食品中大肠菌群的检验培训课件.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,食品中大肠菌群的检验,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,食品中大肠菌群的检验,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,食品中大肠菌群的检验,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,食品中大肠菌群的检验,*,食品中大肠菌群的检验,1.食品微生物检验的意义,有害微生物对人类和生产的影响：,引起食品变质,引起食物中毒,导致人体患病,2,食品中大肠菌群的检验,1.食品微生物检验的意义,是衡量食品卫生质量的重要指标,也是判定被检食品能否食用的科学依据,可以判断食品加工环境及食品卫生的情况,为卫生管理工作提供科学依据,可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生,保证产品的质量,避免不,必要的损失,3,食品中大肠菌群的检验,生产环境的检验,原辅料的检验,食品加工、储藏、销售,储环节的检验,食品的检验,2.食品微生物检验的范围,4,食品中大肠菌群的检验,3.食品卫生标准中的微生物指标,指示菌,概念:在常规安全卫生监测中，用以指示检样卫生状况及安全性的指示性微生物,类型：一般性、特定性（如粪便污染）、其他,项目：菌落总数、大肠菌群、耐热大肠菌群、总大肠菌群,食源性致病菌及其毒素,沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、致病性大肠埃希氏菌等,霉菌酵母菌及其毒素,黄曲霉毒素B1、B2等,其他项目,抗生素残留、beta-内酰胺酶、,商业无菌等,5,食品中大肠菌群的检验,商业无菌,概念：罐头食品经过适度的杀菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物。这种状态叫做商业无菌。,保温：,低酸性罐头食品36，10天,酸性罐头食品30 1，10天,预定输往热带地区的低酸性食品55 1，57天,每日检查 是否胖听、泄露,开罐,留样pH测定感官检查涂片染色接种,6,食品中大肠菌群的检验,4.常用仪器设备,4.0 光学显微镜,4.1 培养箱,4.2 水浴箱,7,食品中大肠菌群的检验,4.常用仪器设备,4.3 超净工作台：侧流式、直流式和外流式,4.4 干燥箱,4.5 高压蒸汽灭菌器,8,食品中大肠菌群的检验,4.常用仪器设备,4.6 离心机,4.7 滤菌器,4.8 均质器（匀浆器）,4.9 冰箱,9,食品中大肠菌群的检验,4.常用仪器设备,玻璃器材及其他,试管,三角烧瓶,烧杯,玻璃棒,培养皿,接种环,涂布棒,酒精灯,移液管,移液器,剪刀、镊子,试管架,10,食品中大肠菌群的检验,一、实验目的,1.了解大肠菌群在食品检验中的意义。,2.掌握检验的程序和步骤。,3.通过MPN检索表的检索得出实验结果。,11,食品中大肠菌群的检验,二、基本原理,大肠菌群系指一群在3237下24h内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。具有广泛的卫生学意义。,12,食品中大肠菌群的检验,大肠菌群的食品卫生学意义,作为粪便污染食品的指标菌，MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低,作为肠道致病菌污染食品的指针，大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系,要求食品中大肠菌群完全不存,在是不可能的，重要的是其污染,程度即菌量,13,食品中大肠菌群的检验,产气克雷白氏菌,ETEC,EIEC,阴沟肠杆菌,EHEC,大肠菌群,耐热大肠菌群（粪大肠菌群）,大肠杆菌,产气克雷白氏菌,大肠埃希氏菌,柠檬酸杆菌,O157：H7,大肠杆菌,是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染。,大肠菌群,并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。,总大肠菌群,系指一群在37培养24小时能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。,耐热大肠菌群,即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。,致病性大肠杆菌,能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）等。,O157:H7（EHEC),肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。,大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系,14,食品中大肠菌群的检验,GB 4789.3-2010 大肠菌群计数,第一法：大肠菌群MPN计数法,第二法：大肠菌群平板计数法,三、检测方法,15,食品中大肠菌群的检验,第一法：大肠菌群MPN计数法,16,食品中大肠菌群的检验,大肠菌群计数检验流程,0,将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤,LST不产气（-）,小导管里无气泡,LST产气（+）,17,食品中大肠菌群的检验,需要用到的培养基,（1）LST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨,成分：,胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL 5.0g，乳糖5.0g，K,2,HPO,4,2.75g，KH,2,PO,4,2.75g，月桂基硫酸钠0.1g，蒸馏水1000mL。,制法：,将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm150mm试管中，每管10mL。121高压灭菌15min。最终pH6.80.2。,18,食品中大肠菌群的检验,（2）BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤,成分：,蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛胆粉溶液200mL，0.1%煌绿水溶液13.3mL，蒸馏水800mL，pH7.20.1。,制法：略,19,食品中大肠菌群的检验,抑菌剂的选择,大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。,抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。,抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。,20,食品中大肠菌群的检验,4）初发酵试验,每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），361 培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。,22,食品中大肠菌群的检验,LST结果判断,大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。,23,食品中大肠菌群的检验,5）复发酵试验,用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 1培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。,24,食品中大肠菌群的检验,6）大肠菌群最可能数（MPN）的报告,按5）确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。,25,食品中大肠菌群的检验,表B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表,26,食品中大肠菌群的检验,第二法：大肠菌群平板计数法,27,食品中大肠菌群的检验,28,食品中大肠菌群的检验,需要用到的培养基,（1）VRBA：结晶紫中性红胆盐琼脂,成分：蛋白胨7.0g，酵母膏3.0g，乳糖10.0g，氯化钠5.0g，胆盐或3号胆盐1.5g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g18g，蒸馏水1000mL，pH7.4,0.1,29,食品中大肠菌群的检验,1）样品的稀释,：如第一法,2）平板计数,选取2个3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。,3）及时将15 mL20 mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 1 培养18 h24 h。,实验步骤及操作要点：,30,食品中大肠菌群的检验,4）平板菌落数的选择,选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。,典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。,31,食品中大肠菌群的检验,5）证实试验,从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 1 培养24 h48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。,32,食品中大肠菌群的检验,6）大肠菌群平板计数的报告,经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。,例：10,-4,样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/1010,4,/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。,33,食品中大肠菌群的检验,三 大肠菌群Petrifilm,TM,测试纸片法,34,食品中大肠菌群的检验,四、美国FDA标准方法,行业标准采用两步法：,用于对出口食品中大肠菌群进行检验,推测试验,证实试验,样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤发酵管。361培养482h，观察是否产气。,将产气发酵管培养物转种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤中，,36,1,培养,482h,，,观察是否产气,。,以BGLB产气为阳性，查,MPN,表，报告每,ml,（,g,）样品中大肠菌群的,MPN,值。,35,食品中大肠菌群的检验,思考题,1,大肠菌群的检验分哪几个步骤？各有何作用？,2,在糖发酵试验中，若发现发酵倒管内存在极微小的气泡，这种情况可否算作产气阳性？,3,造成本实验误差的主要原因有哪些？,36,食品中大肠菌群的检验,