基因工程104.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,3.,基因克隆载体,(,了解基因工程中常用的三种载体所具备的特性及选择方法,),4.,目的基因的获得(,基因组文库、cDNA文库等库的构建方法和目的基因的获取途径。),.,目的基因导入受体细胞,(掌握感受态细胞制备原理，重组体导入受体细胞的方法。),6.,重组子的筛选与鉴定(,掌握重组子的各种检测方法，怎样根据试验目的确定不同的检测方法,),7,.基因工程的应用和安全性问题,2.1 基因工程,(Gene engineering),概述,A 定义：,基因工程,又叫做,基因拼接技术,或,DNA重组技术,。,是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出,人类所需要的新的生物类型和生物产品。,基础理论 和技术的发展 催生了基因工程,阅读课本第2章,1、与基因组有关的知识,生命的最小功能单位,细胞,遗传物质的载体,染色体,遗传信息的载体,DNA,遗传信息传递的传递规律,中心法则,遗传信息的基本单位,基因(gene),遗传信息的总和,基因组,遗传信息的表达,蛋白质组,生命的最小功能单位细胞,遗传物质的载体染色体,(chromosome),染色体是遗传物质的载体。人类每个体细胞内有46条(23对)染色体，其中44条(22对)为常染色体(男女共有)，2条(1对)为性染色体，其与性别有关，男性为,女性为.每条染色体由两条染色单体组成，彼此借一个着丝粒相连。每条染色单体由一个DNA(脱氧核糖核酸)分子和相关蛋白质组成。,人类染色体图示,DNA,的双螺旋结构的形成,5,3,5,3,5,3,5,3,磷酸,核糖,碱基,T-A,碱基对,C-G碱基对,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,DNA,（2nm）,核小体链（11nm，每个核小体200bp）,纤丝（30nm，每圈6个核小体）,突环（150nm，每个突环大约75000bp）,玫瑰花结（300nm，6个突环）,螺旋圈（700nm，每圈30个玫瑰花）,染色体（1400nm，,每个染色体含10个玫瑰花200bp）,遗传信息的基本单位基因（gene）,基因是在染色体上占有一定位置的遗传单位，从分子水平看，基因是DNA分子的一个片段。其储存有遗传信息，可以准确的复制，也可发生突变，并可经过转录和翻译控制蛋白质的合成，从而表达各种遗传性状。,在一种细胞内存在的全部蛋白质称为蛋白质组。在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质为功能蛋白质组(Functiond Proteome)，蛋白质组和功能蛋白质组是生命科学的新的研究内容(对象)。,基因组(genemo),蛋白质组（proteome）,基因组是指人体所有遗传信息的总和，携带有细胞或生物机体的,一整套遗传指令,的核酸量称为基因组。,遗传信息传递的中心法则,（central-dogma）,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。,多肽链,蛋白质,mRNA,DNA,DNA,转录,复制,翻译,翻译后加工,DNA序列和遗传信息,规定各种蛋白质和RNA结构的信息,规定各种基因选择性表达的信息,DNA的核苷酸序列通过mRNA规定蛋白质的氨基酸序列，同时信息的转换还要通过蛋白质以外的因子,如tRNA、核糖体等来完成,储存在DNA的精细结构中，直接表现为特定的空间结构，即“密码结构域”，通过DNA有关序列形成特异性结构与有关蛋白质因子结合来体现,顺式行为元件,反式行为元件,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,C.基本技术路线见P.16,1.1,DNA重组技术的基本工具,是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出,人类所需要的新的生物类型和生物产品,分析概念,：,工,具,为什么,要加工,什么是,表达,用什么,导入,基因操作的工具,基因的剪刀（分子手术刀）,限制性核酸内切酶（限制酶）,基因的针线（分子缝合针）,DNA连接酶,基因的运输工具（分子运输车）,运载体,到哪里去寻找这种酶,（,1）限制酶,分布：主要在原核生物中。,作用特点:专一性，识别特定核苷酸序列，切割特定切点。,结果：产生黏性未端和平末端,举例：EcoR1限制酶、Sma1限制酶,与我们学过的,DNA酶相同吗？,识别序列的特点,作用是什么,两者的区别,这两种酶切的特点,切断的是什么键,限制酶的识别特点,以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列,如：,GAA,TTC,CCC,GGG,CTT,AAG,GGG,CCC,（2）DNA连接酶,连接的部位：磷酸和脱氧核糖之间的键：,磷酸二酯键（梯子的扶手）,结果：两个相同的未端的连接。,举例：Ecoli DNA连接酶,T4 DNA连接酶,与,DNA聚合酶,相同吗,二者在性质,上的区别,（3）运载体,作用：将外源基因送入受体细胞。,具备的条件：,能在宿主细胞内复制 并稳定地保存。具有多个限制酶切点。具有某些标记基因,对受体细胞无害,举例：质粒、噬菌体,和动植物病毒。,为什么,要具备,这些条件,2.2基因工程的,基本操作程序,为什么要获得目的基因,为什么要把目的基因,与载体结合,受体细胞是指什么,为什么要进行检测,第一步：获取目的基因,方法,：,1,.从基因文库中获取目的基因。,基因文库的构建模式图,通过对,受体菌的,培养而,储存基因,第一步：获取目的基因,方法,：,1,.从基因文库中获取目的基因。,2.利用PCR技术合成DNA,PCR:,聚合酶链式反应.是以DNA变性、复制的,某些特性为原理设计的.,前提条件是必须对目的基因有一定的了解，,需要设计引物。,PCR原理图,PCR,的过程,（1）以DNA 片段作模板，在 90 高温下，分开成 为 单链DNA。,（2）以DNA 小段寡聚核苷酸做引物，在 50 的温度下，找到可以配对的正链和负链，形成互补结合,（3）在 70 高温下，合成一条与模板 DNA 单链（正链或负链）互补结合的DNA新链。,（4）以上三个步骤周而复始，即反应体系的温度从 90,o,C-50,o,C,-,75,o,C，目的基因的量不断增加,反应体系中经历：变性淬火合成重复。,结果：目的基因的量成指数形式扩增（2,n,),高温的作用是？,引物是怎样获得的？,四种脱氧核苷三磷酸（4 X dNTP),酶,高温 DNA 聚合酶,（Taq 酶），,原料,第一步：获取目的基因,方法,：,1,.从基因文库中获取目的基因。,2.利用PCR技术合成DNA,3.mRNA差异显示法获得目的基因（反转录）,由mRNA反转录形成cDNA,mRNA DNA单链,DNA单链 RNA DNA杂交分子,RNA DNA杂交分子 单链DNA,单链DNA 双链DNA,逆转录,使RNA降解,复制,核酸酶H,?,?,形成氢键,第一步：获取目的基因,方法,：,1,.从基因文库中获取目的基因。,2.利用PCR技术合成DNA,3.mRNA差异显示法获得目的基因（反转录）,4.采用DNA合成仪人工合成长度不是很大的DNA片段。,5.用机械的方法，如超声波把打成片段。,原核生物基因表达的调 控,乳糖代谢基因表达调控图解：(有乳糖时),lac,Z,lac,Y,lac,A,调节基 因,启动 子,操纵基 因,结构基 因,RNA聚合酶,信使 RNA,转 录,翻 译,阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与 操纵基因结合，使得结构基因进行转录。,阻抑 物,乳糖,转 录,半乳糖苷酶,酶,酶,第二步：基因表达载体的构建,核心,目的基因与载体结合成为重组基因,需要,哪两种,工具,总结：表达载体需由哪几部分组成,复制原点,启动子,目的基因,终止子,标记基因,它们的作用是？,第三步：将目的基因导入受体细胞,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,什么叫转化,常用的转化方法有哪些？,具体过程？,第四步：目的基因的检测与鉴定,首先：,其次：,最后：,还要：,检测与鉴定哪些环节,具体,方法？,DNA分子杂交技术,基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。,满足：（1）必须是单链，（2）带有容易被检测出来的标记物。,编码区上游,编码区下游,RNA聚合,酶结合位点,RNA聚合,酶结合位点,编码,蛋白质,调控,调控,原核细胞,真核细胞,真核细胞,2、3 基因工程的应用,转基因生物,目的基因,目的基因来源,抗虫植物,Bt毒蛋白基因,苏云金芽胞杆菌,（如：抗虫,蛋白酶抑制剂基因,植物,棉）,淀粉酶抑制剂基因,植物凝集素基因,抗病植物,病毒外壳蛋白基因,（如：转基,病毒的复制酶基因,因烟草）,几丁质酶基因,请继续把表格完成,抗逆转基因植物,抗冻蛋白基因,鱼,抗除草剂基因,转基因玉米,富含赖氨酸的蛋白质编码基因,转基因延熟番茄,控制番茄果实成熟的基因,转基因矮牵牛,植物花青素代谢有关的基因,转基因鲤鱼,外源生长激素基因,人,转基因牛,肠乳糖酶基因,人,转基因牛（羊）,抗凝血酶基因、血清白蛋白基因、生长激素基因、a-抗胰蛋白酶,转基因烟草,发光基因,萤火虫,工程菌,细胞因子、抗体、疫苗、激素、白细胞介素-2、干扰素、乙肝疫苗,基因治疗,腺苷酸脱氨酶基因,功能正常的基因,反义基因,自杀基因,器官移植的供体动物,被导入某种调节因子的器官供体基因组,创造新生物，并给新生物特殊功能的过程,基因工程,基因工程与,建筑工程,制造稀少珍贵的蛋白质药物,1982,年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品,人胰岛素投放市场,，,它标志,着,基因工程产品正式进入到商业化阶段,人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、,-,干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素,-2,、集落刺激因子、乙肝疫苗等等,转基因植物,转基因农作物,转基因蔬菜,转基因果树,转基因花卉,转基因草类,转基因林木,1983年世界上第一个问世的转基因植物就是抗除草剂烟草。全球第一个被批准商业化的转基因植物是番茄。,转基因动物,转基因鱼,转“全鱼”GH基因黄河鲤（左）及其对照鱼图片,转基因鱼,国大生物系宫知远博士花了4年时间研究转基因鱼。他的做法是把来自水母的绿荧光蛋白基因和海葵的红荧光蛋白基因，注射入斑马鱼的早期胚胎。,转基因蚕,图为转基因蚕所结出的荧光茧和从茧中抽取的生丝,转基因蝴蝶,美,University at Buffalo,的科学家研制出世界上第一只转基因蝴蝶,(,图,),有意思的是，这只蝴蝶的一些基因是,来自水母,的。,世界上首例转基因灵长类动物转基因猴“安迪”,00月日出生名叫安迪的小猴目前健康地生活在俄勒岗保健科学大学的实验室里。,只猴子的卵母细胞,个转基因卵母细胞进行人工受精植入只代孕猴妈妈的子宫中，结果有只猴妈怀孕,只小猴夭折，一只未获成功.,种植业中的应用,抗,化学除草剂基因,转基因西红柿,固氮酶基因,人类,DNA,环境保护等等,转基因番茄,转基因胡萝卜,德国吉森大学的研究人员从实用角度考虑，选择了种植简单、贮存方便的胡萝卜作为载体，,将乙肝病毒的表面蛋白基因注入胡萝卜基因,同时通过一种催化剂提高胡萝卜基因中乙肝病毒蛋白的浓度。,畜牧业中的应用,动物疫苗、生长激素等,医药中的应用,例：,从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物,tPA(,组织型纤溶酶原激活剂,tPA,),思考题,Thank You for,Your Attention!,