微生物生产和害虫生物防治.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,一、苏云金芽孢杆菌的生产,生产方式,优 点,缺 点,固体发酵,（,1,）培养基含水量少、废水废渣少、环境污染小、能耗低、设备技术较简易、投资低、产物浓度高；,（,2,）发酵后可直接进行干燥、粉碎，过程简单，后处理过程节能。,发酵温度、湿度难控制，自动化程度低，易染杂菌、产品湿润性能较差。,液体深层次发酵,（,1,）生产规模大，流动性好，有利于传质、传热、和控制；,（,2,）便于高效、自动化、清洁生产。,发酵后处理较难，发酵水平受培养基组分和浓度因素的影响。,（一）固体发酵,1.,三级扩大培养,（,1,）生产工艺流程,沙土管菌种,斜面菌种,液体种子扩大种子培养,半固体浅盘培养,干燥粉碎包装,（,2,）工艺条件,种子扩大培养多采用三角瓶液体震荡培养。,半固体浅盘发酵相当于发酵罐培养，培养基可因地制宜利用农副产品，如一种,以麸皮为主要基质的培养基,，其质量比为：麸皮,50,、豆饼粉,25,、麦秆粉,20,、,CaCO,3,1.5,、,KH,2,PO,4,0.3,、,MgSO,4,0.2,、,NaOH 1,、水,150,。料厚,1.63.3 cm,，接种后盖灭菌纱布。室温,2530,o,C,。,培养过程中反动数次，,23 d,后大部分形成芽孢囊，并有,20%,左右的芽孢和晶体脱落时终止培养。连同麸皮培养基磨碎过筛包装。产品含活孢子,50,亿,100,亿,/g,。,苏云金芽孢杆菌菌体,2.,一步扩大培养,采用半固体浅盘发酵，以工业生产的菌粉作为种子，省略了三级扩大培养法中的斜面菌种和种子扩大培养两个步骤。,将经灭菌处理过的半固体培养基倒在消毒过的塑料薄膜上，用质量高的工业菌粉（含活芽孢,100,亿,/g,）按配料干重的,1%,抢温（,80oC,）接种，拌匀后用塑料薄膜包起闷热,10 m,，以达到减少杂菌和催芽的目的。,然后打开塑料膜摊放在浅盘上培养。,其他步骤与三级扩大培养法相同。,（二）深层固体发酵,1.,生产工艺流程,斜面菌种,沙土管菌种,发酵罐,发酵液预处理,加填充料混合,膜浓缩,板框过滤,沸腾干燥,低含量（约,10 000 IU/mg,）,Bt,半成品,加填充料混合,喷雾干燥,2931,o,C,，斜面培养,92100 h,2931,o,C,，压力,0.050.07 mPa,；通气,1:0.81.2(v/v)2040 h,用,HCl,调,pH,至,4.55.5,用,HCl,调,pH,至,4.85.5,压力,0.6 Mpa,去水浓缩,1.52,倍,加硅藻土,混合、搅拌,3045 min,加轻质碳酸钙，混合、搅拌,3045 min,高含量,Bt,半成品,进风,170210oC,，出风,8090oC,，喷粉,450550 L/h,2.,工艺条件,菌种：选用优良菌种，并防止退化，用时移接活化，选择对数生长期接种，接种量要适当。,发酵培养及下游处理控制：接种和发酵过程应注意不能有杂菌和噬菌体感染。通气培养的适温为,30,o,C,，不能低于,28,o,C,或高于,35,o,C,。,pH,在发酵时稍降，形成芽孢时稍升。晶体脱落即可放罐。如果用离心沉淀收获或发酵直接真空干燥，应尽可能提高菌体成熟度。如果用板框过滤法，滤液中菌数应低于,0.2,亿,/mL,。喷雾塔进口温度,170210,o,C,，中层温度,6575,o,C,，流量,450550 L/h,。,工业生产发酵培养基：我国常用的培养基成分（质量比）为：花生饼粉,2.0,，玉米浆,0.9,、糊精,0.8,、蛋白胨,0.1,、,CaCO,3,0.2,、,MgSO,4,0.075,、,K,2,HPO,4,0.007,、,(NH,4,),2,SO,4,0.2,、饴糖,0.5,、消泡剂豆油,0.2,。我国菌剂产品一般约含活芽孢数,100,亿,/g,。,二、白僵菌的生产,白僵菌和绿僵菌是昆虫病原真菌中大量生产研究较多的种类，生产方法有很多共同之处。,白僵菌致死的昆虫,绿僵菌致死的昆虫,1.,白僵菌液体深层发酵工业,黄浆水,（豆腐压榨水）,常压水解,沉淀,弃去,发酵罐深层培养,空气过滤器,空压机,二级液体种子（查贝克培养基,+1.5%,蛋白胨）,（,2628,o,C,，,72 h,）,斜面菌种活化,菌种,豆油去泡剂，按,0.2%,加入,（,2628,o,C,，约,72 h,，搅拌速度,200 rpm,）,填充剂（滑石粉，过筛孔径,46.2,m,，按,5%,加入）,发酵液,板框过滤或连续离心（,20 000 rpm,）,调浆,喷雾干燥,成品,（芽生孢子，,450,亿,/g,）,常温干燥,粉碎,包装,低温储藏,18 mol/L H,2,SO,4,调至,pH 2,NH,4,OH,调至,pH 5,检验,原料,发酵,生产、储藏,液体深层发酵工业生产工艺流程,早在,1960,年代，我国和前苏联就曾研究过白僵菌的液体深层发酵工业生产。,Samsinakova(1966),在,1 000 mL,的发酵液中可获得,1015 g,干重的芽生孢子。,1970,年代，前苏联还有通过深层发酵直接生产白僵菌分生孢子的报道（,Goral,1973,1975,），发酵罐中可获得,510,8,210,9,分生孢子,/mL,，取决于培养基的成分和发酵条件的控制。,Rombach,（,1989,）进一步研究了白僵菌的深层发酵产孢，发生在产生芽生孢子和菌丝片段的同时也能产生和冲体上或固体培养基上相似的合轴分生孢子。含有,2%,蔗糖和,0.5%,酵母浸出物和基础盐培养液中，分生孢子最高产量为,1.710,8,个,/mL,；在,2.5%,蔗糖和,2.5%,酵母浸出物的培养液中分生孢子最高产量为,7.410,8,个,/,mL,。,1970,年代初开始，前苏联采用双相发酵技术生产球孢白僵菌，该技术是将经深层培养的芽生孢子液倾入有麦麸、谷类等培养基的浅盘表面上，促进菌丝迅速发育，并产生分生孢子。白僵菌的分生孢子制剂，其产品名称为,Beauverin,或,Bocerin,，含活孢子量,210,9,个,/g,，惰性基质为高岭土（,Goral,1971,1972,）。此法生产白僵菌的培养基含玉米浸膏,2%,、糖蜜,4%6%,、,KH2SO4 0.1%0.2%,、,MgSO4 0.05%0.1%,，,pH 56,。无菌操作工业化深层通气发酵,2428 h,，倾入浅盘表层培养约,120 h,，从表层菌膜收获分生孢子，产孢量为,110,6,1,.,510,6,个,/cm,2,。,我国各生产单位自,1980,年代也曾普遍使用该技术大量生产白僵菌。中国农业科学院生物防治研究室研究的工艺可获孢子量,1.510,10,2.010,10,个,/g,，经分离提纯，含孢量高达,1.010,11,1.910,11,个,/,g,。,使用该技术生产过程中，需注意防止菌种退化、选择培养基、控制培养条件、防止污染等环节。,2.,双相发酵生产,三、斜纹夜蛾多角体病毒的增殖,昆虫病毒主要包括核型多角体病毒（,NPV,）、质型多角体病毒（,CPV,）和颗粒体病毒（,GV,），均为专性寄生病原体。,国际,上已有几种昆虫病毒制剂在市场上出售，如棉铃虫核型多角体病毒杀虫剂等,。,中国,研究以核型多角体病毒,防治棉铃虫,、油桐尺蠖、桑毛虫、茶毛虫、舞毒蛾、粘虫、斜纹夜蛾和扁刺,蛾；以,颗粒体病毒防除菜粉蝶、小菜蛾、黄地老虎和茶小,卷叶蛾；以,质型多角体病毒防除松毛虫,等。,喷粉施用质型多角体病毒防治马尾松毛虫,1.,斜纹夜蛾健虫的饲养,人工饲料配方：黄豆粉,100 g,，山梨酸,1.6 g,，麸皮,100 g,，尼泊,金（对羟基苯甲酸）,1.6 g,，酵母粉,40 g,，水,1 000 mL,，,L-,抗坏血酸,4 g,。,配置方法：用一半水调匀黄豆粉、酵母粉和麸皮，另一半水煮化琼脂，两者混合均匀后经,103.42 kPa,蒸汽灭菌,30 min,。待压力降至零时取出饲料，加入山梨酸和尼泊金，边加边搅拌均匀。当饲料中的温度降至,50oC,左右时，再加入其它成分。充分搅拌均匀，冷却后置,4oC,冰箱备用。如要做平面饲料，则趁热倒入直径,13 cm,、高,3.5 cm,的圆形塑料盒中，厚度为,34 cm,。,（,1,）人工饲料的配置,卵的孵化：在幼虫孵化前一天，用,5%,（,v/v,）福尔马林溶液将卵块浸泡,2030 min,，无菌水漂洗,3,次，灭菌纸上晾干，移入盛有人工半合成饲料的圆形塑料盒盖子的中央，每盒接卵,23,块。,放置于,25,o,C,孵育，,RH 75%,左右，每天光照,12 h,。,（,2,）卵的孵化,卵块,卵块,低龄（,13,龄）幼虫的饲养：将约,500,粒已消毒的卵接入盛有饲料的中央，等孵化完毕后，将盒子倒置饲养。不同添加饲料和更换饲养容器。,老龄（,46,龄）幼虫的饲养：幼虫养至,4,龄后，更换到规格,18 cm,18 cm 4.5 cm,的方形塑料盒或直径,19.5 cm,、高,9 cm,的圆形玻璃缸中继续饲养。一般,4,龄幼虫投放密度为,18,头,/dm,3,，,5,龄为,12,头,/dm,3,，,6,龄为,9,头,/,dm,3,。由于,46,龄幼虫每次蜕皮都会吐水，造成容器内湿度过大，影响生长发育，这是期的相对湿度应降至,60%,。,温、光、湿（特别说明的除外）条件与卵孵化相同。,（,3,）幼虫饲养,低龄幼虫,老龄幼虫,老龄幼虫,蛹的管理：在规格为,15 cm,25 cm 30 cm,有塑料纱盖（已消毒）的木盒中，放入,10 cm,厚已高温消毒的沙子，沙的含水量以手捏不成团为宜。同时在沙上放一块竹网，竹网上投放人工半合成饲料。当老熟幼虫全部入沙营造蛹室时，取走竹网，在沙上盖纸避光。每盒子可供,45,头幼虫化蛹，待蛹体变成黑色后，挑选个体大、富有光泽、有活力的蛹，放入交配产卵箱羽化。温、光,、,湿条件,与卵孵化相同,。,（,4,）蛹的管理,蛹,蛹,成虫：将蛹放入垫有湿滤纸的培养皿中，移入,30,cm,30,cm 30,cm,的纱网养虫笼内，每笼放入,15,对蛹。待羽化后，在笼内瓶插,23,片蓖麻叶，让成虫产卵。并放入,10%,蜜糖水，以供成虫营养。每天收取卵块，要按笼号分批登记，以便进行疾病的诊断。温度调至,28,o,C,，光、湿条件与卵孵化相同。,（,5,）成虫,成虫,成虫,2.,幼虫感染与回收,感染核型多角体病毒的幼虫于增殖室中饲养，温度控制在,2527,o,C,、,RH 70%,左右。,将饲养至,4,龄的幼虫，按,18,头,/dm,3,的密度进行涂毒感染，涂毒的人工饲料约含有,6,10,5,PIB/mL,（,PIB,是多角体,polyhedral,inclusion,body,）。饲养,24 h,后，换不含病毒的饲料继续饲养。,从感染后的第,5,天开始收集病死虫，第,7,或第,8,天后全部收完。,收集的病死虫及时处理或储于,-20,o,C,冰箱中，以免污染杂菌。,按上述方法，,4,龄幼虫感染死亡率可达,80%,以上，虫尸病毒多角体含量达,5.310,9,PIB/g,。,核多角体病毒粒子,3.,病毒提取干燥,将病死虫尸与,10,倍体积的自来水混合，倒入电动匀浆过滤机研磨过滤，滤液先以,3 000 rpm,离心,30 min,；,弃上液，沉淀加入适量的,0.1%,中性洗洁精完全悬浮，经,500,rpm,离心,5,min,，取上液再以,3 000 rpm,离心,30,min,（重复洗涤离心,1,次）。沉淀按,1:1,加入填充剂并存放于,-20,o,C,。,取冻结的沉淀物在,45,o,C,以下恒温真空干燥，便可获得多角体干粉。,经显微计数确定含量后，分装于塑料瓶，存放于,4,o,C,冰箱备用。,4.,可湿性粉剂的配置,按可湿性粉剂的配方，称取病毒粗制品和各种辅助剂，经拌和机充分拌和均匀，配成多角体不少于,6,10,9,PIB/g,的杀虫剂。,经质量检测合格后，分装于小塑料袋，每袋,10 g,。,斜纹夜蛾核型多角体病毒制剂生产工艺流程总结,四、昆虫病原线虫的繁殖与培养,国外，,1930,年代开始培养和应用昆虫病原线虫。早期的繁殖和培养主要依靠活体昆虫，虽可适用于各类线虫，但繁殖成本过高，不适宜大量生产。澳大利亚学者成功地将鸡内脏匀浆吸附于普通的海绵碎片上大量培养线虫，发明了线虫的固体培养方法（,Bedding,1981,1984,）。此后，美国学者在线虫培养技术上取得突破，为昆虫病原线虫的研究何应用奠定了基础。,国内，,1970,年代末到,1980,年代初，开始规模化引进、收集、培养和应用昆虫病原线虫。目前，广东省昆虫研究所已具备规模化固体和液体生产昆虫病原线虫的能力（韩日畴等，,2008,）。,1.,共生细菌的制备,共生细菌可从感染期线虫中肠分离得到，也可从被线虫感染的昆尸体中分离纯化。所分离的共生细菌能够在常规培养基中生长，为线虫的单菌培养提供了条件。细菌的菌株、菌型及质量影响线虫的产量。因此，共生细菌的制备是线虫培养的第一步。,细菌培养基：蛋白胨水培养基（含,1%,蛋白胨、,0.5%NaCl,）、,YS,肉汤（含,1%,蛋白胨、,0.3%NaCl,、,0.3%,牛肉浸膏，,pH 7.0,）、营养肉汤和,LB,培养基（含,1%,蛋白胨、,0.5%NaCl,、,0.5,%,酵母）均能支持细菌的生长。细菌的生长量、生长率与培养基组分的质量和氧气的供应有关系。,菌,型：昆虫病原线虫的共生细菌具有典型的初生型和次生型。初生型能支持线虫的最优繁殖，但初生型菌在体外培养时易转为次生型，因此在线虫培养过程中，必须控制共生细菌发生型变。,菌株：斯氏线虫和异小杆线虫与共生细菌具有一定程度的营养专化性，即线虫从自身携带的共生细菌中获得最佳营养，但线虫在不同菌株中的生长率和产量不同，有些线虫（如格氏斯氏线虫和一些异小杆线虫品系）能在其他共生菌株得到比自身携带的共生细菌更高的产卵。不同的菌株对不同培养基组分的转化能力不同，因此，有必要根据线虫品系和培养基组分选择最优的菌株用于线虫的繁殖。,噬菌体：在共生细菌菌株中已发现噬菌体的存在。虽然噬菌体在线虫,-,共生细菌组合中的作用仍未清除，但一般认为，噬菌体对细菌可能产生的条件溶菌作用会影响线虫的培养。这在共生细菌的制备时应该加以控制。,2.,线虫的大量培养,线虫一级种：单菌培养要求加入的线虫一级种仅携带一种合适的共生细菌。如果一级种中混有杂菌，就会造成培养物的严重污染，大幅度降低线虫产量。研究表明，体表消毒感染期线虫不能满足严格的单菌性。表面消毒怀卵大母虫的卵可以有效制备无菌,1,龄线虫。,线虫的人工培养基：典型培养基有狗饲料培养基、动物组织匀浆、豆粉玉米油、豆粉蛋类。还有以面粉蛋类、玉米粉、鱼肠及马铃薯为组分的培养基及添加其他物质的培养基。鸡内脏培养基虽然适合于线虫的大量繁殖，但操作不便且难以大量保藏。而干粉组分（如豆粉、玉米粉、鱼粉、鸡蛋）等自然饲料成分方便得到，室温保藏，容易标准化选配，在线虫商业化生产中发挥了重要作用。,培养温度：最佳的培育温度依线虫种类（品系）而异，范围为,1928,o,C,。,2.,线虫的大量培养,共生细菌的接种：在线虫种为单菌状态时，即线虫没有杂菌污染，由于共生细菌的增殖速率较快，初始接种量对线虫的最后产量没有明显影响。,线虫接种量：对于某一培养基，一定时间内，同一产量范围增殖倍数最大的接种量将是经济有效的接种量，应利用最小的接虫量发挥线虫最大的繁殖潜力，即确定线虫最大产量时感染期线虫产量最大。,培养时间：线虫体外培养的时间与线虫种类、培养基组分、接线虫量及培养温度有关。最佳的培养时间为培养基营养消耗殆尽时感染期线虫产量最大。,一般来说，在固体干粉培养基中，噬菌体小杆线虫的培养时间为,21 d,，小卷蛾斯氏线虫,A11,为,21 d,，格氏斯氏线虫为,15 d,；豆粉鸡蛋培养基中，小卷蛾斯氏线虫,A11,为,1621 d,。,3.,线虫的收获与清洗,当线虫培养到最佳时间后，感染期线虫的产量最高，其他虫态的线虫比例最小。此时应该立即收获，否则感染期线虫的死亡将导致产量下降。,当线虫培养到最佳时间后，感染期线虫的产量最高，其他虫态的线虫比例最小。此时应该立即收获，否则感染期线虫的死亡将导致产量下降。,收获线虫的步骤主要是将培养物浸泡于自来水中，让线虫通过筛网，留下海绵等杂质，,95%,左右的感染期线虫从培养物中爬出。通过通气振荡海绵培养基可提高线虫收获率。,保存线虫必须尽量去掉培养物中的杂质和其他虫态，否则会影响线虫的保存时间和质量。清洗过程是分级进行的，包括几次浸泡、沉淀、换水。如果浸泡过夜，则需要空气压缩机供氧。,4.,线虫的质量检测,感染期线虫的比例：大量培养出的线虫应含高比例的感染期线虫。经测定，豆粉鸡蛋培养基中小卷蛾斯氏线虫,A11,感染期线虫的比例达,98%,以上。,感染期线虫的带菌率：感染期线虫的带菌率指携带有共生细菌的感染期线虫的比例，可以作为线虫质量评定的指标。各种线虫自然种群的带菌率不一样，斯氏线虫为,40%94%,，而异小杆线虫属种群均在,90%,以上。,生物测定：测定线虫的寄主范围及感染率常用瓶装细沙法：于一个,4.5 cm,2.5 cm,的闪烁计数玻璃瓶中放,1,头大蜡螟幼虫，加入,3 cm,厚经高压消毒的细沙（含水量约为,6%,），然后往沙面洒,1 mL,不同剂量的线虫悬浮液，轻拧上盖。剂量水平设,0,、,2,0,、,2,1,、,2,2,、,2,3,和,2,4,，设,20,个重复。,25,o,C,或根据要求设定的温度下,96 h,后检查寄主的死亡率。感染率以概率值分析加以统计分析，求得,LD,50,与,LD,90,及其,95%,的置信区间。,5.,线虫的储存于剂型,线虫的储存：实验室少量储存线虫时采用低温浅水层法，将线虫保存在,812,o,C,下浅水层中（,2 cm,左右,），每,6,个月以大蜡螟转代,1,次。线虫单菌种可以试管斜面或液氮或冰冻干燥法保存。,商业大量储存目前包括吸附物质保存法和干燥状态保存法。前者为利用海绵、活性炭或硅藻土等物质吸附线虫的保存方法；后者则是在一定温度下使线虫脱水进入干燥状态的保存方法。,保存剂型：依据昆虫病原线虫产品的特征，目前保存剂型有液剂、颗粒剂、水分散颗粒剂、粉剂、胶囊、虫尸剂等。,五、蝗虫微孢子虫的繁殖,微孢子虫属原生动物，曾在昆虫病理学领域发挥重要作用。,早,在,1900,年代，,Pasteur,就已描述了许多原生动物并建议用于害虫防治。,1950,年代初，开始把原生动物作为杀虫微生物进行研究。,1960,年代中期，美国采用微孢子虫,Nosema gaster,防治棉铃象甲,Anthonomus grandis,。,1980,年代，美国成功开发出蝗虫微孢子虫,Nosema locustae,用于防治草原蝗虫，并在美国环保署登记注册，称为第一个登记注册的原生动物杀虫剂。,蝗虫微孢子,蝗虫微孢子虫生产仍然使用活体寄主繁殖，目前使用的活体寄主是蝗虫。,不同,国家用于繁殖的寄主蝗虫种类不同，美国用双带蚱蜢和殊种蚱蜢，我国多用东亚飞蝗。,寄主蝗虫,的,种类,和,性别,影响蝗虫微孢子虫孢子产量。美国,1997,年报道，用殊种蚱蜢的单产量为,9.1,10,9,孢子,/,头，我国用东亚飞蝗作为增殖寄主的单产量为,2.010,10,孢子,/,头；同种蝗虫中，,雌性的产量高于雄虫,。,东亚飞蝗,蚱蜢,将蝗虫饲养至一定龄期，然后把蝗虫微孢子虫的孢子悬浮液稀释到一定浓度后接种。,接种后的蝗虫饲养,30 d,左右，收获虫尸或活虫，之后用粉碎机粉碎，用,120,目过滤，离心，去掉上清液，调整浓度后包装，在,-10,o,C,条件下保存。,蝗虫微孢子虫生产的基本过程,飞机喷施蝗虫微孢子虫,喷施蝗虫微孢子虫,六、农用抗生素的生产,1953,年，我国首次分离获得对棉花枯萎病、黄萎病有一定防效的,5406,菌株（尹莘耘，,1953,），拉开了我国农用抗生素研究的序幕。随后相继筛选出灭瘟素、春雷霉素、多抗霉素等的产生菌，生产出相应的抗生素。,1973,年，上海市农药研究所，筛选出井冈霉素产生菌，经多次诱变选出高产株，全国多家农药厂投产，每年使用面积大,6.7,10,6,hm,2,以上，为我国农用抗生素的开发积累了经验。,近年来，我国又筛选出多效霉素、农抗,120,、公主岭霉素、武夷霉素等。,以井冈霉素为例介绍农用抗生素的生产方法。,1.,高产菌株的选育,井冈霉素产生菌的原始菌株产生抗生素能力很低，为了在短期内使井冈霉素产生菌产生抗生素的能力达到生产要求，采用了多种出发菌株，多因素诱变，使产生菌产生抗生素的能力逐步提高。,菌种选育过程中，初筛均采用化学测定法，复筛提供生产的菌种必须经过组分分析和生物测定。,在菌种选育过程中，注意保持产生菌的优良性状，即在高温条件下短期内产生大量的抗生素，以提高设备利用率，降低动力消耗。,通过选育的井冈霉素产生菌，目前单位时间产生抗生素的能力在抗生素中是最高的，创造了单位体积发酵罐生产抗生素的最高纪录。,2.,发酵工艺,（,1,）发酵工艺流程,井岗霉素菌种沙土管,母斜面,茄子瓶,种子罐,发酵罐,放罐提炼,33.5 d,6070 h,2030 h,3642 h,斜面菌种,发酵罐,（,2,）发酵条件,温度：链霉菌发酵温度一般为,2632,o,C,，井冈霉素原始菌种在一般发酵温度下，发酵周期很短，采用高温发酵工艺后，发酵时间又比原来缩短,1/3,。,原始菌种培养基：在,以蛋白胨、黄豆粉为有机氮源的培养基中,，井冈霉素产生菌原始菌种产生,抗生素的能力极低，而在以蚕蛹粉、酵母粉作为有机氮源时产生抗生素的能力较强。但该原始菌株在菌株选育后获得的新菌株中，有的能适应黄豆饼粉作为有机氮源。因此，菌种选育应和培养基配方的研究紧密结合起来。,种子培养基：可采用多种配方，淀粉、葡萄糖、麦芽糖和糊精等都是适合的碳源，鱼粉、蛋白胨、蚕蛹粉、花生饼粉、黄豆粉、玉米浆等都可作为有机氮源。常用的配方为：,4%,淀粉、,2%,花生饼粉、,0.5%,酵母粉、,0.6%NaCl,、,0.05%KH,2,PO,4,或,2.2%,黄豆饼粉、,3%,葡萄糖、,1%,蚕蛹粉、,0.4%CaCO,3,。,发酵,培养基：除选用适当的碳源（葡萄糖除外，不得使用）外，还要选用合适的氮源，酵母粉、花生饼粉、黄豆饼粉、蚕蛹粉等都是较好的有机氮源。碳源、氮源再加适当的无机盐，即可配置成井冈霉素产生菌的发酵培养基。,3.,井冈霉素的提取与精制,井冈霉素主要存在于滤液中，将发酵液过滤除去菌丝体，滤液加,2%,粉末活性炭搅拌,23 h,，收集活性炭，水洗,3,次；,用盐酸丙酮溶液（,0.5 mol/L HCl：,丙酮,=3,：,7,）洗脱，洗脱液蒸去丙酮，加活性炭脱色，得黄色液体；,黄色液体先后通过,330,阴离子交换树脂和,732,阳离子交换树脂，除去阴离子和阳离子杂质，得淡黄色液体；,此,液通过,12,强酸型交换树脂，抗菌素即吸附在树脂上，饱和的树脂用蒸馏水洗去杂质，用,0.5 mol/L NH4OH,洗脱，收集活性部分；减压浓缩，最后用丙酮析出沉淀；,为进一步分离纯化，采用强碱性离子交换树脂,Zerolite FF,（,200,目，,OH,型）进行层析，用蒸馏水展层。经层析可得到,4,个活性组分，其中组分,I,和组分,II,对水稻纹枯病的防治活性最强，分别为井冈霉素,A,和井冈霉素,B,。,4.,提取浓缩水剂工艺,井冈霉素可采用活性炭吸附，大孔吸附树脂、离子交换树脂等方法进行提取，但都增加了成本及“三废”。,经多方研究，兼顾井冈霉素发酵液的安全及稳定性，采用直接浓缩水剂作为我国井冈霉素生产的主要制剂，不仅工艺简单成本低廉，而且没有“三废”。,经过各种条件的稳定性试验，使产品在常温下保持,2,年以上，效价无明显下降，为商品化打下了基础。,第十章 害虫生物防治,以水稻害虫为例,概述,水稻的主要害虫,生物防治因子及其利用途径,典型案例,第一节 概述,我国耕地仅占世界耕地的,1/7,，而养活占世界人口的,1/4,，除了培育优良品种、提高面积产量外，还要抵抗包括农作物病虫害在内的各种自然灾害的侵袭，方能获得作物的好收成,。,我国,农作物种类繁多，包括粮食作物、经济作物、蔬菜、果树、茶树、森林等，,为害,这些作,物,的昆虫,种类,也很,多,，为害严重，造成的损失大,。,如,水稻,害虫约有,350,种，小麦害虫,120,多种，玉米害虫,50,多种，棉花害虫,300,多种，因农作物害虫常年所造成的损失，粮食,5%10%,，棉花,20%,。,我国是世界上森林覆盖率较低的国家，而松林占有很大比重，约占森林总面积的,1/3,，松毛虫是我国森林为害最严重的食叶害虫，约占全国森林害虫发生面积的,1/2,。每年造成立木生长量损失达,100,万,m,3,，年损失松脂约,5,万吨。每年因,6,种松毛虫所造成的松材损失达,370,万,m,3,。,水稻是我国栽培面积最大、总产最多的粮食作物。,我国水稻的播种面积仅次于印度，约占世界水稻总面积的,1/6,，占国内粮食种植面积的,26.9%,。平均单产,6.56,吨,/,公顷,(2012,年数据,),，比世界平均单产高,34.3%,。,稻谷产量居世界第一，约占世界稻谷总产量的,27.5%,，占国内粮食总产量的,1/3,左右,；,中国的稻谷平均产量达到世界平均水平的,1.6,倍。,2012,年，全国推广采用袁隆平超级水稻的种植面积达到或超过,400,万公顷，而杂交水稻的种植面积已达,1470,万公顷，而水稻的种植总面积大约,2870,万到,2930,万公顷之间，占全国稻谷总产的,57%59%,。,第二节 水稻的主要害虫,我国种植水稻面积广阔，根据气候条件、地理环境和水稻种植特点等,，,可划分,南方稻区和北方稻区，两大稻区又各分为三,个稻区,。,华南双季稻稻作区,华中双单季稻稻作区,西南高原单双季稻稻作区,华北单季稻稻作区,东北早熟单季稻稻作区,西北干燥区旱季稻稻作区,南方稻区,北方稻区,国内已知为害水稻的害虫有,250,多种，其中为害严重的有水稻,螟虫,和,稻飞虱,等，不同稻区有所差别。,1.,螟虫,属鳞翅目螟蛾科,Pyralidae,，幼虫钻蛀稻茎，在分蘖期危害造成枯心，在孕穗期为害形成白穗。,三化螟为单食性害虫，仅为害水稻。,是,亚洲热带至温带南部的重要稻虫。国内长江以南各省，尤其沿江、沿海平原地区更为严重。在广东粤北每年发生,4,代，珠江三角洲,45,代，湛江,56,代；海南北部,6,代，南部,7,代。,对三化螟的防治已有一套完整的技术措施。,(1),三化螟虫,卵块,幼虫孵化后钻入茎干,茎干中的幼虫,白穗,(2),二化螟,属鳞翅目螟蛾科，幼虫钻蛀稻杆，为害状与三化螟相似。,二化螟分布广，北至黑龙江，南迄海南岛，主要为害地区为湘、鄂、川、赣、浙、闽、苏北、皖北，陕、豫以及黔、滇高原地带。,二化螟食性较杂，除水稻外还可取食茭白、甘蔗、玉米、蚕豆、油菜、油草等多种植物。,卵块,幼虫,危害状,鳞翅目螟蛾科，广布于全国稻区，南方稻区受害严重，广东中部一年发生,67,代，二龄幼虫爬到叶尖附近，吐丝纵卷稻叶成苞，藏在苞内取食叶肉；,剑叶期是水稻受害敏感期；,稻纵卷叶螟是迁飞性的害虫，虫源来自南亚；,19,60年代前局部、间歇发生，随着耕作改制、密植、高肥等生产水平的提高，1965年后为害程度上升，,19,70年代以后成为常发性的主要害虫。,(3),稻纵卷叶螟,稻纵卷叶螟,成虫,卵,一龄幼虫,幼虫转苞,幼虫在苞内取食,危害状,稻飞虱属半翅目飞虱科,Delphacidae,，为害水稻的飞虱种类很多，主要的有褐飞虱,Nilaparvata lugens,(Stl),、白背飞虱,Sogatella furcifera,Horvath,和灰飞虱,Laodelphax striatellus,(Falln),；,褐飞虱和白背飞虱是长距离迁飞的害虫，长江流域及以南各省发生量大，有时爆发成灾,；虫源来自南亚；,灰飞虱分布广，在北方稻区、四川盆地、长江下游各省受害较重,；,稻飞虱的若虫及成虫多聚集在稻基部取食，造成稻株枯死倒伏,；,灰飞虱还能传播稻、麦、玉米等多种作物的病毒病。,2.,稻飞虱,褐飞虱,白背飞虱,灰飞虱,长翅型,短翅型,褐飞虱,Nilaparvata lugens,St,l,单食性害虫，只能在水稻和 普通野生稻上取食和繁殖后代；有远距离迁飞习性，是我国和许多亚洲国家当前水稻上的首要害虫。,白背飞虱,我国南至海南岛，北至黑龙江各稻区，东南亚各国均有白背飞虱分布。主要危害水稻、麦类、玉米、高粱。,稻茎上的飞虱,白背飞虱成虫,南自海南岛，北至黑龙江，东自台湾省和东部沿海各地，西至新疆均有发生，以长江中下游和华北地区发生较多。由于寄主是各种草坪禾草及水稻、麦类、玉米、稗等禾本科植物，所以对农业危害很大。,灰飞虱,灰飞虱成虫,玉米上的灰飞虱,褐飞虱,在我国发生的历史较长，20世纪70年代以来有8次大发生：,1974年秋，全国发生面积300万hm,2,，,1975年510月，发生面积1267万hm,2,，,1982年510月，发生337万hm,2,，,1983年510月，发生面积1421.6万hm,2,，,1985年秋,全国发生面积1313.2万 hm,2,，,1987年，发生面积1821万hm,2,，,1991年，发生面积2320万 hm,2,，,1997年，发生面积1900万hm,2,。,2005-2007年，在长江流域连续大发生。,飞虱为害及造成火烧状,穿 顶,自然天敌的保护利用,天敌应用技术,抗,虫品种及其应用,生物农药及其应用,第三节 生物防治因子及其利用途径,一、自然天敌的保护利用,1.,保护利用天敌种库的主要措施,在冬季和夏季休耕期，杂草中的各种飞虱卵是缨小蜂,Anagrus,spp.,的最主要寄主，可以适当保留田埂杂草保护蜂源；在水稻移栽、稻飞虱进田后铲除杂草，能促使天敌进田。,在越冬期，可种植油菜、豆类、苕子等冬播作物或挖坑堆草等方法，人为创造越冬场所供天敌栖息，以保障蜘蛛等天敌顺利越冬。,春插期和双抢期的犁田、耙田等农事活动可能会导致,90%,左右的田内蜘蛛数量损失，应采取留高茬、挖穴堆草或错开翻耕时间等方法保护田间蜘蛛。,2.,保护利用天敌的主要措施,杀虫剂对稻田天敌群落有显著的杀伤作用，特别是在水稻生长早期施药的影响更大，因为此时的天敌群落正处在重建过程中，因此建议在水稻移栽后,3040 d,内不用化学农药。否则，当害虫发生时，天敌不能有效地发挥作用，易造成害虫的严重发生。一定要使用化学农药时，应选择对天敌杀伤力较小的农药，并尽量缩小使用面积。,选择有利于天敌的品种，提倡利用天敌和中抗水稻品种控制稻飞虱。,在稻田坚持“浅水勤灌、开沟排水、适时晒田、干干湿湿”，这样不但是防病的重要措施，对稻田蜘蛛也有重要作用。早稻浅水田管理比深水田管理的总蛛量增加,70%80%,；双季晚稻晒田后，田间蛛量增加,20%35%,。,3.,在生态系统层次增加天敌功能的主要措施,适宜的品种布局可以减缓害虫的适应，种植其他作物（包括稻田田埂上种大豆）能促使某些天敌种群的迅速建立或增加天敌的数量和活力。,在较大的范围错开水稻的移植时间，有利于自然天敌并能提高天敌对褐飞虱,Nilaparvata lugens,的控制作用。,不同作物品种的间作、轮作或套作，对自然天敌可能有诱增作用。如夏玉米间作葡萄型绿豆田中，玉米螟赤眼蜂,Trichigramma ostriniae,自然种群数量在一段相当长的时间内保持较高水平，说明间作对赤眼蜂有增诱作用。,二、天敌应用技术,赤眼蜂对水稻螟虫有很好的防治效果。据报道，吉林连续,9,年在,2.010,6,hm,2,大面积释放赤眼蜂结果证明，平均螟卵寄生率为,71.8%,，被害率降低,61.4%,，平均百株螟虫可减少,73.4%,，连片放蜂效果良好。,在稻田中释放拟澳洲赤眼蜂,Trichogramma confusum,和松毛虫赤眼蜂,T.dendrolimi,防治稻纵卷叶螟,Cnaphalocrocis medinalis,，螟卵被寄生率常在,67%,以上。,拟澳洲赤眼蜂,稻纵卷叶螟卵,二化螟卵,三化螟卵,三、抗虫品种应用技术,水稻中抗品种与天敌对褐飞虱的协同控制作用高于高抗品种与天敌的协同作用，可能原因是中抗品种本身对褐飞虱种群增长的抑制作用比较温和，能保证捕食性天敌种群有足够的食物，而高抗品种对褐飞虱种群增长有强烈的抑制作用，从蛾影响了天敌种群的食物资源，二者间的协同作用反而下降。,拟环纹豹,蛛,Pardosa pseudoannulata,或黑肩绿盲蝽,Cyrtorrhinus lividipennis,对褐飞虱和二点黑尾叶蝉的捕食在抗虫品种上无明显提高，研究针对的是天敌的捕食作用，而非二间的协同作用。,四、生物农药及其应用,苏云金芽孢杆菌（,Bt,）可产生两大类毒素，即内毒素（伴胞晶体）和外毒素，使害虫停止取食，最后害虫因饥饿和死亡。因此该杆菌可做微生物源低毒杀虫剂，用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目，特别是鳞翅目的多种害虫。已成功应用于防治水稻三化螟、二化螟和稻纵卷叶螟等害虫。,利用经化学诱变剂硫酸二乙酯连续多次诱变所获的苏云金芽孢杆菌,BtS387,菌株工业发酵制剂，对稻纵卷叶螟二代、三代卵孵化高峰期的保叶率分别达,77.89%,、,87.34%,和,64.94%,、,82.64%,。,Bt,和化学农药三唑磷混配，对二化螟 的防治效果达,88.7%,，保苗效果达,99.1%,。,第四节 典型案例,大沙镇水稻害虫综合防治,广东省四会市,大沙镇位于广东的西江、北江和绥江三江下游围田地区，害虫可以终年转寄主危害，是三化螟、稻纵卷叶螟、褐飞虱和黏虫的严重发生地区。,1973,年，中山大学,蒲,蛰龙,教授提出,“以发挥天敌效能为主的水稻害虫综合治理,”,，并亲自挂帅,在,四会市,大,沙镇建立了大面积的水稻害虫综合防治示范点。,1974,年,11,年底，年逾花甲的,蒲,教授,率领,昆虫学研究所,10,位骨干教师到大沙，为落实研究计划，骑着自行车与青年教师走遍了大沙的农田、蔗地、果园及林地，进行实地考察。历经,20,多年的系统研究，为天敌保护利用、农田环境改善、绿色食品大米的生产打下坚实基础。,1975,年蒲蛰龙教授和中青年教师、当地干部、技术员在四会大沙田间考察,1973,年蒲蛰龙教授和中大教师、学生、四会县干部在四会大沙田间调查水稻害虫,1976,年蒲蛰龙教授在四会大沙蜂站指导繁殖赤眼蜂,一、主要的调控措施,合理用药,局部挑治,天敌的保护利用：蜘蛛、青蛙等,耕作除虫：提早放水沤田、轮作、套作等,水稻害虫的,可持续控制,养鸭除虫：每公顷,75120,只,选用抗虫,水稻品种,举办,培训班,建立测报网站,以菌除虫：,Bt,等,育蜂治虫：繁殖释放赤眼蜂等,大沙镇水稻害虫综合防治措施,1.,第一阶段（,19731978,）,为综合防治初期，由于此前大量使用化学农药，田间天敌种群凋落，完全失去了对害虫的控制作用。,原则是既要把害虫压下去，又要恢复和重建天敌在田间的优势地位。,方法是以改造农田环境、释放和保护天敌（养鸭除虫、释放赤眼蜂、施用苏云金芽孢杆菌、保护青蛙等）为主。,（,1,）改造害虫孳生环境,19741974,年，全区平整土地上万亩，在低洼地开沟挖渠，降低水位，提高农田排灌能力，恶化病虫生存环境。,（,2,）采取农业防治措施,提早在惊蛰前犁耙沤田，压低越冬三化螟的虫口基数；采用抗病虫品种等。,三化螟幼虫越冬场所,（,3,）大力开展养鸭除虫、以菌治虫、育蜂治虫为主的生物防治,在田间害虫的天敌群落凋落的情况下，养鸭除虫是一项十分有效的生物防治措施；,以菌,治虫主要使用苏云金芽孢杆菌，应用本区生产的工业菌粉，防治稻纵卷叶螟和稻苞虫幼虫，效果达到,70%90%,。,育,蜂治虫主要释放螟黄赤眼蜂和松毛虫赤眼蜂防治稻纵卷叶螟，放蜂面积从,1973,年,8 hm2,增至,1976,年的,396.13 hm2,，稻纵卷叶螟卵的被寄生率均在,67%83%,之间。,养鸭除虫,大图为四会大沙稻田中放养的鸭子，鸭子在水田中寻找食物，捕食昆虫，尤其是个体较小的鸭子对昆虫的捕食作用更强；,右下角小图是通过解剖鸭