瘦素对人类外周血B淋巴细胞增殖作用的影响.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,瘦素对人类外周血B淋巴细胞增殖作用的影响,简介,所谓“瘦素”，是人体分泌的一种可控制调节食欲和新陈代谢的激素。它是从人体的脂肪细胞里分裂出来的，可以抑制食物的摄入。有美国科学家道格拉斯科尔曼发现。,意义,道格拉斯科尔曼发现，极少数人食量惊人，因为他们在体内存在着瘦素基因突变，产生的瘦素太少，这种病人在接受瘦素疗法以后体重迅速下降，所以瘦素的发现让人们对肥胖症的理解和认识有了飞跃，又向着摆脱肥胖迈进了一步。由于瘦素对于治疗肥胖症有着非常好的疗效，堪称“减肥素”。,贡献,道格拉斯科尔曼曾因对瘦素的研究，与另一名科学家共同获得有“东方诺贝尔奖”之称的邵逸夫奖。他也被提名为2010年诺贝尔医学奖候选人。,一、,引言,瘦素(Leptin)是近年来发现的肥胖基因(od)所编码的一种多肽类激素，于1994年首次克隆成功1。因为瘦素是人体分泌的一种可控制调节食欲和新陈代谢的激素。它是从人体的脂肪细胞里分裂出来的，可以抑制食物的摄入，所以早期被认为参与中枢性的能量代谢调节及内分泌调节，,然而近期研究表明，Leptin对免疫系统亦有很重要的调节作用2-4。Leptin及Leptin受体的结构与细胞因子及其受体的结构具有同源性，并且在信号转导通路方面与细胞因子也有很大的相似性。结合Leptin与细胞因子、免疫细胞之间相互作用的研究，其对免疫系统具有调节作用已得到证实。,二、实验原理,本实验主要采用外周血单个核细胞分离法和直接免疫荧光法。外周血单个核细胞分离法的原理是根据外周血细胞的密度不同，利用聚蔗糖泛影葡胺细胞分层液做密度梯度离心，从而分离出单个核细胞（包括淋巴细胞核单核细胞）。,直接免疫荧光法的原理是由于B淋巴细胞特有的表面标记是膜表面免疫球蛋白（SmIg）用出接免疫荧光法检测SmIg后，可以鉴定B细胞。用荧光素标记的抗Ig抗体，在一定条件下与淋巴细胞混合，荧光标记的抗Ig抗体可以与B细胞表面的Ig结合，在荧光显微镜下观察可见B细胞膜上出现荧光。,二、实验材料,1仪器和设备 超净工作台，荧光显微镜，CO2培养箱，48孔培养板，注射器，吸管，10ml离心管，台式离心机，移液管等。,2试剂材料,21标本来源静脉肝素抗凝血(健康成人供血者提供)。,22主要试剂 重组人类瘦素，含有10FCS(Fetal Lalf Serum)的RPMI1640培养液（Roswell Park Memorial Institute 洛斯维公园纪念研究所 1640为培养基代号），淋巴细胞分离液，肝素，PBS，3%冰醋酸，0.5%台盼蓝染色，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人类Ig抗体，Hanks液等,三、实验方法,1人外周血单个核细胞分离,1.1取血加样 无菌取适量健康成人静脉血，注入肝素抗凝且加入等体积的PBS稀释；之后吸取2ml淋巴细胞分离液和4ml稀释血液注入离心管中。,1.2分离回收 与20,2000r/min离心15分钟，用毛吸管吸出灰白层单个核细胞，将之接种于含有10FCS的RPMI1540培养液的培养瓶中37孵育1小时。在37、5CO2饱和湿度培养箱培养。,2不同浓度Leptin的作用对外周血B淋巴细胞的影响,将具有增殖作用的培养细胞为别分离自6名健康成人供血者的外周血淋巴细胞，植入48孔培养板中，每孔100 ulml，分别加入不同浓度的Leptin，将之分为6组，终浓度分别0、0.1、1、10、20和40nmolL。每样本设4复孔(为取平均值，减少误差)，并用RPMI1640培养液调至200u lml每孔，37、5CO2饱和湿度培养箱培养56小时。,3.直接免疫荧光法检查B细胞膜表面免疫球蛋白,3.1稀释离心吸取1ml细胞悬液放于一试管中，加4倍量以上的Hanks液，1000rpn离心10ml，倾去上清，沉积的细胞恢复1ml容积，即为1107/ml细胞悬液。另取一试管，吸取1107/ml细胞悬液0.4ml加Hanks液3.6ml,即为1106/ml细胞悬液。,3.2离心标记 将1106/ml细胞悬液1ml加入离心管中，用台式离心机离心2000rpm,3min,弃去上清液，并加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人类Ig抗体100ul,置4冰箱30min。用Hanks液洗细胞两次，最后一次离心后去上清，滴片，用荧光显微镜观察。,3.3测得SmIg阳性细胞的百分数 观察可得落射激光下SmIg阳性细胞可见环状或斑点状荧光。用钨丝灯光源透射光照明计数同一视野内淋巴细胞总数，算出SmIg阳性细胞的百分数，并列表.,瘦素对人类外周血B淋巴细胞增殖作用的影响,4.预计结果,随着瘦素浓度的增大，SmIg阳性细胞的百分数先增高，而后平稳。说明不同浓度Leptin的作用对人类外周血B淋巴细胞有刺激增殖作用。,5结果分析,如果实验结果为随着瘦素，浓度的增大，SmIg阳性细胞的百分数没有变化（淋巴细胞总数不变），则说明瘦素对B细胞无影响；SmIg阳性细胞的百分数下降（淋巴细胞总数不变），则说明瘦素抑制B细胞的增殖；SmIg阳性细胞的百分数随瘦素增大的浓度一直升高，则说明实验浓度的选取梯度不够或太小。,此外，个体差异使得免疫功能不同，还有实验的不规范操作都会影响实验结果。,6.实验意义,近期研究表明，不论是体外激活的人外周血单核细胞，还是被艾滋病等病感染或是某些肿瘤疾病导致的免疫功能缺陷病人或低下病人的淋巴细胞中，都发现有Leptin的受体表达6.7。这一现象提示Leptin的免疫影响可能在人类自身免疫病的临床治疗中有着很重要的意义，尽管关于Leptin明确的临床应用价值目前还没有相关报道，但通过对Leptin免疫调节作用的探讨，有望找到一条治疗自身免疫性疾病的新途径。,谢谢！,