二甲双胍调节高糖环境下人牙周膜细胞NLRP3炎症小体激活的机制研究.pdf

ince基础研究S基础出研究775口腔医学2023年9 月第43卷第9 期二甲双胍调节高糖环境下人牙周膜细胞NLRP3炎症小体激活的机制研究胡萍12,李雯，饶小波摘要目的本研究拟通过体外构建伴糖尿病牙周炎模型，探索二甲双胍对人牙周膜细胞（periodontal ligament cells，PDLCs）中NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein3,NLRP3）炎症小体活化的调节能力及其机制，为二甲双胍治疗伴糖尿病牙周炎患者提供新的见解。方法甲基噻唑基四氮唑比色法检测二甲双胍对人PDLCs的细胞毒性。将人PDLCs细胞分为5组，A组为正常葡萄糖浓度组（8 mmol/L葡萄糖）,B组为高渗环境组（8 mmol/L葡萄糖+17 mmol/L的甘露醇）,C组为高浓度葡萄糖组（2 5mmol/L葡萄糖）,D组为高糖环境下二甲双胍处理组（2 5mmol/L葡萄糖+40 mmol/L二甲双胍）,E组为高糖环境下二甲双胍和AMPK抑制剂处理组（2 5mmol/L葡萄糖+40 mmol/L二甲双胍+10 mol/L复合物C）。A E组均暴露在牙龈叶啉单胞菌LPS下，酶联免疫吸附试验检测促炎细胞因子白细胞介素（interleukin，IL)-1和IL-18表达水平,免疫印迹观察蛋白NLRP3、Ca s p a s e-1、A SC、A M PK、p-A M PK 表达水平，同时检测线粒体复合体I活性变化。结果果二甲双胍浓度不高于40 mmol/L时,对人PDLCs无明显细胞毒性；二甲双胍治疗可显著抑制高糖环境下细胞炎症反应，人PDLCsIL-1和IL-18分泌减少,NLRP3、Ca s p a s e-1表达降低，同时线粒体复合体活性下降，p-AMPK表达升高，引入AMPK抑制剂后可部分逆转上述变化。结论在人PDLCs中，二甲双胍通过降低线粒体复合体I活性和激活AMPKs途径减少高糖环境中NLRP3炎症小体的激活，这为二甲双胍防治伴糖尿病牙周炎提供了新的证据【关键词牙周膜细胞；NOD样受体蛋白3炎症小体；二甲双胍；线粒体复合体I中图分类号R781.4文献标识码 A文章编号 11003-9872(2023)09-0775-06doi10.13591/ki.kqyx.2023.09.002Metformin regulates NLRP3 inflammasome activation in human periodontal ligament cells under high glucose circumstaHU Ping,LI Wen,RAO Xiaobo.(Center of Stomatology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science andTechnology,Wuhan 430030,China)Abstract:Objectivee To investigate the regulatory ability and mechanism of metformin on the activation of NOD-like receptorprotein 3(NLRP3)in human periodontal ligament cells(PDLCs)by constructing a model of diabetes and periodontitis in vitro,and toprovide new insights for metformin in the treatment of patients with diabetes and periodontitis.Methods Methyl thiazolyl tetrazoliumassay was used to detect the cytotoxicity of metformin on human PDLCs.Human PDLCs were divided into five groups.Group A was anormal glucose concentration group(8 mmol/L glucose).Group B was a hypertonic environment group(8 mmol/L glucose and 17mmol/L mannitol).Group C was a high concentration glucose group(25 mmol/L glucose).Group D was a high glucose environmentgroup treated with meformin(25 mmol/L glucose+40 mmol/L metformin).Group E was a high glucose environment group treated withmetformin and the AMPK inhibitor(25 mmol/L glucose+40 mmol/L metformin+10 mmol/L compound C).All A-E groups were ex-posed to Porphyromonas gingivalis LPS at the same time.The level of IL-1 and IL-18 were detected by ELISA.The changes of proteinsNLRP3,Caspase-1,ASC,AMPK,and p-AMPK were detected by western blot.Changes of mitochondrial complex I activity were al-so detected.Results Metformin with a concentration not exceeding 40 mmol/L had no significant cytotoxicity on human PDLCs.Met-formin treatment could significantly inhibit the inflammatory response in high glucose environments,characterized by the decrease of IL-1,IL-18,NLRP3 and Caspase-1,and also reducing the activity of mitochondrial complex I,while increasing the expression of p-AMPK.However,the introduction of AMPK inhibitor reversed some of the changes.ConclusionIn human PDLCs,metforminreduces the activation of NLRP3 inflammasome in high glucose environment by reducing the activity of mitochondrial complex I and基金项目：湖北省卫生健康科技项目（WJ2021M122）作者单位：1华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔医学中心，湖北武汉（430 0 30）；2 华中科技大学同济医学院口腔医学院，湖北武汉（430 0 30）；3南京大学医学院附属口腔医院，南京市口腔医院第一门诊部，江苏南京（2 10 0 0 0）通信作者：饶小波E-mail:activating AMPKs pathway,which provides new evidenceformetformin to prevent and treat diabetes patients with periodontitis.Key words:periodontal ligament cells;NOD-like receptor protein 3inflammasome;metformin;mitochondrial complex IStomatology,2023,43(9):775-780776胡萍，等.二甲双胍调节高糖环境下人牙周膜细胞NLRP3炎症小体激活的机制研究糖尿病是以高血糖为特征的一种慢性代谢性疾病,可引起包括牙周炎在内的多种并发症 。牙周炎是由菌斑生物膜引起的慢性炎症性疾病,可导致牙周支持组织破坏，引起牙齿脱落2 。尽管多种药物被用于控制高血糖和牙周炎,但伴糖尿病的牙周炎控制仍然存在困境，相关机制和治疗策略尚需进一步探讨。二甲双胍（C,H,N，HCI)是目前临床最常用的一线抗糖尿病药物,同时该药的治疗应用正逐渐扩大到抗炎、抗肿瘤、抗衰老领域3。有研究表明，二甲双胍在心肌炎、结肠炎、肝炎和关节炎的治疗中发挥积极作用4-7 牙周膜细胞（periodontal ligament cells,PDLCs）参与的免疫防御反应对机体抵抗病原体和维持内环境稳定非常重要。有研究表明二甲双胍可显著抑制牙龈叶啉单胞菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的人PDLCs中NOD样受体蛋白3（NOD-likere-ceptorprotein3，NLRP3）炎症小体激活，从而减少IL-1和IL-18的产生和分泌,减轻炎症反应8 ,但二甲双胍对糖尿病患者牙周炎症的影响及机制尚不可知。本研究拟探索二甲双胍对高糖环境下LPS刺激人PDLCs后NLRP3炎症小体的激活影响及潜在调节机制，为二甲双胍防治糖尿病患者牙周炎提供新的研究依据。1材料与方法1.1试剂和仪器Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbeccosmodified Eagle Medium,DMEM）、胎牛血清（fetal bo-vineserum，FBS）（G i b c o，美国），牙龈叶啉单胞菌LPS、NLRP3抗体、Caspase-1抗体、ASC抗体、GAPDH抗体、4%12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺预制凝胶板（Invitrogen，美国），AMPK抗体、p-AMPK抗体（Cell SignalingTechnology，美国），蛋白质印迹分析的相关二抗（abcam，英国）,RIPA缓冲液、增强化学发光检测试剂盒（Thermo scientific，美国），二甲双胍（Sigma，美国），AMPK抑制剂复合物C（M e r c k,美国），甲基噻唑基四氮唑（3-（4,5-dime-thylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）（华联科生物技术，中国），ELISA试剂盒（赛培生物科技，中国），BCA定量试剂盒（爱必信，中国），线粒体分离试剂盒、复合物I活性测定试剂盒（艾美捷科技，中国），青霉素、链霉素、丙酮酸钠和L-谷氨酰胺、聚偏二氟乙烯膜（生工生物工程,中国），3%牛血清白蛋白（明宣生物科技，中国）。微孔板分光光度计（ThermoLabsystems，芬兰），增强化学发光系统（AmershamBiosciences，美国），JY-3B稳压电泳仪（Eppendorf,德国），B33快速转印系统(Biometra,德国）。将LPS和二甲双胍溶解到磷酸盐缓冲液（phos-phate buffersaline,PBS）中制备成储备溶液，并在使用前稀释至指定浓度。1.2细胞培养本实验经华中科技大学同济医学院同济医院伦理委员会批准（批准号：TJ-IRB20221250）。收集2022年12 月在华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔医学中心就诊的18 至30 岁患者因正畸需求拔除的非龋坏、牙周健康前磨牙，按照本研究小组以往的技术路线获得人PDLCs9。刮取根中三分之一的牙周膜组织,切碎成大约1mm左右的组织碎块，将组织块接种到装有DMEM培养基（含10%FBS、10 0 U/mL青霉素、10 0 g/mL链霉素、1mmol/L丙酮酸钠和2 mmol/LL-谷氨酰胺）的培养瓶中，37、5%CO,培养箱中培养。本研究中使用的细胞为第3 5代细胞。1.3细胞分组将细胞分为AE组。A组为正常葡萄糖浓度组,培养基中加入8 mmol/L葡萄糖;B组为高渗环境组,为排除高糖产生的渗透压影响,培养基中加人8mmol/L葡萄糖和17 mmol/L甘露醇;C组为高浓度葡萄糖组,培养基中加人2 5mmol/L葡萄糖;D组为高糖环境下二甲双胍处理组，在C组基础上加人40mmol/L的二甲双胍共培养；E组为高糖环境下二甲双胍和AMPK抑制剂处理组,在D组基础上加人10 mol/L复合物C处理细胞。1.4细胞活性检测采用MTT比色法评估不同浓度二甲双胍处理人PDLCs后的存活率10 。每个96 孔板的单孔中接种10 0 L的细胞悬液（细胞密度为110 5个/mL），按1.3中AC组处理细胞,加人不同浓度的二甲双胍（10、2 0、40、8 0、16 0 mmol/L）和灭菌PBS（作为阴性对照组），每组细胞加人1g/mL牙龈叶啉单胞菌LPS刺激2 4h后，每孔添加50 LMTT（2.5mg/mL)继续培养4h。2 0 0 L二甲基亚矾溶解晶体，微孔板分光光度计测量490 nm波长下吸光度值。每组细胞活力值为阴性对照组的相对值，进行3次平行实验1.5酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorb-ent assay,ELISA)按1.3分组处理细胞。每组细胞均加人1g/mL7772023年9 月口腔医学第43卷第9 期牙龈啉单胞菌LPS刺激2 4h。收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-1和IL-18水平。1.6蛋白质印迹分析AE组细胞处理同1.5。每组均加人1g/mL牙龈叭啉单胞菌LPS刺激细胞2 4h后收集细胞，在冰冷的RIPA缓冲液中裂解人PDLCs提取总蛋白。BCA定量试剂盒定量裂解液中蛋白浓度。等量蛋白样品在4%12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离后，转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜用3%牛血清白蛋白进一步封闭，然后将膜与特异性的NLRP3抗体、Caspasse-1抗体、ASC抗体、p-AMPK抗体、AMPK抗体和GAPDH抗体在4下孵育过夜。随后将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1h，通过增强化学发光检测试剂盒检测蛋白表达。ImageJ软件进行蛋白条带定量分析，以GAPDH为内参蛋白，以目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值表示目的蛋白相对表达量1.7线粒体复合体I活性测定AD组细胞处理同1.5，线粒体分离试剂盒纯化人PDLCs细胞线粒体。根据复合物I活性测定试剂盒说明书检测线粒体复合物I的活性。微孔板分光光度计检测波长340 nm时的数值。1.8统计学分析数据均表示为平均值标准差，采用SPSS20.0软件进行统计分析，样本间的差异使用单因素方差分析结合Dunnett比较,P0.05）；而当浓度高于40mmol/L时,细胞活性较阴性对照组明显降低（P0.05），而C组IL-1和IL-18表达明显增多,差异具有统计学意义（P0.01）。D 组IL-1和IL-18表达水平较C组明显降低（P0.01）（图2)。以上结果表明渗透压的改变不影响IL-1和IL-18分泌；但是高糖可以增加IL-1和IL-18的表达，且二甲双胍能部分逆转。*1.2阴性对照1.0a10mmol/L二甲双胍20mmol/L二甲双胍0.840mmol/L二甲双胍a80mmol/L二甲双胍160mmol/L二甲双胍0.60.4A组B组C组*:P0.05;*:P0.01图1MTT法确定二甲双胍的最佳浓度Fig.1MTT method was used to determine the optimalconcentration of metformin*A2000160012008004000A组B组C组D组*B600(Tu/8d)/鲁至(8 1-TI4002000A组B组C组D组A：IL-1质量浓度检测；B:IL-18质量浓度检测；*：P0.01图2ELISA检测IL-1和IL-18表达Fig.2ELISA method was used to detect the expressionof IL-1andIL-182.3二甲双胍激活AMPK减少高糖环境下的NLRP3炎症小体的激活蛋白质印迹所示，同样LPS刺激下，与A组相比,B组中NLRP3、Ca s p a s e-1、A SC和p-AMPK表达量没有明显的变化；而C组中NLRP3、Ca s p a s e-1和ASC表达明显增多,p-AMPK表达显著降低，差异具有统计学意义（P0.05）。与C组相比,D组NLRP3和Caspase-1表达明显降低，p-AMPK表达显著增高，差异具有统计学意义（P0.05）;C组线粒体复合体I的活性明显增加(P0.01）;D 组经40 mmol/L二甲双胍处理后,线粒体复合体I活性明显下降（P0.01）（图4）。778胡萍，等.二甲双胍调节高糖环境下人牙周膜细胞NLRP3炎症小体激活的机制研究AA组B组C组D组B6口A组*NLRP37厂图B组口C组Caspase-14D组*ASCP-AMPK*2*AMPKGAPDHNLRP3Caspase-1ASCP-AMPK/AMPKA：蛋白质印迹代表性条带；B：使用ImageJ软件标准化印迹条带的统计结果；*：P0.01图3蛋白质印迹检测二甲双胍对NLRP3炎症小体和AMPK通路蛋白表达的影响Fig.3Western blot was used to detect the effect of metformin on NLRP3 and AMPK pathway*20A组B组C组D组*:P0.01图4二甲双胍抑制线粒体复合体I的活性Fig.4Metformin inhibited the activity of mitochondrialcomplex2.5AMPK抑制剂减轻二甲双胍对NLRP3通路的抑制作用为了深人了解二甲双胍、AMPK和NLRP3通路之间的关系，本实验引人AMPK抑制剂化合物C处理人PDLCs。研究发现与C组相比,在D组中降低的IL-1、IL-18 以及NLRP3、Ca s p a s e-1表达在E组中均明显增加（P0.01)（图5）。A*B*2.000800r1600600120040080020040000C组D组E组C组D组E组口C组D组E组CD1.2*C组 D组 E组NLRP30.8Caspase-1ASC0.4GAPDH0NLRP3Caspase-1ASCA：ELISA 检测IL-1;B:ELISA检测IL-18;C蛋白质印迹代表性条带；D：条形图表示使用ImageJ软件标准化印迹条带的定量结果；*：P0.01图5AMPK抑制剂阻断二甲双胍对人PDLCsNLRP3通路的抑制作用和炎症保护Fig.5AMPK inhibitors blocked the inhibitory effect of metformin on the NLRP3 and inflammatoryprotectionin human PDLCs3讨论NLRP3炎性小体主要由感受器NLRP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-likeprotein containingaCARD,ASC）及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific pro-teinase-1,Caspase-1)前体(pro-Caspase-1)组成 NLRP3作为NLRP3炎症小体的核心成分，有负责779.2023年9 月口腔医学第43卷第9 期刺激识别、富含亮氨酸的重复序列，驱动自寡聚的核苷酸结合寡聚结构域以及吡喃结构域（pyrindomain,PYD）。NLRP3通过同源PYD结构域与ASC相互作用，ASC的CARD结构域允许同源CARD结构域相互作用并招募Caspase-1。在受到特定信号刺激时，NLRP3发生寡聚化，逐步招募ASC和pro-Caspase-1形成多蛋白复合物，诱导pro-Caspase-1自我剪切成活化的Caspase-1,进而将前体形式的IL-1和IL-18剪切成具有活性的IL-1和IL-18,触发炎症级联反应,放大炎症效应12 。许多外界刺激，如LPS、高糖环境、三磷酸腺苷和晶体颗粒，均可激活NRLP3炎症小体，进而导致促炎细胞因子 IL-1和 IL-18 的释放13相较单纯的牙周炎患者，伴糖尿病牙周炎患者上皮和结缔组织中可检测到更强的NLRP3和ASC蛋白染色模式,更高水平的CASP1mRNA、IL-1和IL-18的表达，同时伴随着更严重的牙周组织破坏14。在多种细胞中证实高水平葡萄糖是增加NLRP3炎症小体的诱因15。在牙周组织中,高糖可激活NLRP3炎症小体,诱导人牙龈成纤维细胞中IL-1表达,加剧牙龈组织炎症16-17 。在本研究中，LPS刺激下，相较于正常糖浓度，高糖浓度下的人PDLCs中NLRP3炎症小体组分NLRP3和Caspase-1均明显增加,分泌到培养基中的IL-1和IL-18明显增多，提示NLRP3炎症小体的激活增加可能是伴糖尿病牙周炎炎症加重的因素二甲双胍是糖尿病治疗的经典药物,在糖尿病患鼠的脂肪组织和糖尿病患者的单核细胞源性巨噬细胞中可观察到二甲双胍调节激活的NLRP3调控炎症18-19。近年来,二甲双胍对糖尿病并发症的作用是新兴研究热点，其可降低不同实验性牙周炎大鼠模型的炎症反应、氧化应激和骨丢失2 0-2 1。有研究发现,在伴糖尿病牙周炎小鼠模型中，二甲双胍治疗可显著改善牙周感染和组织破坏，并降低血糖浓度和血清中IL-1水平；二甲双胍可能通过降低巨噬细胞和牙龈组织中的NLRP3炎症体活性来抑制炎症状态2-2 3。本研究发现,二甲双胍下调了高糖及LPS诱导的人PDLCs中NLRP3和Caspase-1的表达，减少了IL-1和IL-18的分泌，提示二甲双胍可以通过抑制人PDLCs中NLRP3炎症小体的激活减轻伴糖尿病牙周炎的炎症反应,对二甲双胍靶向NLRP3炎症小体治疗伴糖尿病牙周炎提供新的证据支持。AMP蛋白激酶（AMP-activated proteinkinase,AMPK)是调节炎症小体激活的主要通路之一2 4。O二甲双胍作为AMPK通路的激动剂在以往的文献中多有报道，如在心肌细胞中，二甲双胍通过激活AMPK通路减少了高糖诱导增加的NLRP3、Caspase-1 和IL-125。本研究中,二甲双胍明显升高了因高糖刺激而明显降低的p-AMPK表达,同时引人AMPK通路抑制剂逆转了二甲双胍的炎症保护作用。本研究首次证实了二甲双胍作为AMPK激动剂调节NLRP3炎症小体来保护高糖状态下人PDLCs。线粒体复合体I是NLRP3炎症小体的调节因子，线粒体复合体I功能缺失阻止了NLRP3炎症小体的激活2 6 。以往数据表明,线粒体是二甲双胍的主要亚细胞靶点，二甲双胍可通过抑制体外培养心肌细胞中的线粒体复合体I活性，减少NLRP3炎症小体的激活，从而减轻高糖诱导的糖尿病心肌病2 5。本研究同样也发现二甲双胍可能通过抑制线粒体复合体I的活性减少高糖对人PDLCs中NLRP3炎症小体的激活,从而减轻高糖诱导的炎症，但课题组未找到合适的线粒体复合体I激动剂来进一步证实这个结论。综上所述，本研究提示二甲双胍可通过激活AMPK通路和抑制线粒体复合体I，抑制由高糖引起的人PDLCs中NLRP3炎症小体的激活和炎症因子的表达,对二甲双胍治疗伴糖尿病牙周炎的分子机制提供了进一步的理解。参考文献1Wu CZ,Yuan YH,Liu HH,et al.Epidemiologic relationship be-tween periodontitis and type 2 diabetes mellitus J.BMC OralHealth,2020,20(1):204.2How KY,Song KP,Chan KG.Porphyromonas gingivalis:An o-verview of periodontopathic pathogen below the gum line J.FrontMicrobiol,2016,7:53.3张睿，葛少华。二甲双胍潜在用途研究进展J口腔医学，2018,38(10):938-941.4Hattori Y,Suzuki K,Hattori S,et al.Metformin inhibits cytokine-induced nuclear factor kappa B activation via AMP-activatedprotein kinase activation in vascular endothelial cells J.Hyper-tension,2006,47(6):1183-1188.5Deng J,Zeng LS,Lai XY,et al.Metformin protects against intes-tinal barrier dysfunction via AMPK1-dependent inhibition of JNKsignalling activationJ.J Cell Mol Med,2018,22(1):546-557.6Cahova M,Palenickova E,Dankova H,et al.Metformin preventsischemia reperfusion-induced oxidative stress in the fatty liver byattenuation of reactive oxygen species formation J.Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol,2015,309(2):G100-G111.7Son HJ,Lee J,Lee SY,et al.Metformin attenuates experimental（本文编辑：汪悦）780胡萍，等.二甲双胍调节高糖环境下人牙周膜细胞NLRP3炎症小体激活的机制研究autoimmune arthritis through reciprocal regulation of Th17/Tregbalance and osteoclastogenesis J.Mediators Inflamm,2014,2014:973986.8Tan YM,Chen JS,Jiang YT,et al.The anti-periodontitis actionof metformin via targeting NLRP3 inflammasome J.Arch OralBiol,2020,114:104692.9Hu P,Zhu CX.Betulinic acid exerts anti-inflammatory activity inhumanperiodontalligamentcellsstimulatedwithlipopolysaccharide and/or high glucose J.Endocr Metab ImmuneDisord Drug Targets,2023,23(1):95-104.10 古胡萍，黄丹.桦木酸调节血红素加氧酶-1降低脂多糖和尼古丁联合诱导的炎症反应J.临床口腔医学杂志，2 0 2 2，38(7):395-398.11 He Y,Hara H,Nunez G.Mechanism and regulation of NLRP3 in-flammasome activationJ.Trends Biochem Sci,2016,41(12):1012-1021.12 Elliott EI,Sutterwala FS.Initiation and perpetuation of NLRP3 in-flammasome activation and assembly J.Immunol Rev,2015,265(1):35-52.13 Cassel SL,Joly S,Sutterwala FS.The NLRP3 inflammasome:Asensor of immune danger signalsJ.Semin Immunol,2009,21(4):194198.14 Garcia-Hernandez AL,Munioz-Saavedra AE,Gonzalez-Alva P,etal.Upregulation of proteins of the NLRP3 inflammasome inpatients with periodontitis and uncontrolled type 2 diabetes J.Oral Dis,2019,25(2):596-608.15 Wu M,Lu L,Guo KF,et al.Vitamin D protects against high glu-cose-induced pancreatic-cell dysfunction via AMPK-NLRP3 in-flammasome pathwayJ.M o l Ce l l En d o c r i n o l,2 0 2 2,547:111596.16 Vo TTT,Lee CW,Chiang YC,et al.Protective mechanisms ofTaiwanesegreenpropolistowardhighglucose-inducedinflammation via NLRP3 inflammasome signaling pathway inhuman gingival fibroblastsJ.J Periodontal Res,2021,56(4):804-818.17 Huang X,Yang X,Ni J,et al.Hyperglucose contributes to peri-odontitis:Involvement of the NLRP3 pathway by engaging theinnate immunity of oral gingival epithelium J.J Periodontol,2015,86(2):327-335.18 Li AY,Zhang SH,Li J,et al.Metformin and resveratrol inhibitDrpl-mediated mitochondrial fission and prevent ER stress-associ-ated NLRP3 inflammasome activation in the adipose tissue of dia-betic miceJ.Mol Cell Endocrinol,2016,434:36-47.19 Lee HM,Kim JJ,Kim HJ,et al.Upregulated NLRP3 inflamma-some activation in patients with type 2 diabetes J.Diabetes,2013,62(1):194-204.20 Araujo AA,Pereira ASBF,Medeiros CACX,et al.Effects of met-formin on inflammation,oxidative stress,and bone loss in a ratmodel of periodontitisJ.PLoS One,2017,12(8):e0183506.21 Bak EJ,Park HG,Kim M,et al.The effect of metformin on alveo-lar bone in ligature-induced periodontitis in rats:A pilot study J.JPeriodontol,2010,81(3):412-419.22 Zhou XY,Zhang P,Wang Q,et al.Metformin ameliorates experi-mental diabetic periodontitis independently of mammalian target ofrapamycin(mTOR)inhibition by reducing NIMA-related kinase 7(Nek7）e x p r e s s i o n J.JPe r i o d o n t o l,2 0 19,90（9):10 32-1042.23 Zhou XY,Wang Q,Nie L,et al.Metformin ameliorates theNLPP3 inflammasome mediated pyroptosis by inhibiting the ex-pression of NEK7 in diabetic periodontitis J.Arch Oral Biol,2020,116:104763.24 Chen MY,Ye XJ,He XH,et al.The signaling pathwaysregulating NLRP3 inflammasome activation J.Inflammation,2021,44(4):1229-1245.25 Yang F,Qin Y,Wang YQ,et al.Metformin inhibits the NLRP3inflammasome via AMPK/mTOR-dependent effects in diabetic car-diomyopathyJ.Int J Biol Sci,2019,15(5):1010-1019.26 Billingham LK,Stoolman JS,Vasan K,et al.Mitochondrial elec-tron transport chain is necessary for NLRP3 inflammasomeactivationJ.Nat Immunol,2022,23(5):692-704.（修回日期：2 0 2 3-0 4-16)