被子植物胚胎学9.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章 胚状体和人工种子（时数,2,）,目的和要求,：,通过本章的学习，理解和掌握胚状体和人工种子的概念，胚状体的形成、人工种子的构成与制备及它们在生产实践中的意义。,主 要 内 容,第一节 胚状体,一、胚状体的概念及研究意义,二、胚状体发生的普遍性,三、胚状体的胚胎发生过程,四、诱导胚状体的因素,主 要 内 容,第二节 人工种子,一、人工种子的概念,二、人工种子的构成,三、人工种子的制备,四、人工种子的意义,五、人工种子技术存在的问题,叶状沼兰（,Malarix puludosa,）的叶顶部，经过细胞分裂活动，可产生许多胚状结构。,胚状体,套层,2.,植物组织培养中的胚状体,Reiner,和,Steward,在,1958,年分别在胡萝卜的悬浮细胞的培养中最先发现了体细胞的胚。此后在细胞、组织和器官培养中积累了大量的资料，近年来花药培养中的小孢子或花粉，甚至未受精的子房或胚珠培养中的大孢子或胚囊中的成员，也可诱导胚胎发生，形成胚状结构，并进一步萌发形成小植株。,3,、植物组织培养中，再生植株的形态发生方式,Konar(1965),综合为四种方式：,先根后芽，如颠茄细胞的悬浮培养。,先芽后根，大多数愈伤组织培养中发生。,独立产生芽和根，后连接成统一的轴状结构，如胡萝卜组培或水稻愈伤组织的培养。,与合子胚相似的胚胎发生过程形成的。,4.,胚状体的概念,广义的胚状体：在自然界或组织培养中从体细胞，或与生殖细胞有关的细胞所发生的胚状结构，称为胚状体（,embryoid,）。,狭义的胚状体：,在离体植物细胞、组织或器官培养过程中，由一个或一些体细胞，经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。,胚状体一般专指在组织培养条件下产生的非合子胚以区别于自然发生的珠心胚及其他通过无融合生殖和由合子胚分裂产生的胚。,5.,研究胚状体的意义,增加繁殖系数,。由愈伤组织、细胞或器官培养中，诱导胚状体的数量比诱导芽多得多。,可以直接生长成小植株，,成苗率高,。愈伤组织分化的芽不容易发育成小植株，可是诱导胚状体，就容易得到小植株。,胚状体的维管束与合子胚一样,是独立产生的，与母体维管束不相连,因此,可以获得无病植株。,用于细胞全能性的理论研究,。,可,以利用胚状体,进行同步分裂的研究,，以了解细胞周期的真实过程和认识控制从亲代细胞到子细胞过程中生化变化系列的因子。一般用生长激素和细胞分裂素控制细胞同步分裂。,（二）胚状体发生的普遍性,能产生胚状体的植物已知的有,43,科,92,属,117,种,在维管植物各大类群中均有报道。,植物种,产生胚状体的培养物,作者,檀香科,檀香（,Santalum aibum,）,合子胚愈伤组织,Rao.P.S,1965.,毛茛科,石龙芮（,Ranunculus sceleratus,）,石龙芮（,.,）,黑种草（,Nigelia damascena,）,黑种草（,.,）,幼苗下胚轴,花药药隔愈伤组织,胚乳愈伤组织,花梗及花芽愈伤组织,Konar,R.N.,等,1965a,Konar,R.N.,等,1965b,Sethi,M.,等，,1976,Raman,等，,1974,十字花科,蔓菁（,Brassica napus,）,白芥（,B.alba,）,花药中的小孢子,幼苗各种器官的愈伤组织,Keller,等，,1977,Bajaj,等，,1972;Bajaj,等，,1973,菟丝子科,云南菟丝子（,Cuscuta reflexa,）,合子胚愈伤组织及表皮,Maheshwari,P.,等，,1961,景天科,落地生根（,alanchoe pinnataK,）,叶愈伤组织,Wadhi,等，,1964,芸香科,橙（,Citrus sinensis,）,四季桔（,C.microcarpa,）,珠心愈伤组织,珠心愈伤组织,Kochba,等，,1973,Rangaswamy,等，,1961,大戟科,巴豆（,Croton bonplandianum,）,橡胶树（,Hevea brasiliensis,）,胚乳愈伤组织,愈伤组织,Bhojwari,1966,Paranjothy,1974,组织培养中产生胚状体的一些被子植物种及其培养物,植物种,产生胚状体的培养物,作者,冬青科,枸骨叶冬青（,Ilex aquifolium,）,子叶,Hu.C.Y,1971,伞形科,莳萝,（,Anethum graveolens,）,茴香（,Foeniculum vulgare,）,荷叶芹（,Petroselinum hortense,）,胡萝卜（,Daucus carota,）,胡萝卜（,.,）,胡萝卜（,.,）,子房中的合子胚及愈伤组织,子房中的合子胚及愈伤组织,叶柄愈伤组织,根愈伤组织,单细胞,四倍体及六倍体原生质体,Johri,等,1966,同上,Vasil,等，,1966,kato,等，,1963,Reinert,等，,1971,Dudits,等，,1976,夹竹桃科,蛇根木（,Rauvolfia serpentina,）,叶,Mitra,等，,1970,茄科,颠茄（,Atropa belladonna,）,颠茄（,.,）,矮牵牛（,Petunia hybrida,）,茄（,Solanum melongena,）,茄（,.,）,辣椒（,Capsicum annuum,）,南洋金花（,Datura innoxia,）,假白花曼陀罗（,D.meteloides,）,烟草（,Nicotiana tabacum,）,烟草（,.,）,根愈伤组织、胚状体的胚柄,花药中的小孢子,叶、茎,花药中的小孢子,胚愈伤组织,花药中的小孢子,花药中的小孢子,花药中的小孢子,花药中的小孢子,游离小孢子,Konar.,等，,1972,Zenkteler,1971,Rao,等，,1973,北京市农业科学院蔬菜研究所等，,1975,Yamada,等，,1967,王玉英等，,1973,Geier,1973,Geier,1973,Sunderland,等，,1971,Nitsch,C.,1977,茜草科,咖啡（,Coffea arabica,）,叶愈伤组织,Sondahl,等，,1977,菊科,苣荬菜（,Cichorium endivia,）,胚愈伤组织,Vasil,等，,1964,(,续前表,),植物种,产生胚状体的培养物,作者,禾本科,无芒雀麦（,Bromus inermis,）,大麦（,Hordeum vulgare,）,水稻（,Oryza sativa,）,小麦（,Triticum aestivum,）,玉米（,Zea mays,）,黑麦（,Secale cereale,）,甘蔗（,Saccharum sinensis,）,中胚轴,胚,花药中的小孢子,花药中的小孢子,花药中的小孢子,花药中的小孢子,叶愈伤组织,Constabel,等，,1971,Norstog,等，,1970,朱至清等，,1976,朱至清，王敬驹等，,1973,北京大学生物系，,1977,广西壮族自治区玉米研究所等，,1977,Thomas,等，,1975,曾吉恕，,1979,棕榈科,油棕,（,Elaeis guineensis,）,愈伤组织,Jones,1974,百合科,石刁柏（,Asparagus officinalis,）,石刁柏,(.),下胚轴愈伤组织,原生质体,Wilmar,1968,Bui-Dang-ha,等，,1975,兰科,兰属（,Cymbidium,）,胚愈伤组织,Curtis,1948,(,续前表,),从上表可看出，产生胚状体的被子植物种是相当普遍的；产生胚状体的离体培养物也是多种多样的。,三、胚状体的发生方式,1.,从愈伤组织产生,（常见）,如胡萝卜根、石龙芮雄蕊的药隔、白芥幼苗的各种器官、莳萝的胚状体、石刁柏的原生质体、咖啡叶和甘蔗的幼叶等。,2.,直接从器官上发生,如枸骨冬青的子叶、莳萝和茴香在子房中的合子胚、石龙芮和蔓菁的下胚轴等，在一定条件下可直接从器官上发生胚状体。,3.,从悬浮培养的单细胞发生,如胡萝卜悬浮细胞的培养（,Steward,，,1958,），是研究胚状体发生的经典材料。,注意两个重要因素：一是细胞必须从紧密排列的组织中或多细胞集合体中脱离出来；二是细胞必须获得像合子那样的特殊营养，椰子乳在培养基中的作用是重要的。,4.,从小孢子（或花粉）和大孢子发生,如烟草、曼陀罗、天仙子、小麦、水稻、大麦等。,四、诱导胚状体的因素,1.,生长素,在正常组织的培养中，生长素的控制在诱导胚胎发生上是重要的。一是诱导细胞具有胚发生的能力；二是解除胚胎发生时期的诱导胚正常地充分地发育。,2.,还原性氮,对培养物供应足够的还原性氮是诱导胚状体发生的一个先决条件。,3.,其它因素的意义,细胞分裂素既能抑制又可促进。,诱导胚状体需要的条件，因植物种类、部位和培养时组织细胞所处状况的不同而异。可有几种情况：,胚状体的产生不需要任何激素和细胞分裂素的,如烟草,曼陀罗和水稻等的花药培养,莳罗和茴香的子房培养,四季橘愈伤组织和欧芹叶柄的愈伤组织培养。,培养中需要生长激素或细胞分裂素或二者的组合，如石龙芮的下胚轴，檀香和石刁柏的愈伤组织培养。有的需要较高的激动素和,生长素,的配合才能有较高的胚状体发生频率，如颠茄的,花药,培养。,需先在有激素的培养基上诱导，然后转入低浓度激素或无激素的培养基中，如石刁柏下胚轴的愈伤组织培养及颠茄细胞的悬浮培养。胡萝卜在诱导愈伤组织时需,2,，,4-D,，但由愈伤组织诱导出胚状体时，则需在没有,2,，,4-D,的培养基培养。某些天然产物，如椰乳，西瓜汁，酵母提取物，酪朊水解物或腺嘌呤等都有利于胚状体的发生。,胚状体的诱导与外植体所处生理状况，内源激素的变化及遗传性、倍性等都有密切关系。,第二节人工种子,一、人工种子的概念,人工种子（,artificial seeds,，,synthetic seeds,）的概念最早是由,Murashige(1978),提出的，是,指通过组织培养技术，将植物的体细胞诱导成在形态上和生理上均与合子胚相似的体细胞胚，然后将它包埋于有一定营养成分和保护功能的介质中，组成便于播种的类似种子的单位。,二、人工种子的构成,胚状体,人工胚乳,人工种皮,为了使,胚状体,能够存在并发芽，需要有,人工胚乳,，内含胚状体健康发芽时所需的营养成分、防病虫物质、植物激素；还需要能起保护作用以保护水分不致丧失和防止外部物理冲击的,人工种皮,。通过人工的方法把以上,3,个部分组装起来，便创造出一种与天然种子相类似的结构,人工种子。,Kitto,等（,1981,）用聚氧乙烯包裹胡萝卜胚状体首次制成了人工种子。经过,20,余年的研究，人工种子的研究取得了很大进展，除了胡萝卜、苜蓿、芹菜、水稻、玉米、甘薯、棉花、西洋参、小麦、烟草、大麦、油菜、百合、莴苣、马铃薯等农作物种子外，花卉和林木人工种子如长寿花、水塔花、白云杉、黄连、刺五加、橡胶树、柑桔、云杉、檀香、黑云杉、桑树、杨树等都有成功生产的报道。,三、人工种子的制备,（方法与技术要求）,人工种子制备包括胚状体的诱导与同步化、人工种子的包埋、人工胚乳的制作、人工种皮的制作、人工种子贮藏等步骤内容。,（,1,）胚状体的诱导与同步化,生产高质量的胚状体是制作人工种子的关键。从目前的研究结果来看，并不是所有的植物种子都开发出了胚状体培养发生技术。不同植物的体细胞的培养亦有难易。在生产人工种子时，要求胚状体具有可观的成株率，甚至超过天然种子。,胚状体的诱导：胚状体可从悬浮培养的单细胞得到，也可通过试管培养的愈伤组织、花粉或胚囊获得。胚状体一般在培养物的表面产生，其形状与合子胚类似，但胚状体却是无性繁殖的产物。实际操作中，一般在试管中诱导出愈伤组织，并在含生长素的培养液中悬浮培养，然后置于含生长素的发酵罐中，使细胞迅速扩增，再将细胞移入无生长素的发酵罐中诱导出大量胚状体。,胚状体同步化处理或分选：胚状体的同步化是指促使所有培养的细胞或发育中的细胞团块进入同一个分裂时期。只有同步化了细胞才可能成批地产出成熟胚胎。常用的方法有：,化学方法：饥饿法,将培养基中的一些重要成分反复去除和添加；阻断法,在培养初期加如,DNA,合成抑制剂，如,5-,氨基脲嘧啶，阻断细胞分裂的,G1,期。,物理方法：低温处理法、过滤筛选法、渗透压分离法、密度梯度离心法,(,体胚不同的发育阶段密度有差异,),等到胚状体胎成熟以后，就可以进行人工种子的包埋了。其中过滤筛选法较实用、快速。,（,2,）人工种子的包埋,人工种子的包埋关系到人工种子萌发、贮藏和生产应用等重要环节。,Reden-baugh,于,1984,年首次筛选出透水性好的海藻酸钠作为胚状体和不定芽的包埋剂。包埋方法主要有将胚状体或小植株悬浮在一种粘滞的流体胶中直接播入土壤的液胶包埋法；将体细胞胚经干燥后用聚氧乙烯等聚合物进行包埋的干燥包裹法；以及通过离子交换或温度突变形成凝胶包裹材料的水凝胶法，,Redenbaugh,等用此法包裹单个苜蓿体细胞胚制成了人工种子，离体成株率达,86%,。组合包埋法以及流体播种、液胶包埋、琼脂、铝胶囊等新颖包埋法也开始被应用，,George,等用硅胶包埋谷子体细胞胚，葫发率达,82%,，且,4,贮藏,14,天后仍能自行裂开、顺利萌发。,对胚状体包裹要求做到：首先，不影响胚状体萌发，并提供其萌发与成苗所需的养分和能量，即起到胚乳的作用；其次，使胚状体经得起生产、贮存、运输及种植过程中的碰撞，并利于播种，即起到种皮的保护作用；最后，针对植物种类和土壤等条件，满足对人工种子的特殊需要。,目前研究中的人工种子普遍采用水凝胶法，以海藻酸钙作为包埋剂，它具有对胚状体无毒害作用、价格低廉等优点。但由于海藻酸钙对水溶剂有很好的通透性，使得包埋其中的营养物质、激素、抗生素等,(,即人工胚乳成分,),容易渗透出来，造成营养泄露；另外，由于没有真正意义上的,“,人工种皮,”,的包裹保护，一些病原微生物容易侵入胚状体，对种子造成破坏，因而目前绝大多数人工种子都只能在无菌条件下才能达到较高萌发率。,（,3,）人工胚乳的制作,为了满足包裹要求，要有针对性地在包裹剂中加入大量养分、无机盐、有机碳源、植物生长调节剂，以及抗菌素和有益菌类。选用无毒、透气和吸水性强的木薯淀粉与,1.5%,海藻酸钠,(1/2MS,培养基配制,),混合制作的胚乳可改善单一海藻酸钠人工胚乳的透气性、吸水性和发芽率，人工胚乳中加入,GA3,有利于人工种子的发芽，加入,CaCl2,有利于向培养物供氧，提高人工种子发芽率和耐贮藏性，加扩活性炭可改善营养固定和缓释，提高人工种子在土壤中的成苗率。,（,4,）人工种皮的制作,人工种皮既要求允许内外气体交换畅通，以保持胚状体的活力，又要能防止水分及营养成分的渗漏和起保护作用。一般采取双层种皮,结构,，内种皮通透性较高，外种皮硬，透性小，起保护作用。,现已筛选出海藻酸钠、明胶、果胶酸钠、琼脂、树胶等可作内种皮应用，某些纤维素衍生物与海藻酸钠制成复合改性的包埋基质可明显改善人工种皮的透气性，海藻酸钠中加入多糖、树胶等可减慢凝胶的脱水速度，提高干化体细胞胚的活力。,外层种皮可选用半疏水性聚合膜，以降低海藻酸钙的亲水性，对人工胚乳起固定作用。另外可在膜上添加毒性小的防腐剂或溶菌酶，以防止微生物的侵入。,Ling-FongTay,用壳聚糖作为外种皮制作的油菜人工种子萌发率达,100%,，但在有菌条件下萌发率仍不高。美国杜邦公司生产的由乙烯、乙酸和丙烯酸三种物质聚合的,Elvax,材料是目前认为较好的一种人工种皮材料。,人们仍在积极寻找其他的包埋方式和包埋材料，以完善现有人工种皮的制作技术。,四、人工种子的意义,由于人工种子是通过无性繁殖产生的，与天然种子相比较，人工种子可以工厂化生产和贮存；可以减少具有杂种一代优势的作物的育种程序；可以快速繁殖结实率低或难以用种子繁殖、育性欠佳的作物；可以快速推广优良种质资源；人工种子还具有节约种源、土地，不受季节限制的优点。,因此，受到许多国家的重视，我国已将人工种子的研究列入了,863,高新技术发展计划。,人工种子，充分利用了快繁技术的优势，又吸收了对植物生长发育和农业生物技术研究的先进成果。具有以下五个优点：,一是人工种子繁殖速度快。,人工种子中的体细胞胚是通过组织培养法生产的，故能以很快的速度繁殖生产体细胞胚。以胡萝卜为例，用一个体积为,12,升的发酵罐在,20,天内生产的胡萝卜体细胞胚可制作,1000,万粒人工种子，可供几万亩地种植，这就大大地节省了种子。此外，人工种子的包裹层是通过化学方法生产的，不存在生物生产的任何限制；,二是可望获得整齐一致的植物苗，利于农业生产的规范化、标准化和机械化管理,。大量人工种子来源于同一植株的体细胞，不存在任何遗传变异问题；,三是缩短育种周期、加速良种繁育速度。,在新品种选育过程中，利用人工种子技术，只需有一株优良单株便可大量繁殖，这样将大大加速杂交一代杂种的应用速度，扩大应用规模和范围；,四是人工种子还具备一些天然种子不具备的功能。,人工种子的胚乳和种皮，构成了体细胞胚胶囊。在胶囊中可根据不同植物的需要配制最优的营养，还可加入某些农药、微生物、除草剂等防止病害、杂草发生。这样，就可使其具备天然种子不具备的功能，从而使其具有特殊的价值；,五是人工种子便于贮藏和运输，适合机械化播种。,人工种子是通过人工的方法制造的，它的体积小（通常仅几毫米），故占用空间小、操作方便，非常便于贮藏和运输。人工种子的均匀度高，利于机械化播种。随着农业生物技术，尤其是组织培养和细胞培养技术的发展，人工种子将成为,ZI,世纪高科技种子业中的主导技术之一，在农业生产中发挥重要作用。,五、人工种子技术存在的问题,尽管目前人工种子技术的实验室研究工作已取得较大进展，并且已在繁殖遗传工程植物、减数分裂不稳定植物、稀有及珍贵植物的过程中，显示出超常的优势。但从总体来看，目前的人工种子还远不能像天然种子那样方便、实用和稳定。主要障碍在于人工种子的质量和成本：,(1),许多重要的植物目前还不能靠组织培养快速产生大量的、出苗整齐一致的、高质量的胚状体或不定芽；人工种子的质量达不到植物正常生长、运输和贮藏的要求；人工种子的制种和播种技术尚需进一步研究。,(,2),目前多数人工种子的成本仍然高于试管苗和天然种子。虽然一些研究机构已经建立起大规模自动化生产线，能够生产出高质量、大小一致、发育同步的人工种子，但是它的成本仍高于天然种子。,以苜蓿为例，目前生产,1,粒人工种子所需成本是,0.026,美分，而,1,粒天然苜蓿种子的成本是,0.0006,美分，二者相差,40,多倍。因此，人工种子要真正进入商业市场并与自然种子竞争，必须降低生产成本。由于人工种子是由组织培养产生的，需要一定时间才能很好地适应外界环境，因此人工种子在播种到长成自养植株之前的管理也非常重要，在推广之前必须经过农业试验，并对栽培技术及农艺性状进行研究。,思考题,1,、什么是胚状体？是如何形成的？在研究中具有什么意义？,2,、何谓人工种子？是怎样构成的？如何制备？,3,、人工种子有何优点？在生产中存在什么问题？有何发展前景？,