新技术在医学实验中的应用课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,新技术在医学实验中的应用,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,新技术在医学实验中的应用,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,新技术在医学实验中的应用,新技术在医学实验中的应用,内容提纲,一实验方法介绍,检测蛋白表达水平方法：,Western blot,2D-gel,免疫共沉淀，,Shotgun,，免疫组化，流式细胞测定，,激光扫描共聚焦显微,，绿荧光蛋白标记法，萤光素酶标记法，,ELISA,.,检测,DNA/RNA,表达水平方法：,Southern blot,Northern blot,原位杂交,PCR,.,基因操作方法:基因敲除，基因沉默,.,2,新技术在医学实验中的应用,内容提纲,二实用技术介绍,细胞活性检测：,MTT,MTS，,CCK-8,Calcein-AM,.,细胞凋亡检测：,Western blot,流式，,TUNEL,Hoechst 33258，DNA ladder,.,活性氧自由基（,ROS,）检测：,DCF,SOD,GSH,ESR,.,3,新技术在医学实验中的应用,Western blot,原理：,Western blot,利用了蛋白质的理化性质。在一定,pH,的缓冲液中，特定的蛋白质具有固定的电荷数。在电场的作用下，蛋白质将按,电荷数,及,蛋白质分子量大小,在凝胶中分布。,SDS-PAGE,法的,Western blot,进一步简化，,SDS,的应用使得所有的蛋白都带均匀的负电荷，此时蛋白电泳的距离只与,蛋白分子量大小,有关。,4,新技术在医学实验中的应用,Western blot,原理：,凝胶是由聚,丙烯酰胺组成，聚丙烯酰胺的浓度决定了胶中孔径的大小，孔径越大，蛋白运动越容易，越快，对大分子量的蛋白的分离效果好。反之亦然。测定大分子量蛋白（,）时宜用,低浓度,胶，测定小分子量蛋白（,）时宜用,高浓度,胶。另有梯度胶（例如），可以保证在一定范围内的蛋白都相对均匀分离。,5,新技术在医学实验中的应用,转膜方法主要分为湿转,(Wet transfer),和半干转（,Semi-dry transfer,）。湿转速度较慢，操作难度较大，易出现气泡，但转膜效率高，特别对大分子量蛋白效果好。半干转的特点与湿转正好相反，对大分子量蛋白容易转不上。,根据实际情况选择。,6,新技术在医学实验中的应用,7,新技术在医学实验中的应用,Western blot,电泳完成后，蛋白质被转移到固相载体（,NC,膜或者,PVDF,膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。膜上的非特异性结合位点需使用脱脂牛奶等封闭，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶,同位素或者荧光标记的第二抗体起反应，经过底物显色,放射自显影或荧光成像以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,8,新技术在医学实验中的应用,示例实验步骤：,蛋白质抽提,蛋白浓度测定：,按试剂盒说明书，用,BCA,法测定蛋白浓度。,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,(,SDS-PAGE,),：,玻璃板夹槽中依次加入分离胶和浓缩胶，待其凝固；根据浓度取适量待测蛋白与,5x,上样缓冲液混匀后,95,度变性,10,分钟,加入上样孔中，浸于电泳缓冲液，以,75V,（浓缩胶）及,120V,（分离胶）恒压电泳。,转膜：,裁切与凝胶同样大小的,NC,膜和滤纸，,NC,膜置于转膜缓冲液中浸泡,30min,以上。按顺序依次放置滤纸、凝胶、,NC,膜、滤纸，半干法以,40mA,恒流转膜,2 h,。,9,新技术在医学实验中的应用,抗原抗体反应,:,蛋白质以脱脂牛奶封闭,1h,后，与一抗,4,孵育过夜，与二抗室温孵育,1h,，,TBST,洗涤,4,次，每次,5min,。,显色,:,加入,DAB,显色,5min,，蒸馏水洗终止显色。凝胶分析软件,Quantity one,测灰度值。,显色系统多种多样。传统的二抗通常是与辣根过氧化酶结合的抗体，遇,DAB,显色或者与专用试剂盒试剂反应使胶片曝光。新型二抗与荧光物质结合，在专用的荧光成像仪下读取荧光印迹，可以方便地进行多通道,western blot(multiplex western blotting),免去切膜或者抗体清除的步骤,.,10,新技术在医学实验中的应用,2D-Gel,11,新技术在医学实验中的应用,免疫共沉淀,是一种着重检测蛋白-蛋白或蛋白,-,核酸间联系的方法。,基本原理是利用抗原抗体结合,以及与抗体相连的小珠（,Beads,）,以物理方式将目标蛋白连同与其相结合的物质分离出来单独分析。,分离后，解离蛋白，以,Western blot,的方式检测潜在目标的水平，即可得知目标间在细胞中是否有紧密联系。,12,新技术在医学实验中的应用,免疫共沉淀,13,新技术在医学实验中的应用,Chromatin immunoprecipitation（CHIP）,染色质免疫沉淀，与蛋白的共沉淀相似，不同之处是利用甲醛等产生,DNA,与其上蛋白质的交联，从而用带小珠的抗体将蛋白质与,DNA,一起“拉下”，用,PCR,检测拉下的,DNA.,14,新技术在医学实验中的应用,“猎枪”法,（,Shotgun proteomic,）,15,新技术在医学实验中的应用,免疫组化,Immunohistochemistry,原理类似,Western blot,，但直接在组织切片（或在满足一定条件的情况下，整个组织）上进行，保留了原始组织结构，能提供更多的信息。,缺点：费时，目标蛋白表达不高时不易检测到，量化统计不易。,16,新技术在医学实验中的应用,17,新技术在医学实验中的应用,18,新技术在医学实验中的应用,免疫组化样本制备,通常来讲，免疫组化用的样本为组织切片（几微米厚）.,足够小且能被完全通透化（,Permeabilize,)的组织可以直接做在位免疫组化，但应用不如原位杂交来得广泛。,冷冻切片信号较好，但受时间，地点，存放条件等限制。石蜡切片具有储存，使用方便等优点，但需要抗原修复方可进行免疫组化染色，且效果一般差于冷冻切片。,19,新技术在医学实验中的应用,免疫组化的抗体使用,免疫组化中使用的一抗通常与,Western blot,中用的相同。,二抗被设计成与一抗的宿主结合的抗体，一般结合有探测用分子，免疫组化中常用的是生物素（,biotin,）。,一抗宿主一般不能与实验所用组织同种，但必要时也有专用试剂可以允许这种应用 例子：,MOM,（,Mouse on Mouse,),Kit,。,20,新技术在医学实验中的应用,不同的探测方法,直接探测法：直接标记一抗，不需使用二抗来探测目标蛋白表达水平，最简单但敏感度最差，基本已不用。,间接探测法：一抗没有标记，然后用抗一抗的二抗来间接探测目标蛋白表达水平。有信号放大作用，敏感度好，节省试剂。,21,新技术在医学实验中的应用,间接探测法介绍：,PAP,法,PAP:peroxidase anti-peroxidase method,PAP,法使用未标记的一抗和二抗，之后加入第三层的探针：,peroxidase,及其抗体，且抗体的抗原性与一抗相同，都与二抗相结合。如此以二抗为中心形成“三明治”结构。,22,新技术在医学实验中的应用,Avidin-Biotin Complex(ABC),法,免疫组化最常用方法之一。,也是形成,“,三明治,”,样结构，使用未标记的一抗，生物素（,biotin,）标记的二抗，生物素标记的,peroxidase,以及生物素结合蛋白（,Avidin,）。,需要封闭内源性的,peroxidase,。,必要时，封闭内源性,的,biotin,。,23,新技术在医学实验中的应用,Labeled Streptavidin Biotin(LSAB),法,与,ABC,法相似，但使用,Strptavidin,替换一般的生物素结合蛋白，其与组织的非特异性结合较少，因此可以降低背景。,24,新技术在医学实验中的应用,25,新技术在医学实验中的应用,免疫组化中的注意要点,样本的准备,封闭（非特异性蛋白质结合位点，内源性的,peroxidase,，内源性的,biotin,）,抗体浓度,培养温度,显色时间,26,新技术在医学实验中的应用,流式细胞仪,1,实验原理,:,流式细胞仪,(Flow Cytometer),是采用流式细胞技术对细胞或颗粒悬液进行快速分析的自动化分析仪器。流式细胞术（,Flow Cytometry),是上世纪,70,年代发展起来的一项新技术。它通过对流动液体中排成单列的细胞或颗粒进行逐个分析、测定细胞或颗粒的光散射和荧光情况，以获得其大小、内部结构、,DNA,、,RNA,、蛋白质、抗原等物理或化学特征。,要求细胞悬浮在培养基中。对于贴壁细胞，需要先将其游离出来，有一定损伤。,27,新技术在医学实验中的应用,流式细胞仪应用举例,细胞凋亡、死亡的检测,-,Annexin V/PI,双染色法,1,原理,细胞凋亡的早期生化特征之一是氨基磷脂转移酶活性的降低使磷脂酰丝氨酸,(Phosphatdylserine),“,翻到”细胞膜的外层。荧光标记,Annexin V-FITC(AV),和碘化丙啶,(propidum iodide,PI),双染可区分细胞凋亡和坏死,对,AV,和,PI,均不染色的是正常细胞,对,AV,染色对,PI,不染色的为早期凋亡细胞,对,AV,和,PI,均染色的为晚期凋亡细胞或坏死细胞。,2,结果判断,凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如,PI,有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的,DNA,可被,PI,着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期,PI,不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（,FITC-/PI-,）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（,FITC+/PI+,）；而右下象限为凋亡细胞，显现（,FITC+/PI-,）。,28,新技术在医学实验中的应用,29,新技术在医学实验中的应用,Ca2+i,的检测,Fluo-3-AM,荧光 染色,原理,用荧光探针,Fluo-3-AM,进入细胞后经非特异性酯酶水解为,Fluo-3,后者是钙离子螯合剂,与钙离子形成的复合物经紫外激发可产生荧光,流式细胞仪通过检测其荧光强度而间接反映胞内游离钙水平。,人参皂苷,(saponin),降低缺氧的心肌细胞中的钙超载,。,Li et al.The saponin of red ginseng protects the cardiac myocytes against ischemic injury in vitro and in vivo,Phytomedicine,19(6)477-483,30,新技术在医学实验中的应用,线粒体膜电位（,）的测定,rhodanmine 123,荧光染色,原理,氧化刺激诱导细胞凋亡可致线粒体两种功能改变,:,一是线粒体膜电位降低和线粒体通透性孔开放,二是线粒体产生活性氧。线粒体对,rhodanmine 123,的摄取依赖其膜电位,分析,rhodanmine 123,的荧光强度可反映线粒体的膜电位。,Black:control,Purple:UVB model,Yellow:UVB+0.25%PCF,Red:UVB+0.5%PCF,Blue:UVB+1%PCF,Green:UVB+0.1%VitC.,31,新技术在医学实验中的应用,激光扫描共聚焦显微,(,Confocal Laser Scanning Microscopy,，,CLSM,）,1,基本原理,激光共聚焦显微镜是近年来发展起来的一种结合激光扫描、计算机自动分析与显微镜技术的新技术，新仪器。它采用计算机自动定量分析被激光扫,描的物体所激发出的荧光数量的变化，具有图像清晰、特异性高、敏感性强、可精确定量等优点。,2,优点,激光共聚焦显微镜做间接免疫荧光组化染色并做定量分析，利用激光聚焦荧光标记和系统软件分析对组织进行深层与断层扫描，不破坏组织细胞的结构，可准确深层次定位和精确定量，是转化了的精确定量分析。,32,新技术在医学实验中的应用,激光共聚焦显微镜一般都有,2,个以上不同波长的激光管，因此只要将标本标记上不同波长的荧光，就可以在同一张切片上同时分析,2,种或更多不同指标的变化，并比较它们之间的比值变化，方便而精确。,激光共聚焦显微镜可以根据科研需要，提供纯荧光、白光、以及荧光与白光合成的图像等多种图像。,以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，如用石蜡切片做免疫荧光染色，在普通荧光显微镜下观察，常因背景非特异性荧光过强而影响观察结果。但如用激光共聚焦显微镜扫描石蜡切片的荧光染色，可获得清晰的图像。,33,新技术在医学实验中的应用,3,应用,定性定量定位荧光分析,:,CLSM,可对单、双或三色标记的细胞及组织标本的荧光进行定性定量定位分析，还可测定膜电位和配体结合等生化反应程度。,Ca,2,和,pH,等细胞内离子的实时定量测定,:,利用,Fluo-3,、,Fura2,等荧光探针，,CLSM,可以测定,Ca,2,在活细胞内的浓度变化。,CLSM,可测定单个或一群细胞内的,ca2,浓度，并提供细胞内,Ca,2,分布的二维及至三维图像。另外，如果对细胞施加外部的刺激，,CLSM,就能观察到细胞内各点的,Ca,2,浓度在外部刺激下随时间而产生的变化。这对于研究,Ca,2,等离子细胞内动力学有意义。利用,SNAFL,类探针可对单个或一群细胞内的,pH,及细胞内,pH,的变化进行测定。使用双荧光探针,Fluo,一,3,和,CNARF,可进行,Ca,2,和,pH,同时测定。,细胞的物理化学动态监测：,CLSM,可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗粒数等参数进行自动测定，能对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、,DNA,、,RNA,、酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及分布进行定量、定性、定时及定位测定。,34,新技术在医学实验中的应用,药理研究中的应用：,CLSM,可直接观察药物在细胞内亚细胞水平的分布，并可了解药物对细胞内结,构的特殊亲和力及其药物作用，从而推断细胞内药物定位及细胞耐药的相关机制，还可了解其在细胞内代谢的过程。,例,CLSM,可直接观察扇贝多肽（,PCF,）在细胞的定位。,异硫氰酸荧光素（,FITC,）标记,PCF,，显微镜下确定,PCF,作用位点在细胞膜上。,图,3 PCF,保护,HaCaT,细胞的最初作用靶点,35,新技术在医学实验中的应用,激光显微细胞外科技术：,CLSM,可将激光作为,“,光子刀,”,使用，完成诸如细胞膜瞬间穿孔，线粒体、溶酶体等细胞器烧灼，染色体精确切割和神经元突起切除等一系列细胞外科术。,在亚细胞定位研究中的应用：,经荧光探针标记细胞器，,CLSM,可探测光敏剂和探针荧光图像，实现对光敏剂在细胞内的亚细胞定位，并进行定性和定量分析。,在药物抗肿瘤活性研究中的应用：,利用,CLSM,观察细胞形态，记录细胞的荧光程度，以细胞的荧光程度反映,DNA,的含量，从而判断药物的抗癌活性。,在释药过程研究中的应用：,由于,CLSM,的实时观测能力，可对控释药物的释药过程中药物损耗变化进行观察。,4,缺点：,不能观察到大部分的膜结构特征，尤其是,ultra filtration,膜结构。,成像质量与扫描速度始终是一对矛盾。,扫描过程耗时较长，且只能扫描不动的微生物，许多活动的大型微生物因运动比较剧烈而对成像造成一定影响。,某些荧光染料可能会对某些活体细胞的活性造成一定的负面影响，因此宜选择合适的荧光染料，同时适当地调整激光的光强，宜用最弱的光对标本进行照射扫描。,36,新技术在医学实验中的应用,Reporter Assay,为检测特定基因能否在目标生物体内表达及表达水平，,Reporter assay,常被使用。,Promoter,Target Gene,Reporter Gene,Promoter,Target Gene Products,Reporter Products,Easy Detection,37,新技术在医学实验中的应用,绿荧光蛋白标记,Osamu Shimomura,Martin Chalfie,及,Roger Tsien,于,2008,年因绿荧光蛋白的发现，获诺贝尔化学奖。,38,新技术在医学实验中的应用,荧光素酶标记,39,新技术在医学实验中的应用,直接,ELISA,:,直接使用酶标记的一抗探测固定的抗原。最为简单，避免二抗可能的交叉反应，但敏感性较差，需要大量昂贵的标记抗体。,间接,ELISA,:不直接标记一抗，而是标记抗一抗的二抗。信号可以被有效放大，且一抗免疫活性不会受标记的影响。但二抗可能发生交叉反应。,“,三明治,”,ELISA,:,先在盘中固定一层捕获抗体（,Capture antibody,），以之将目标抗原捕获，之后再使用一层标记的探测抗体。两种抗体必须小心选择以避免相互之间的反应。此法不需纯化抗原，同时具有极高的敏感性和特异性。但对抗原有要求：至少有两个结合位点。,竞争性,ELISA,:,样本和纯化并事先固定的目标抗原对标记的抗体进行竞争，如果样本中存在目标抗原，最终得到的信号就会下降。此法可用于不纯的样本，重复性可靠，但敏感性和特异性都较低。,ELISA,（,Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,酶联免疫吸附试验,）,40,新技术在医学实验中的应用,ELISA,（,Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,酶联免疫吸附试验,）,41,新技术在医学实验中的应用,酶标仪,1,原理,酶标仪（,Microplate Reader,）是对用专用反应盘进行的，建立在吸光度改变基础上的各种实验进行读取的设备，因其主要用途之一是读取,酶联免疫吸附试验结果而得名。但其也可读取其他实验结果，如蛋白定量，各种酶活性检测，,MTT,等。,新式酶标仪除读取一般吸光度外，还可以读取荧光数据：实验者指定激发光波长及放射光波长，带荧光读取功能的酶标仪即可读取该数据。同时还有的酶标仪带加温，,振荡，定时重复读取等等功能，极大,地方便了实验。,42,新技术在医学实验中的应用,Southern Blotting,43,新技术在医学实验中的应用,Edwin Southern,Southern Blotting,的发明者。左图为他在,Nature,上关于,Southern Blotting,的文章中的例图。,44,新技术在医学实验中的应用,Northern Blotting,45,新技术在医学实验中的应用,In situ hybridization,(,原位杂交技术,),1,原理,原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。,46,新技术在医学实验中的应用,47,新技术在医学实验中的应用,举例：原位杂交检测,p21,mRNA,将用,DEPC,处理后的无菌盖玻片（细胞飞片）置入,6,孔培养板中，接种细胞于孔内，,37,、,5%,CO2,培养至细胞,80,融合，处理同,1.2,细胞培养。将细胞飞片用中性树胶粘于载玻片上，,4,多聚甲醛固定,20 min,，,PBS,洗,5 min2,次，系列酒精脱水。蛋白酶,K,消化细胞，经,PBS,清洗，多聚甲醛固定及酒精系列脱水后于,37,用不含探针的杂交液预杂交,45 min,。加入含探针,90,gL-1,的杂交液，置于密闭湿盒中，,60,过夜。杂交结束后，,NBT,显色，中性树胶封片。,48,新技术在医学实验中的应用,49,新技术在医学实验中的应用,PCR(Polymerase Chain Reaction),聚合酶链式反应，是研究工作中最常用到的技术之一。,50,新技术在医学实验中的应用,Taq DNA,聚合酶,在黄石国家公园沸泉的耐热细菌中发现并分离，在,72,摄氏度下可正常反应，高达,95,摄氏度的情况下仍不变性，是,PCR,反应得以进行的基础。,现代技术已经在此基础上发展出多种改良型的耐高温,DNA,聚合酶，使反应效率提升，反应条件要求降低。,51,新技术在医学实验中的应用,PCR,条件,DNA,聚合酶。,反应所需模板（,Template,），,DNA,分子。,反应所需引物（,Primer,），两个方向。,反应所需原料（,dNTPs,）。,适宜的缓冲液。,适宜的反应温度。,Real-time PCR,还需要荧光染料。,目前很多试剂厂商以,“,Master Mix,”,的形式提供,PCR,试剂，极大地方便了实验。,52,新技术在医学实验中的应用,PCR,的分类,以,DNA,为起始点的,PCR,（目的为大量复制扩增目标基因）,。,以,RNA,为起始点的,PCR,（,RT-PCR,，目的为检测目标基因表达强度），其又可分为一般的,RT-PCR,和,Real-,t,ime RT-PCR,。,53,新技术在医学实验中的应用,RT-PCR,的一般步骤,1.,RNA,的抽提,经典的方法是利用,RNA,在酒精中溶解度低使之析出。较新的,RNA,抽提试剂盒在此基础上利用了能特异性与,RNA,结合的微型分离柱，大大提高,RNA,产率和纯度。,2.,检测,RNA,质量和浓度,比色法检测,OD,260/280,和,OD,260/230,，前者在,DNA,应该为,1.8,而,RNA,应该为,2,左右，后者应该在,2.0-2.2,左右,.,Nanodrop,仪器可用极小量样本作快捷而相对准确的检测。,54,新技术在医学实验中的应用,RT-PCR,的一般步骤,3.,逆转录。一般应用试剂盒进行，将逆转录酶，,mRNA,逆转录引物及相应的原料，缓冲液等与抽提到的,RNA,混合，在适宜温度下，从,RNA,逆转录得到,cDNA,。,4.,PCR,反应。将,PCR,各原料，引物及模板混合后，在,PCR,仪上进行反应。如为一般,RT-PCR,，反应结束后取产物电泳，,EB,染色后凝胶成像分析，如为,Real-time PCR,，反应结束后直接取数据分析即可。,55,新技术在医学实验中的应用,半定量,RT-PCR,直接完成指定周期数的,PCR,反应后，以电泳及,EB,染色法确定终产物的量。,优点：不需特别试剂和仪器，成本低廉。,缺点：检测的敏感度较差，实验步骤较繁琐，且涉及有毒试剂,EB,的使用。,56,新技术在医学实验中的应用,Real-Time PCR,借助与双链,DNA,特异性结合发出荧光的特殊染料（如,SYBR Green,），在每一个,PCR,周期完成后都读取一次产物的量，可以得到实时的,PCR,产物扩增的数量并较精确地定量分析。,优点：反应敏感度好，,CT(Cycle threshold),值的测定避免了非线性扩增对结果的干扰。,缺点：需要专用,PCR,仪器，器材及试剂价格较昂贵。,57,新技术在医学实验中的应用,Real-Time PCR,示例,注意在使用,SYBR Green,为基础的,Real-time PCR,时要检测熔化曲线以确定得到的是单一产物。,58,新技术在医学实验中的应用,PCR,易出现的问题,产物错误：引物设计不佳,/,结合温度有误,/,存在污染,/,镁离子浓度不当。,无产物：引物设计不当或引物数量不足,/,存在干扰反应物质,/,污染,/,实验方法或设备问题。,多重产物：结合温度设置太低,/,镁离子浓度不当,/,引物过多或生成引物二聚体,/,外来,DNA,污染。,59,新技术在医学实验中的应用,多重产物及解决实例,左上为多重产物实例。可以看到虽然只加入一种引物，此反应却生成了两种产物。,调整实验条件（主要是结合温度）后，同一反应得到均一产物。,60,新技术在医学实验中的应用,Microarray,61,新技术在医学实验中的应用,基因敲除,经典的基因敲除法（,Knockout,），将目标基因替换为一个外源性的基因（常用耐新霉素基因以方便筛选细胞），从而敲除目标基因。相对来讲，经典基因敲除法较为简单。但有一些不足之处，如有的基因敲除就无法让动物生存，有的会被代偿等。,62,新技术在医学实验中的应用,条件敲除（,Conditional Knockout,）一般是靠,Cre-LoxP/FLP-Frt,重组系统来完成，目标基因上被加入,LoxP,或,Frt,元素，带有,LoxP,的小鼠与在某些组织上特异性表达,Cre,（或者,Flp,）的小鼠交配，后代的特定器官上的该基因即被敲除。易导致错位翻译。,63,新技术在医学实验中的应用,四环素控制的条件基因表达/沉默：转录的激活子（,Transactivator,）,rTA,，在无四环素存在的前提下，能与一个特别定制的操纵子,tet-O,结合，激活下游目标基因的表达，而四环素（如多西环素）的应用将使此激活子与四环素结合，迅速中止目标基因的表达。,64,新技术在医学实验中的应用,RNA,干扰,1,原理：,近年来的研究表明，将与,mRNA,对应的正义,RNA,和反义,RNA,组成的双链,RNA(dsRNA),导入细胞，可以使,mRNA,发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制,(post-transcriptional gene silencing,PTGS),被称为,RNA,干扰（,RNAi,）。,2,小的干涉,RNA,（,siRNA,）：,是在,RNA,干涉过程中人工体外合成的小片段,RNA,，,由,19-21,个碱基对的核心部分和每条链上,2,个悬挂的核苷酸组成。,3,应用：,研究信号传导通路和基因功能,RNAi,能够在哺乳动物中降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间，控制基因表达的部位。开展基因治疗的新途径 一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的,dsRNA,分子，只注射一种,dsRNA,即可以产生多个基因表达同时降低的表现，也可同时注射多种,dsRNA,而将多个序列不相关的基因同时剔除。为治疗多基因调控的肿瘤疾病，带来新的治疗策略。,65,新技术在医学实验中的应用,66,新技术在医学实验中的应用,Fas,干扰实验设计,空白对照组、,UVB,模型组、,UVB,试剂对照组,(,不加,siRNA,仅加入转染试剂,),、,UVB,siRNA,组,接种细胞至,6,孔板,让其在有血清无抗生素的培养基中生长，,使得转染时细胞融合度达,60%,80%,转染,siRNA,组每孔加入,800L,转染复合物,8L siRNA,溶于,100L,转染培养基,8L siRNA,转染试剂溶于,100L,转染培养基,67,新技术在医学实验中的应用,37,、,5%CO2,孵育,5,7h,去除转染复合物，,更换含,10%,小牛血清的正常培养基,37,、,5%CO2,细胞培养箱中孵育,18,24h,转染,48h,后进行,UVB,照射,30min,干扰效率的检测,RT-PCR,干扰后,Fas mRNA,的表达检测水平,Western blot,检测干扰后,Fas,蛋白的表达水平,68,新技术在医学实验中的应用,常用实验技术介绍,69,新技术在医学实验中的应用,细胞活性,（,Cell Viability,）,检测,检测样本中活细胞的相对数量。最为常用的实验手段之一，在抑瘤，毒理，细胞保护等实验中都必不可少。,MTT,MTS,CCK8,Calcein-AM,染色,PI,染色,Trypan Blue,染色,70,新技术在医学实验中的应用,MTT,法,MTT,，,化学名,3-,（,4,，,5-,二甲基,噻唑,-2,）,-2,，,5-,二苯基四氮唑溴盐，,商品名是噻唑盐。活细胞，特别是,增殖的细胞中能量代谢旺盛，其中,线粒体能量代谢过程中产生的琥珀,酸脱氢酶可将淡黄色的,MTT,还原为蓝色的结晶,formazan,沉积在细胞内和细胞周围，形成的结晶,与增殖的细胞数成正比。二甲基亚砜,（,DMSO,）,可溶解,formazan,，,用酶联免疫检测仪在,490nm,波,长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。经典方法，缺点是较麻烦，误差相对也较大。,71,新技术在医学实验中的应用,MTT,的改进型,：,MTS,MTS,是在,MTT,的基础上加以,改进的一种四唑盐，,Promega,公司将其与电子偶联剂,PES,稳定混合，形成单一溶液形式，易用而稳定的细胞活力检测试剂。,72,新技术在医学实验中的应用,CCK-8,法,CCK-8,（,Cell Counting Kit-8,），,是碧云天公司推出的另一种,MTT,改进型，基于,MTT,的另一个衍生物,WST-8,，,与,MTS,法,相似，只需将单一溶液加入即可测定活细胞相对数量。,73,新技术在医学实验中的应用,Calcein-AM,染色,Calcein-AM,是一种荧光染料,Calcein,的前体，能穿透细胞膜，在活细胞中被转化为,Calcein,，荧光强度与活细胞数量成正比。可用于荧光显微镜下标记细胞。,74,新技术在医学实验中的应用,PI,染色法,Propidium Iodide(PI),为,DNA,的嵌入剂,（,Intercalator,），,同时为一荧光染料。,PI,的特性是无法穿过活细胞膜，因此其能被用来确定死细胞。,前面流式细胞术已经介绍过通过,PI,染色确定细胞是否死亡的方法。,75,新技术在医学实验中的应用,Trypan Blue,染色法,Trypan Blue,(,台盼蓝）也是一种只能染色死细胞的染料，与,PI,的不同之处是其染色肉眼可见，可给出直观,的细胞生存与否的表述。,76,新技术在医学实验中的应用,细胞凋亡检测,Western blot,流式细胞术,TUNEL,Hoechst 33258,染色,DNA ladder,77,新技术在医学实验中的应用,细胞凋亡的信号通路,78,新技术在医学实验中的应用,Western blot,检测细胞凋亡,需要同时检测两个目标：,Caspase-3,及,PARP,（,Poly ADP-Ribose Polymerase,）,Caspase-3,在正常细胞中以前体酶,（,Procaspase-3,）,的形式存在，约为,32KD,。凋亡发生时，前体酶被剪切为具有活性的,Caspase-3,，两个,亚基分别约为,17KD,和,12KD,（分子量随不同,物种有少量波动）,79,新技术在医学实验中的应用,流式细胞术法检测凋亡,在流式细胞术一节已经讲到，以,Annexin V/PI,双染色法 结合流式细胞仪即可分辨正常活细胞，早期凋亡细胞及晚期凋亡,/,坏死细胞。,81,新技术在医学实验中的应用,TUNEL,Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,。末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记。,基于,Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT),的应用。,凋亡发生时，,DNA,被切断，暴露的残端可以被,TdT,识别，进而将,dNTP,联接到,DNA,残端上。通过标记,dNTP,，凋亡的细胞可以被在位标记出来。,82,新技术在医学实验中的应用,TdT,只识别凋亡时产生的,DNA,断裂，而不会识别其他原因如辐射导致的,DNA,断裂，故可特异性显示凋亡细胞。,常用,Biotin-Streptavidin-HRP,系统（与免疫组化相仿）显色。注意需要阻断内源性的过氧化酶，,biotin,高表达的组织还需要阻断内源性的,biotin,。,83,新技术在医学实验中的应用,Kumaret al.Cardiovascular Diabetology20076:34,84,新技术在医学实验中的应用,Hoechst 33258,荧光染色,1,原理：,细胞凋亡的形态学表现为染色质固缩。,Hoechst33258,染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染或呈碎块致密浓染，颜色有些发白。,2,步骤：,细胞种入放洁净盖玻片的六孔板内，待细胞融合至,8090%,。,外界刺激细胞发生凋亡（紫外线照射）,Hoechst 33258,染色（,Hoechst 33258,染色）,荧光显微镜下观察结果,85,新技术在医学实验中的应用,对照组,UVB,模型组,UVB+,维生素,C,(5.68 mmolL-1),UVB+,扇贝多肽,(1.42 mmolL-1),UVB+,扇贝多肽,(2.84 mmolL-1),UVB+,扇贝多肽,(5.69 mmolL-1),86,新技术在医学实验中的应用,琼脂糖凝胶电泳（,DNA Ladder,）,1,原理：,细胞发生凋亡时,DNA,在核小体单位之间的连接处断裂，形成不同倍数的,180 200,碱基对核酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现阶梯状核蛋白区带图谱，即所谓的,DNA ladder,。,87,新技术在医学实验中的应用,2,步骤：,孵育细胞融合至,8090%,。,外界刺激细胞发生凋亡（紫外线照射）,抽提,DNA,（,DNA Ladder,抽提试剂盒）,取部分抽提得到的,DNA,，,1,琼脂糖凝胶电泳分析，观察,DNA,梯形条带。,88,新技术在医学实验中的应用,活性氧自由基检测,H2DCFDA,染色,GSH,含量检测,SOD,活性检测,ESR,法,89,新技术在医学实验中的应用,H2DCFDA,染色,H2DCFDA,，全称,2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,，是一种可穿过细胞膜的荧光染料前体。其能为活性氧自由基转化为荧光染料，从而给出细胞内活性氧自由基的水平。,可用流式细胞仪，荧光显微镜，共聚焦显微镜或者带荧光测定功能的酶标仪检测。,要求细胞膜完整。,能再次穿膜而出，影响检测的精确度和敏感度。,改进型的,CM-H2DCFDA,能更好地待在细胞内，但,价格昂贵得多,。,90,新技术在医学实验中的应用,GSH,含量检测,谷胱甘肽是细胞内主要的内源性抗氧化物质。以还原态（,GSH,）和氧化态（,GSSG,),两种形式存在，谷胱甘肽还原酶（,GR,）可消耗,NADPH,将,GSSG,转化为,GSH,。,正常细胞中谷胱甘肽主要以,GSH,形态存在。,GSH,含量的下降或者,GSH/GSSG,比值的下降可以间接说明氧化应激压力的存在。,单测,GSH,或测,GSH/GSSG,比值都可以。,91,新技术在医学实验中的应用,GSH/GSSG,比例示例,GSH/GSSG Ratio Detection Assay Kit(Fluorometric-Green)(ab138881),配制两种不同的检测试剂，一种只对,GSH,起反应，一种对所有谷胱甘肽都起反应。,可以容易地算出比值。,操作简便。,较为昂贵。,92,新技术在医学实验中的应用,SOD,活性,WST,法，利用黄嘌呤氧化酶（,Xanthine Oxidase,）产生超氧化物使,WST,转化为染料，,SOD,可以抑制此反应，故此法可间接测得,SOD,活性。,93,新技术在医学实验中的应用,ESR,技术,1,原理,电子自旋共振,(electron spin resonance ESR),又称电子顺磁共振,(electron paramagnetic resonance EPR),。,ESR,是研究自由基的最直接和最有效的方法和技术，但是这些自由基必须是相对稳定的，而且要达到一定浓度才能用,ESR,技术检测和研究。,2,举例：,ESR,检测,ROS,和,NO,的动态释放,UVA,UVA+PCF,94,新技术在医学实验中的应用,Thank you!,Questions?,95,新技术在医学实验中的应用,