发酵肉制品中抗氧化活性乳酸菌的筛选及鉴定.pdf

2023年第36 卷第11期发酵肉制品中抗氧化活性乳酸菌的筛选及鉴定王佳佳，吴晓光，刘学军（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130 0 2 2）摘要：从7 种传统发酵肉制品中初步分离出54株菌株，以过氧化氢耐受性作为初筛指标，以DPPH自由基、羟基自由基、还原能力作为复筛指标，筛选出1株抗氧化活性较高的乳酸菌。结果表明：菌株AC9具有良好的过氧化氢耐受性、胃肠道耐受性及抑菌活性,且对DPPH自由基的清除率达9 4.8 5%0.2 0%、对羟基自由基的清除率达44.0 3%0.41%、表示还原能力的吸光度为2.2330.003。经鉴定AC9为戊糖片球菌，具有较强的抗氧化活性。关键词：发酵肉制品；乳酸菌；抗氧化活性；戊糖片球菌；筛选与鉴定Screening and identification of lactic acid bacteria withantioxidant activity in fermented meat productsWANG Jia-jia,WU Xiao-guang,LIU Xue-jun(School of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130022,Jilin,China)Abstract:54 strains were isolated from 7 kinds of traditional fermented meat products.Hydrogen perox-ide tolerance was used as the primary screening index,and DPPH free radical,hydroxyl free radical andreducing ability were used as the secondary screening index.The results showed that strain AC9 had goodhydrogen peroxide tolerance,gastrointestinal tolerance and antibacterial activity,and the DPPH radicalscavenging rate was 94.85%0.20%,the hydroxyl radical scavenging rate was 44.03%0.41%,and the absorbance indicating the reducing ability was 2.233 0.003.AC9 was identified as Pediococcuspentosaceus with strong antioxidant activity.Key words:fermented meat product;lactic acid bacteria;antioxidant activity;Pediococcus pentosaceus;screening and identification中图分类号：TS251.7机体代谢过程会产生大量的自由基,自由基的大量累积会造成人体内氧化还原平衡被打破。过量的自由基会进一步破坏蛋白质、脂质、核酸等生物大分子，最终导致机体损伤和疾病 。大多数生物体具有酶促和非酶促抗氧化防御和修复系统，然而这些天然抗氧化系统通常不足以防止生物体受到氧化损伤，而合成抗氧化剂由于具有致肝损伤和致癌性,安全性受到质疑 2 。因此,从生物资源中开发更安全的天然抗氧化剂替代合成抗氧化剂受到了极大的关注。乳酸菌除了可以改善人体肠胃功能、抑制胆固醇吸收和增强人体的免疫力外，还具有抗衰老和抗收稿日期：2 0 2 2-11-10作者简介：王佳佳（19 9 8 一），女，硕士，研究方向为动物产品及功能性食品。通信作者：吴晓光（19 7 3一），女，硕士，副教授，研究方向为动物性食品加工；刘学军（19 6 3一），男,博士,教授,研究方向为动物性食品加工。粮食与油脂文献标志码：A文章编号：10 0 8-9 57 8(2 0 2 3)11-0 149-0 5氧化活性 3。从传统日本食品中分离出来的植物乳杆菌7 FM10表现出对DPPH和超氧化物自由基的清除能力 4。本研究从传统发酵肉制品中分离并筛选出1株具有高抗氧化活性及良好胃肠道耐受性的乳酸菌，该菌株可以被广泛用于发酵食品，亦具有应用于功能食品的潜力。1材料与方法1.1材料与试剂咸肉、腊肉，安徽省合肥市；腊肠，江西省南昌市;干鱼、腊肠、风干牛肉、风干马肉,新疆维吾尔自治区阿勒泰地区;HBI乳酸菌生化鉴定条（GB）;149150PBS缓冲液、过氧化氢、DPPH、邻菲啰啉、硫酸亚铁、三氯乙酸、氯化铁、铁氰化钾、牛肉膏、蛋白陈、酵母浸粉等,分析纯;MRS液体和固体培养基、选择培养基（在MRS固体培养基中添加质量分数2%的碳酸钙）,实验室自制。1.2仪器与设备TH2-300C型恒温培养摇床，上海一恒科学仪器有限公司;HWS-80型生化培养箱,天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司LDZM-80KCS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;Lambda365型紫外可见分光光度计，铂金埃尔默仪器（上海）有限公司；JY99-IIDN型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司;AXI-08X拍打式无菌均质器，上海归永电子有限公司。1.3试验方法1.3.1样品采集与菌株的分离筛选采集来自安徽省合肥市、江西省南昌市、新疆维吾尔自治区阿勒泰地区的共计7 种当地传统发酵肉制品。将7 种样品各取10.0 g置于均质袋中，加入9 0 mL生理盐水,使用均质器拍打5min,再用生理盐水进行梯度稀释（分别稀释成10-1、10-、10-3、10-4、10-5、10-倍体积），取各稀释梯度样品100L均匀涂布于选择培养基中，以37 培养48h。挑取平板上具有较大溶钙圈的单菌落，反复划线纯化。挑选具有典型乳酸菌特征的单菌落进行革兰氏染色及与质量分数3%过氧化氢接触酶反应,选择革兰氏阳性且过氧化氢接触酶反应呈阴性的菌株,挑至 MRS液体培养基中培养3代后,置于甘油中，以-8 0 保存待用。1.3.2菌株的过氧化氢耐受能力分析参照张俊等 5 的方法,略作修改。以MRS液体培养基体积计,将活化后的菌株按1%的接种量接种于MRS液体培养基中。试验组为MRS液体培养基中添加浓度为0.5、1.0.2.0 mmol/L的过氧化氢，对照组不进行任何处理。置于37 恒温振荡摇床中培养2 4h后,测量菌液在波长6 0 0 nm处的吸光度,菌株存活率计算见式（1）。A1菌株存活率=100%A2式中：A，为样品组的吸光度;A2为对照组的吸光度。1.3.3菌株发酵上清液(CFS）、完整细胞(IC)及无细胞提取液(CFE)的制备将菌株活化2 代后接入MRS液体培养基中,以粮食与油脂37培养2 4h,在4下,以30 0 0 g离心10 min,分别收集上清液和菌体沉淀（IS），使用0.2 2 m微孔滤膜过滤上清液得到CFS,IS经磷酸盐缓冲液(pH7.07.3)清洗2 3遍后,将菌体浓度调至110CFU/mL,得到菌悬液。将菌悬液平均分为2组，1组称作ICl6;另1组使用超声冰浴破碎,至显微镜下观察不到IC,在4下,以30 0 0 g离心10 min,取上清液,经0.2 2 m微孔滤膜过滤即为CFE7。1.3.4抗氧化活性菌株的筛选1.3.4.1菌株的DPPH自由基清除能力测定菌株的DPPH 自由基清除能力,参照文献 8 的方法并稍加改动,DPPH自由基清除率计算见式(2)。DPPH自由基清除率=式中：A，为样品组,CFS/IC/CFE与DPPH溶液混合时的吸光度;A4为空白组,CFS/IC/CFE与2 mL无水乙醇溶液的吸光度;A。为对照组,为2 mL DPPH溶液与2 mL无水乙醇的吸光度。1.3.4.2菌株的羟基自由基清除能力测定参照文献 9-10 的方法测定菌株的羟基自由基清除率,计算见式（3）。羟基自由基清除率=A,-A,式中：As为样品组的吸光度;A，为未损伤组的吸光度;A，为损伤组的吸光度。1.3.4.3菌株的还原能力测定根据文献 1 的方法,并作修改。在CFS/IC/CFE样品中分别加人2.5mL质量分数1%铁氰化钾、2.5mL0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）,振荡均匀后,以50 水浴2 0 min,迅速冷却,加人2.5mL质量分数10%三氯乙酸溶液，离心后取上清液2.5mL,加入蒸馏水2.5mL、质量分数为0.1%氯化铁溶液0.5mL,在室温下静置10 min后，在波长700nm处测定吸光度，吸光度越高代表还原力越强。1.3.5菌株的鉴定1.3.5.1糖醇发酵试验(1)对筛选出的菌株使用HBI乳酸菌生化鉴定条进行糖醇发酵试验，按照伯杰细菌系统鉴定手册对菌株进行初步鉴定。1.3.5.216S r DNA分子鉴定将菌株送到北京奥韦森基因公司进行16 SrD-2023年第36 卷第11期A;-A4)100%AA,-A100%(2)(3)2023年第36 卷第11期NA分子鉴定,并基于16 S rDNA 分析得到的基因序列与DNA序列数据库对比，使用MEGA7软件构建系统发育树。1.3.6菌株的胃肠道耐受性及抑菌活性测定1.3.6.1菌株对模拟人胃肠道的耐受性将活化后的菌株以10%的接种量（以胃液体积计)接种到模拟胃液中,以37 培养,分别在0、3h取样进行平板计数。取在模拟胃液中培养3h后的菌液1mL接种到9 mL的模拟肠液中,以37 培养,分别在0、3、6、2 4h取样进行平板计数。菌株存活率计算见式(4）。菌株存活率=1gN2式中:N,为胃肠道模拟后的菌落数,CFU/mL;N为胃肠道模拟前的菌落数,CFU/mL。1.3.6.2菌株的抑菌活性以埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及单核细胞性李斯特菌作为指示菌,采用牛津杯打孔法测定乳酸菌的抑菌活性，用游标卡尺测量抑菌圈直径。1.4数据分析各试验均重复3次，数据均采用平均值标准差的形式表示;使用SPSS Statistics23统计软件进行统计分析；使用Origin2018软件进行图表绘制。2结果与讨论2.1菌株的分离筛选结果2.1.1 初步分离结果从7 种传统发酵肉制品中共分离得到54株菌株(革兰氏染色呈阳性,过氧化氢酶试验呈阴性)，编号如表1所示，保存待用。表1菌株初步分离结果样品菌株数量合肥咸肉8合肥腊肉10南昌腊肠8阿勒泰鱼干7阿勒泰腊肠9阿勒泰牛肉干4阿勒泰马肉干82.1.2部分菌株的形态观察图1为菌株Y2与AC9的菌落形态及其经过革兰氏染色后在10 0 倍光学显微镜下观察到的菌体形态。由图1可知：菌落呈边缘整齐的圆形或椭圆形，粮食与油脂乳白色，有光泽,符合乳酸菌的外观特征，菌体在显微镜下呈短杆状或球状。Y2B图1分离菌株的菌落型态和菌体型态（10 0）1gN注：A为菌株的菌落形态;B菌株的菌体形态。100%(4)菌株编号HX1-8HL1-10NC1-8Y1-7AC1-9FN1-4FM1-8151AC9AC92.2菌株的过氧化氢耐受能力过氧化氢是1种强氧化物质，乳酸菌在受到氧化胁迫时，会分泌氧化酶以减轻氧化胁迫对菌株的损伤,由此提高菌株的存活率，因此菌株的过氧化氢耐受性可作为抗氧化乳酸菌筛选的初筛指标 12 。表2 为在54株菌株中,过氧化氢耐受能力较好的13株菌株及阳性对照（本实验室鉴定并保存的1株嗜酸乳杆菌 SS)的过氧化氢耐受能力。当 MRS 液体培养基中过氧化氢浓度为0.5mmol/L,以37 培养2 4 h后,所有菌株的存活率均在9 0%以上。当MRS液体培养基中过氧化氢浓度为2.0 mmol/L时,所有菌株均几乎不能存活。当 MRS 液体培养基中过氧化氢浓度为1.0 mmol/L时,不同菌株的存活率为（4.2 6 0.2 2）%（7 4.510.8 1）%，菌株间过氧化氢耐受能力有较大差异，选取过氧化氢耐受能力高于阳性对照的13株菌进行下一步筛选。表2 乳酸菌在不同浓度H,0，下的存活率编号菌株名称0.5 mmol/L1HX12HX23HX54HX65HX76HL107AC18AC39AC910FN211FN412FM713FM814SS/%1.0 mmol/L2.0 mmol/L97.94 0.9652.67 0.7591.08 1.0149.28 1.1094.19 1.0452.91 0.8396.40 1.3048.57 0.7097.50 1.5537.37 0.7992.50 0.3556.08 0.3397.39 1.1174.51 0.8197.16 0.5970.52 0.4396.98 0.6572.74 0.9198.06 0.9154.81 0.6399.31 1.1452.61 0.9597.17 1.1347.10 0.4399.36 1.0843.53 0.4696.82 0.9936.13 0.890.10 0.010.09 0.010.10 0.010.10 0.000.09 0.010.10 0.010.08 0.010.09 0.020.10 0.020.11 0.010.10 0.010.09 0.010.08 0.020.08 0.021522.3菌株的抗氧化活性由图2 可知:CFS 组的抗氧化活性最强,高于IC组和CFE组,表示乳酸菌抗氧化的主要活性成分在乳酸菌的胞外代谢物中。菌株 AC9的 CFS 及IC 组的抗氧化活性显著高于其他菌株,其CFS对 DPPH自由基的清除率高达9 4.8 5%0.2 0%,对羟基自由基的清除率达到44.0 3%0.41%，表示还原能力的吸光度为2.2 330.0 0 3。由此可知，菌株AC9有着良好的抗氧化活性。综上，选择分离自阿勒泰100CFSIVCFEbcbcdb30de20100HX1 HX2 HX5 HX6 HX7 HL10 AC1 AC3 AC9 FN2 FN4 FM7 FM850CFSICCFE40bcfe30bdde2010HX1 HX2 HX5 HX6 HX7 HL10 AC1 AC3 AC9 FN2 FN4 FM7 FM82.5CFSICIVCFE2.42.32.22.12.00.20.1dHX1 HX2 HX5 HX6 HX7 HL10 AC1 AC3 AC9 FN2 FN4 FM7 FM8图2 菌株的抗氧化活性结果注：每种菌株间不同字母表示差异显著(P0.05）。粮食与油脂腊肠的菌株AC9作为优良乳酸菌进行后续研究。2.4菌株鉴定结果2.4.1糖发酵试验结果菌株AC9的糖发酵试验结果如表3所示,根据结果,并参考文献 13,初步判断菌株 AC9 为戊糖片球菌。表3菌株AC9的生理生化鉴定结果名称结果七叶苷+纤维二糖+麦芽糖+acdedefg菌株cdhiCefabdf工2023年第36 卷第11期名称结果山梨醇一燕糖棉子糖bcddeabkbdbf菌株ahh菌株bcdeedbChcdaa甘露醇水杨苷注：“+”表示阳性；“_”表示阴性。2.4.216SrDNA分子鉴定利用BLAST软件，从DNA序列数据库中选择10个菌株的16 SrDNA基因序列,利用MEGA7软件构建系统发育树。由图3可知：菌株AC9与戊糖片球菌ENM104（M N9 15130.1）等戊糖片球菌的同源性达到10 0%,并结合糖发酵试验结果证实菌株AC9为戊糖片球菌。厂戊糖片球菌39 7(MT604839.1)一戊糖片球菌HN10(MT472104.1)戊糖片球菌ENM104(MN915130.1)戊糖片球菌LABD14(MK758078.1)戊糖片球菌L32(MN904843.1)戊糖片球菌LB22(MN410580.1)戊糖片球菌LACT05(MN252397.1)戊糖片球菌L165(MN166320.1)戊糖片球菌SVCE01(MN148646.1)一戊糖片球菌（(MZ959470.1)5-AC9植物乳杆菌P14(MG210918.1)图3系统发育树2.5菌株的胃肠道耐受性及抑菌活性测定结果2.5.1菌株对模拟人胃肠道的耐受性由表4 5可知：菌株AC9具有良好的胃肠道eC菊糖+乳糖eb+表4菌株AC9在模拟胃液中的存活率菌落数/lg(CFU/mL)菌株名称o hAC98.55 0.05存活率/%3 h8.11 0.0394.86 0.882023年第36 卷第11期菌株名称0 hAC98.06 0.04耐受性。2.5.2菌株的抑菌活性AC9对埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及单核细胞性李斯特菌的抑制能力如表6 所示。由6 表可知：菌株AC9对埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞性李斯特菌均有一定的抑制能力。表6 菌株AC9对指示菌的抑制作用抑菌圈直径/mm菌株名称埃希氏大肠杆菌AC919.51 0.2422.34 0.0920.14 0.313结论本研究分离到的 AC9为戊糖片球菌,在H,O,浓度为1.0 mmol/L时，存活率为7 2.7 4%0.9 1%，其CFS对DPPH自由基的清除率则高达9 4.8 5%0.20%，对羟基自由基的清除率为44.0 3%0.41%，表示还原能力的吸光度为2.2 330.0 0 3，在同类特性菌株中具有一定优势。戊糖片球菌还具有良好的胃肠道耐受性及抑菌活性,在发酵食品及功能食品等领域具有重要的价值。由结果可知,戊糖片球菌中CFS组的抗氧化活性远远高于IC组和CFE组，由此推测该菌株的抗氧化活性成分可能存在于胞外分泌物中,可对该菌株的抗氧化活性成分进行进一步分析，提取并纯化其可能的活性成分，对其进行深度研究或将其开发为新型抗氧化剂。【参考文献【1刘旭东，张玉超，朱思洁，等积棋果梗多糖的提取工艺优化及其抗氧化性 J食品工业科技，2 0 2 3，44(11):230-237.2 LUO D H,FANG B S.Structural identification of ginsengpolysaccharides and testing of their antioxidant activities J.Carbohydrate Polymers,2008,72(3):376-381.3 LEE B G,KIM J S,KANG Y M,et al.Antioxidant activi-ty and-aminobutyric acid(GABA)content in sea tanglefermented by Lactobacillus brevis BJ20 isolated from tradi-粮食与油脂表5菌株AC9在模拟肠液中的存活率菌落数/Ig(CFU/mL)3h6h7.88 0.057.68 0.06金黄色单核细胞性沙门氏菌葡萄球菌18.24 0.11 153存活率/%24 h3h6.15 0.0597.72 0.17tional fermented foods J.Food Chemistry,2010,122(1):271-276.4 KANNO T,KUAD T,AN C,et al.Radical scavengingcapacities of saba-narezushi,Japanese fermented chubmackerel,and its lactic acid bacteria J.LWT-Food Sci-ence and Technology,2012,47(1):25-30.【5】张俊，王炳文，赵保堂，等甘南传统耗牛酸奶来源抗氧化性乳酸发酵菌株的筛选 J食品与发酵工业,2019,45(15):74-80.【6 陈明青藏高原高抗氧化活性乳酸菌的筛选及其抗氧化特性研究 D兰州：兰州大学，2 0 17.李斯特菌【7】张香美，赵玉星，闫晓晶，等.1株具抑菌和抗氧化活性乳酸菌的筛选及鉴定 J：食品科学，2 0 18，39(2)：93 98.8 ROZZELLO C G,LORUSSO A,RUSSO V,et al.Im-proving the antioxidant properties of quinoa flour throughfermentation with selected autochthonous lactic acid bac-teria J.International Journal of Food Microbiology,2017,214:252-261.【9 刘天祎，潘道东抗氧化活性乳酸菌的筛选 J食品科学,2 0 11,32(19)：12 5-12 9.10】戴志伟，孔令明，刘伟，等西梅发酵乳酸菌的筛选、鉴定及其抗氧化特性研究 J中国食品学报，2 0 2 2,22(7):310-318.11 BARLA F,KOYANAGI T,TOKUDA N,et al.The-aminobutyric acid-producing ability 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