理状况下，,线粒体跨膜电位,表现为内负外正的电化学梯度。,膜外室含有cytoC、caspases前体、乙酰化激酶2和凋亡诱导因子（AIF）等。,线粒体膜通透性转运孔MMP,：,定位于线粒体内外膜之间的一,组,蛋白复合体,（VDAC、ANT及PSR和亲环素D）。,C态ANT导致MMP开放，,m态ANT导致MMP关闭；,MMP的持续开放和关闭，则分别诱导和抑制细胞凋亡。,二、MMP开放导致线粒体释放caspases活化物,Apaf-1结构特点：1）caspase结合结构域,（,CARD,）；2）,核苷酸结合域,；3）,C端结构域,（,WD-40重复序列,）；,Apaf-1/cytoC,复合物与ATP/dATP结合;,Apaf-1寡聚体,形成并激活;,CARD/Apaf-1结合多个,caspase-9前体;,caspase-9活化-诱导,下游caspases级联活化,。,将Cyto C、Apaf-1和caspase-9前体组成的全酶复合物称为,“凋亡体(apoptosome)”。,Cyto C是线粒体呼吸链的重要组成成分，线粒体内cyto C的耗竭，将破坏呼吸链的电子转运，进而致使ATP生成受阻、ROS产生，从而诱导细胞坏死。,Cyto C的释放导致细胞不同的结果,：,1）有充足cyto C的细胞，能维持电子转运，氧消耗ATP生存保持正常水平，MMP的破坏诱导caspases活化，导致细胞凋亡；,2）当存在大量内源性caspase抑制剂的细胞，cyto C的释放不能诱导caspase依赖的细胞凋亡，而将破坏电子转运，致使氧消耗及ATP生存减少，导致细胞坏死。,由此，提出了ATP减少与否是决定细胞发生坏死还是凋亡的重要因素。,其它的凋亡效应因子,：,1）,凋亡诱导因子AIF,：,细胞凋亡时，AIF自线粒体释放即转运到细胞核内，刺激DNA降解和染色质凝集；不依赖caspase和AIF的氧化还原酶活性；AIF本身并无DNA酶活性；,2）,Smac/DIABLO,：,通过抑制IAP（凋亡抑制蛋白）活性参与细胞凋亡；,3）,核酸内切酶G,：,能诱导核小体DNA降解，无需caspase的参与。,第四节 内源性细胞凋亡抑制物和,Bcl-2基因家族,一、内源性细胞凋亡抑制物,1.,Caspase-8（FLICE）抑制蛋白（FLIP）,V-FLIP家族蛋白与DED/FADD相互作用，进而抑制Fas介导的细胞凋亡；,c-FLIP，FLIP,L,和FLIP,S,都能通过DED、FADD、caspase-8甚至caspase-10相互作用，从而特异地抑制死亡受体介导的细胞凋亡。,2.SODD（silencer of death domain）,与TNFR-I的DD相关；,维持TNFR-I的无活性单体状态；,3.IAP（inhibitor of apoptosis protein）,杆状病毒中，一组含一个或多个BIR（baculo virus IAP repeat）结构域的胞内蛋白，具有caspases抑制活性；,NIAP（神经元凋亡抑制蛋白）,IAP分子通过与caspase-3、7和9相互作用，抑制caspases活性,4.Survivin,独特的细胞凋亡抑制蛋白。,二、Bcl-2家族的结构特点及其与功能的关系,B,cl(B cell lymphoma)2基因易位t(14,18),Bcl-2同源蛋白,：,凋亡抑制蛋白,Bcl-2、Bcl-X,L,、Bcl-w、Bcl-G等,凋亡诱导蛋白,Bax、Bad、Bak、Bcl-B、Bcl-X,S,等,病毒产物：E1B-19K、BHRF-1,Bcl-2家族成员主要两大结构域,：,羧基端跨膜结构域,（transmembrane region,TM,）,是Bcl-2 定位于细胞内膜所必需的；Bcl-2的功能完整性取决于其亚细胞膜定位。,Bcl-2同源结构域,（,Bcl-2 homology,BH,）是Bcl-2 家族各成员之间或Bcl-2 家族成员和其他蛋白相互作用的重要分子基础。,Bcl-2是一种细胞内膜蛋白，主要定位于线粒体、内质网及核膜。,三、Bcl-2家族蛋白的活性调节和效应机制,Bcl-2磷酸化位点：,主要位于BH4与BH3之间。,凋亡调控效应:1)通过影响多种凋亡相关的变化，包括,细胞氧化还原状态,、,浆膜的变化,、,细胞内离子,以及,抑制caspases-3的活化,；,2)Bcl-2蛋白定位移位到线粒体膜，调节膜通透性,抑制MMP开放，阻止线粒体内促凋亡活性物释放。,第五节 细胞凋亡和恶性肿瘤,一、,凋亡抑制基因bcl-2和恶性肿瘤,B细胞淋巴瘤，染色体易位 t（14，18），bcl-2基因受免疫球蛋白基因增强子的影响而高表达；,高水平Bcl-2表达1）与急性白血病预后差相关；,2）明显增加对化疗药物的耐受性；,Bcl-2高表达单独存在不足以导致肿瘤的发生，还有赖于其他事件的参与。,Bcl-2,可以导致滤泡状B淋巴细胞增生甚至高程度的单克隆淋巴瘤，但从多克隆淋巴增生发展为单克隆淋巴瘤，其他癌基因或抑癌基因的改变起到了十分重要的作用。,c-myc基因,作为一个“经典”的癌基因，其生物学功能极其复杂和重要，促进细胞周期的进展；能诱导细胞凋亡，发挥细胞生长的“负性”调控物效应。,Bcl-X,L,在某些肿瘤中高表达。,二、凋亡活化基因p53和恶性肿瘤,p53基因:,防止潜在恶性细胞生长（DNA损伤、端粒磨损、癌基因活化、低氧）,MDM-2:,1)具有E3连接酶活性，诱使p53从细胞核,移位到胞浆并降解,；2)能,抑制p53的转录功能,；3)减少p53的乙酰化，导致,p53的功能受抑,。,在P53和MDM-2之间形成一个自身调节的反馈环，有效控制p53的过度活化，确保细胞的正常生长。,MDM-2表达的直接抑制、p53和MDM-2的翻译后修饰、MDM-2抑制蛋白的表达、p53或MDM-2亚细胞定位的调节等，都将参与调节MDM-2诱导的p53降解。,活化状态的p53,能诱导多种细胞学反应（细胞的分化、衰老、DNA修复及血管生成抑制等），其中,阻遏细胞生长,和,诱导细胞凋亡,的研究最为深入。,p53靶基因，尤其是参与p53介导的细胞凋亡相关基因的识别，是目前有关p53功能研究的重要领域。,p53能通过与p53阴性反应元件（PNRE）相互作用，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并能诱导具有MMP功能的促凋亡蛋白的表达（Bax、NOXA等）；p53蛋白诱导产生ROS的线粒体酶的表达；p53诱导死亡受体Fas和胞质蛋白Apaf-1的表达。,细胞凋亡信号途径,：,p53依赖的凋亡信号途径,p53非依赖的凋亡信号途径,三、其他凋亡相关蛋白和恶性肿瘤,抑制细胞凋亡的,异常融合蛋白：,1.Bcr-abl蛋白,染色体易位 t（9；22），Bcr-abl融合基因表达，产生p210,Bcr-abl,蛋白质，进而,诱导细胞转化,、,降低细胞凋亡速率,、提高对各种凋亡诱导剂的高度,耐受,、调节Fas介导的凋亡（抑制作用）。,2.PML-RARa蛋白,染色体易位 t（15；17），产生融合基因PML-RARa，表达PML-RARa融合蛋白，进而阻止APL（急性早幼粒白血病）细胞的分化，抑制细胞凋亡。,体外研究，PML-RARa能明显抑制U937细胞 凋亡。,PML-RARa蛋白能与野生型PML形成异二聚体，阻碍了野生型PML蛋白参与多种因素诱导的细胞凋亡。,第六节 细胞凋亡干预和肿瘤的治疗,拓扑异构酶抑制剂,VP-16,：,诱导拓扑异构酶与DNA形成断裂复合物，导致DNA损伤，诱导细胞凋亡；,微管毒性剂,紫杉醇：,通过使Bcl-2磷酸化，促进细胞凋亡；,糖皮质激素：,通过cAMP介导细胞凋亡，而且还能调节凋亡相关基因促进细胞凋亡;,一、以诱导肿瘤细胞凋亡为目标的基因治疗策略,在肿瘤细胞内，导入凋亡活化基因，或灭活凋亡抑制基因。,（一）,野生型p53基因介导的肿瘤治疗,p53基因在细胞增殖和细胞凋亡的调控中具有重要作用，并且大多数的恶性肿瘤细胞存在p53异常。,但有关p53诱导肿瘤细胞凋亡的研究结果并不完全一致。,研究显示:1)在通过 p53基因的转染表达诱导不同的小细胞肺癌的细胞凋亡中，获得了不同的结果，能够诱导H322和N417细胞发生凋亡，却不能诱导H358细胞的凋亡;,2)WTP53的表达，不仅明显增强离子辐射对肿瘤细胞的凋亡诱导活性，而且还能加强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性;,3)放疗诱导的细胞凋亡，依赖WTP53的参与。,（二）,其他凋亡诱导基因介导的肿瘤治疗,凋亡诱导基因Bcl-X,S,：,能诱导肿瘤细胞凋亡，显著抑制肿瘤细胞的生长，增加对化疗药物诱导凋亡的敏感性。,Bax的体内转染,明显增加化疗和放疗的凋亡诱导活性，其细胞毒作用和诱导凋亡方面明显优于WTP53和Bcl-X,S。,caspase基因转染,、,死亡受体（Fas）cDNA表达载体,（三）,以灭活凋亡抑制基因为目的的,肿瘤基因治疗,主要集中在对Bcl-2的研究。,研究显示，,反义Bcl-2,能够有效抑制淋巴瘤细胞在体外及,SCID小鼠,体内的生长；临床治疗上也取得了肯定的疗效（9例非何杰金淋巴瘤患者，皮下注射，2例肿瘤缩小，2例外周血淋巴细胞减少；8例行化疗，其中6例反应较好）,反义Bcr-abl,明显诱导CML细胞凋亡，并且加强对化疗药物的敏感性；SCID小鼠动物实验显示，反义Bcr-abl与化疗药物联合应用，明显诱导CML细胞凋亡以及延迟CML的发展。,二、,以诱导肿瘤细胞凋亡为目标的非基因治疗,SCID 人 T-ALL模型：,1）,Fas抗体,：,与Fas交联，诱导白血病细胞凋亡；,2）,Fas抗体+蛋白抑制剂,：,能逆转白血病细胞对Fas抗体的耐受状态；,TNF-a+化疗药物,：,TNF-a和马酚兰通过诱导内皮细胞和肿瘤细胞凋亡，使转移性黑色素瘤和难治性软组织肌瘤的缓解。,三、,三氧化二砷治疗血液肿瘤的研究,主要研究进展：,效应谱,淋巴细胞白血病、,淋巴瘤,骨髓瘤细胞,诱导凋亡效应的分子机制,诱导,MMP开放,线粒体跨膜电位下降,第七节,有关细胞凋亡研究的其他若干问题,一、,细胞凋亡和坏死的严格界别,在某些信号刺激下，细胞可能发生,凋亡,，也可能出现,坏死,；细胞凋亡和坏死的早期存在相似的变化；,程序化细胞死亡,和,细胞凋亡,在概念上存在混乱。,二、,Caspase在凋亡中的重要性和,Caspase非依赖细胞凋亡,细胞凋亡:,Caspase依赖,Caspase非依赖,；,Casp