放血疗法促高原慢性低氧下雄性大鼠红细胞衰亡的实验研究.pdf

15820232023年JOURNALOFMEDICINEAND BIOLOGYNOVol.44第3 期第44卷杂志国高原医生物放血疗法促高原慢性低氧下雄性大鼠红细胞衰亡的实验研究*冯琳*，王顺娟”，刘文婧”，李润乐，汤锋1.5*（1.青海大学高原医学研究中心，西宁8 10 0 0 1;2.青海省人民医院，西宁8 10 0 0 7；3.青海省藏医院，西宁8 10 0 0 7;4.青海大学基础医学部，西宁8 10 0 16；5.青海省高原医学应用与基础研究重点实验室，西宁8 10 0 0 1）摘要要目的探究放血疗法是否参与了对慢性低氧环境下雄性大鼠红细胞衰亡的调控。方法低氧组（Hypoxia）和放血组（Phlebotomy）雄性大鼠置模拟海拔50 0 0 m的低压氧舱2 8 d,Phle-botomy分别于第7、14、2 1d经尾静脉放血50 0 L进行动态血常规分析。4w后取血进行血细胞分析、渗透脆性检验、红细胞凋亡检测、网织红细胞检测等。结果放血后雄性大鼠红细胞数量和血红蛋白含量结果：Hypoxia（10.58 0.6 3）与Phlebotomy（9.58 0.31），H y p o x i a（17 4.50 7.8 7）与Phlebotomy（16 1.17 4.40）,组间差异有统计学意义（P=0.004,P=0.037）。放血后红细胞比容结果：Hypoxia（6 1.36 2.2 1）与Phlebotomy（56.7 31.7 0），组间差异有统计学意义（P=0.001）。流式细胞术分析红细胞衰亡：Hypoxia（0.0 7 0.0 1）与Phlebotomy（0.10+0.0 2），组间差异有统计学意义（P=0.0 0 1）。红细胞衰亡动态结果：2 w（0.2 0 0.0 1）与3w（0.150.0 2）,3w（0.150.0 2）与4w（0.0 90.0 2），组间差异有统计学意义（P=0.000,P=0.000）。网织红细胞动态结果：1w（0.0 40.03）、2 w（0.0 50.0 4）、3w（0.0 40.0 2）、4w(0.0 6 0.0 3）组间差异无统计学意义。结论放血疗法可促进高原慢性低氧下雄性大鼠红细胞的衰亡，降低慢性低氧对雄性大鼠红细胞衰亡的抑制作用。同时放血不会持续增加雄性大鼠红细胞衰亡，也不会持续刺激雄性大鼠网织红细胞增加关键词放血疗法；红细胞；低氧；网织红细胞中图分类号R392.12文献标志码ADOI10.13452/ki.jqmc.2023.03.002The influence of phlebotomyon/ptosis in male rats at chronic hypoxiaFeng Lin,Wang Shunjuan,Liu Wenjing”,Li Runle-,Tang Feng1,5*(1.Research Center for High Altitude Medicine,Qinghai University,Xining 810001,China;2.Qinghai Provincial Peoples Hospital,Xining 810007,China;3.Tibetan Hospital of Qinghai Province,Xining 810007,China;4.Graduate School of Qinghai University,Xining 810016,China;5.Qinghai Provincial Key Laboratory of Plateau Medical Application Foundation,Xining 810001)Abstract ObjectiveThis study evaluated the effect of phlebotomy on eryptosis in male rats of chronic hy-收稿日期：2 0 2 2-10-2 8：2 0 2 2 年度高原医学教育部重点实验室【青海省高原医学应用基础重点实验室（青海-犹他高原医学联合重点实验室）】开放课题（2 0 2 2-KF-04），青海大学医学院中青年科研基金团队项目（2 0 19-KT-01）；*：通信作者，教授，博士，冯琳（1995-），女，汉族，吉林籍，在读研究生159poxic environment.Method SD male rats in Hypoxia and Phlebotomy were placed in a hypobaric chamber at a sim-ulated altitude of 5 000 m for 28 days.500 L blood was removed from the tail vein on the 7th,14th and 21st day,respectively.After 4 weeks,the blood was collected for blood cellanalysis,osmotic brttleness test,erythrocyte apop-tosis and reticulocyte detection.Result The number of red blood cell(RBC)and hemoglobin(HGB)after phleboto-my:Hypoxia(10.580.63)V.S.Phlebotomy(9.580.31),Hypoxia(174.507.87)V.S.Phlebotomy(161.174.40),the difference between groups was statistically significant(P=0.004,P=0.037);The number of hematocrit(HCT):Hypoxia(61.362.21)V.S.Phlebotomy(56.731.70),the dfference between groups was statisticallysignificant(P=0.001);Eryptosis was analyzed by flow cytometry:Hypoxia(0.070.01)V.S.Phlebotomy(0.100.02),the difference between groups was statistically significant(P=0.001);Dynamic results of eryptosis by flowcytometry:2 w(0.200.01)V.S.3 w(0.150.02),3 w(0.150.02)V.S.4 w(0.090.02),the difference be-tween groups was statistically significant(P=0.000,P=0.000);Dynamic results of reticulocyte:1 w(0.040.03),2 w(0.050.04),3 w(0.040.02),4 w(0.060.03),the difference was not statistically significant.Conclusion Phlebotomy promotes the eryptosis under chronic hypoxia at high altitude,and reduced the inhibitoryeffect of chronic hypoxia on eryptosis.At the same time,phlebotomy does not continuously increase the eryptosis,nordoes it continuously stimulate the increase of reticulocytes in male rats.KeywordsPhlebotomy;Erythrocyte;Hypoxia;Reticulocyte本课题组前期研究发现，在慢性低氧环境下红细胞生成增加、衰亡减少。此研究结果在国际学界首次报道，并引发广泛关注。据此推测放血疗法可促高原慢性低氧下雄性大鼠红细胞衰亡。本课题就此开展相关研究，1材料与方法1.1材料1.1.1动物及分组SD雄性大鼠购自重庆腾鑫生物西安分公司生产许可证号：SCXK（浙）2 0 19-0 0 0 2，2 0 0 g/只。分为对照组（Control）、低氧组（Hypoxia）和放血组（Phlebotomy）。本研究通过青海大学医学院伦理委员会审查。1.1.2主要试剂和仪器AnnexinV-FITC、R e t ic-C o u n t 和高速分选流式细胞仪购自BD公司，中型低压氧舱购自贵州哈雷空天环境工程有限公司，全自动血液体液分析仪购自希森美康公司。1.2实验方法.2.1慢性低氧下红细胞增多雄性大鼠模型建立Control置青海大学医学院高原医学研究中心动物房2 8 d,Hypoxia和Phlebotomy置医学院低压氧舱2 8 d,Phlebotomy分别于第7、14、2 1d经尾静脉放血50 0 uL。1.2.2血细胞分析Phlebotomy于第7、14、2 1d用EDTA抗凝管采血 50 0 L,检测红细胞(Red blood cell count,RBC)数目、血红蛋白（Hemoglobin,HGB）含量、血细胞容积(Hematocrit,HCT）、血小板（Platelet,PLT）数量等指标。并于第2 8 d取三组雄性大鼠全血进行上述项目检测。1.2.3红细胞渗透脆性实验配置梯度浓度生理盐水1号（6.8 g/LNaCl）2号(6.4 g/L NaCl).12号(2.4g/L NaCl)和13号生理盐水（0.9%）及14号尿素（1.9%）、15号去离子水。流式管中按序号各添加50 0 L溶液，管中滴入一滴全血（约50 L），静置30 min观察血液渗透脆性并记录1.2.4红细胞衰亡检测全血离心(8 0 0 r/min)10 min,取血浆冻存。制备1xbufferrAnnexin V-FITC(BD)溶液,每管取110 个红细胞，用1xPBS缓冲液清洗两次。每管取110 个红细胞添加5LFITC试剂，在室温下避光孵育20 min,添加1xbufferrAnnexin V-FITC(BD)溶液至终体积50 0 L,过滤膜后使用流式细胞仪检测红细胞衰亡水平1.2.5网织红细胞检测全血离心（8 0 0 r/min）10 m i n,取血浆冻存。每管取5L红细胞添加1mLRetic-CountTM染色剂，在室温下避光孵育30 min。离心（8 0 0 r/min）5m i n弃上清，加入1mL1xPBS缓冲液，清洗两次，最后添加1xPBS缓冲液至终体积50 0 L,过滤膜后使用流式细胞仪检测网织红细胞（Reticulocyte,Ret）。1601.3统计学方法本课题所有数据均采用Graph-PadPrism6软件进行数据处理和统计分析。计量资料用均数土标准差（x士s）表示，组间比较采用单因素方差法分析，重复测量数据采用非参数检验法检验。P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1放血对血细胞的影响Hypoxia雄性大鼠置于模拟海拔50 0 0 m的低压氧舱饲养4w时从尾静脉采血，进行血常规检测，结果见表1。Hypoxia红细胞数量和血红蛋白含量显著增加，Phlebotomy相比于Control虽有增加，但明显低于Hypoxia。同样，Hypoxia红细胞比容显著高于Control和Phlebotomy。Co n t r o l 血小板数量显著高于Hypoxia和Phlebotomy，同时Phlebotomy相比于Hypoxia明显增加。Table1Blood Cell Count Analysis(xs)GroupnRBC/1012.L-1HCB/g L-1HCT/%PLT/10.L-1Control67.800.512122.33 15.0039.381.49923.83169.50Hypoxia610.580.63*174.507.87*61.362.21*643.33 75.75*Phlebotomy69.580.31*#161.174.40*#56.73 1.70*#686.6674.36*F46.7643.16240.2110.26P0.0010.0010.0010.002*:P0.05 was compared with control group;#:P0.05 was compared with model group2.2放血对红细胞渗透脆性的影响红细胞起始溶血浓度为(5.2 4.4)g/L NaCl 溶液，至低渗溶液中完全破裂，结果见图1。低氧促使红细胞在高于5.2 g/L浓度的NaCl溶液中破裂,红细胞渗透脆性增加。Phlebotomy和Control溶血水平基本一致。Phlebotomy、Co n t r o l 红细胞在NaCl溶液中起始溶血的浓度为5.2 g/L,Hypoxia红细胞在NaCl溶液中起始溶血的浓度为6.0 g/L。结果见表2。Table 2Hemolysis of different tube numbers in each group(%)TubeGroupn/Tube合计34567Control80(0)0(0)6(75.0)2(25.0)0(0)8(100.0)Hypoxia83(37.5)3(37.5)2(25.0)0(0)0(0)8(100.0)Phlebotomy80(0)0(0)4(50.0)2(25.0)2(25.0)8(100.0)(1)The number before the brackets in the table is the number of hemolysis tubes and the number in brackets is the percentage of hemolysis.Formula=The number of hemolysis tubes/The number of tubes in the groupx100%,for example,there have 6 hemolysis tubes in control,6/8x100=75%.(2)Tubeland 2 are unhemolysis tubes,tube 7-12 are complete hemolysis tubes.So they are not included in Table 2123456789101112131415ControlHypoxiaphlehotomyFigure 1Hypoxia increases the osmotic fragility of erythrocytes,which can be relieved by phlebotomy2.3放血对红细胞衰亡的影响Hypoxia雄性大鼠红细胞衰亡减少。表3显示，低氧可以抑制红细胞衰亡,经过放血治疗,Phleboto-my红细胞衰亡数量较Hypoxia显著增加。流式结果显示红细胞衰亡：Hypoxia（0.0 7 0.0 1）与Phle-botomy(0.100.02)相比,P=0.001;Control(0.100.01)与Hypoxia(0.070.01)相比,P=0.001。161Table 3Eryptosis was analyzed in different groups by flow cytometry(xs)GroupEryptosis in three groupControl60.100.01Hypoxia60.070.01*Phlebotomy60.100.02.*#F9.54P0.003*:P0.05 was Control compared with Hypoxia and Phlebotomy group.#:P0.05 was Hypoxia compared with Phlebotomy group图2 显示，放血可以促进红细胞在低氧下的衰亡；图3显示，当红细胞数量逐渐趋于正常状态时，红细胞衰亡数量逐渐减少。结果见表4,2 w（0.2 0 0.01)与3w(0.150.02)相比,P=0.001;3w(0.150.02)与4 w(0.090.02)相比,P=0.001。AControlHypoxiaPhlebotomy600-400-6.815.8910.1200-0333310-1010-10103-1000FITC-AFITC-AFITC-ABControl600-HypoxiaPhlebotomyJuno400-200-033-10010FITC-A(A)and(B)Rat erythrocytes binding Annexin V-FITC after phlebotomy in three groupFigure 2Eryptosis was analyzed in three groupA1w2W3w4W30021.820.614.75.89200100100103-10301031030103103010FITC-AFITC-AFITC-AFITC-AB1w6002W3W4W400200-033-10010FITC-A(A)and(B)Rat erythrocytes binding Annexin V-FITC after phlebotomy during the first week to the fourth weekFigure 3Eryptosis was analyzed by dynamic results162Table 4Dynamic results of eryptosis by flow cytometry(x+s)Time/wnEryptosis by dynamic170.210.02270.200.01370.150.02*470.090.02#F76.719P0.001*:P0.05 was 2 w compared with 3 w;#:P0.05 was 3 w compared with 4 w2.4放血对网织红细胞的影响图4、表5显示，网织红细胞数量增加则新生红细胞增加,随之成熟红细胞的数量增加,低氧和放血疗法均可以刺激网织红细胞增加,Hypoxia（0.0 40.0 1）与Phlebotomy（0.0 50.0 2）相比，组间差异无统计学意义。然而网织红细胞Phlebotomy动态数据结果如图4、表6,放血后网织红细胞的增加始终维持在固定范围，不会持续增加，1w（0.0 40.0 3）、2 w（0.0 50.04）、3w(0.0 40.0 2）、4w（0.0 6 0.0 3)组间差异无统计学意义。ControlHypoxiaAPhlehotomy98.81.2096.63.4296.33.70300Juno)2001003453453101010101010101040010FITC-AFITC-AFITC-AB400ControlC300HypoxiaPhlehotomy4w300200-200100-1003453401010100101010FITC-AFITC-AD1w2W3W4w98.41.6197.82.2597.92.1497.03.03250200runo150100503534340101041001010100101041010104105FITC-AFITC-AFITC-AFITC-A(A)and(B)is reticulocyte in Different groups at the same time.(C)and(D)is Dynamic analysis of reticulocyteFigure 4The change of the number of ReticulocyteTable 5Reticulocyte in different groups by flow cytometry(xs)GroupnReticulocyteControl50.010.00Hypoxia50.040.01*Phlebotomy50.050.02*F9.82P0.003*:P0.05 as compared with control group163（责任编辑：陈芃）Table 6Dynamic analysis of reticulocyte by flow cytometry(x+s)Time/wRet170.04 0.03270.05 0.04370.040.02470.060.03F0.626P0.6053讨论放血疗法虽被应用于相关疾病治疗 2 ,但目前针对其作用机制并无明确说明。本研究基于前期研究基础，提出放血疗法可改善低氧对红细胞衰亡的抑制作用。红细胞在长期慢性低氧环境下由代偿性增加逐渐转变为过度增加,课题组前期研究发现慢性低氧促进新生红细胞增加、抑制成熟红细胞衰亡。同时新生红细胞增加，红细胞数量和血红蛋白含量不断增加,红细胞比容增加，血液粘稠致血流速度缓慢，加重机体微循环障碍及其他症状 3。而放血使红细胞数量减少、红细胞比容降低、血液黏滞度下降，从而改善机体微循环障碍。在红细胞的生命周期里，红细胞需要不断经受血流的高压冲击,经过微小血管时不断被挤压，此过程中的红细胞需要具有高度的变形性和结构的完整性。慢性低氧延缓红细胞程序性死亡致衰老的红细胞增加，数量增加致细胞结构不规则、红细胞脆性增加、抵抗力减弱，在血流的冲击和微血管的挤压下，细胞的结构受到破坏,可塑性降低 4。本研究结果显示,经放血干预后,红细胞变形能力增强、脆性降低，功能恢复、抵抗力增加，在运输过程中不易被破坏，更易通过微小血管完成物质交换。虽然放血可以促进红细胞衰亡，但适当的放血并不会持续增加红细胞的衰亡。针对放血疗法，不论是治疗高原红细胞增多症、真性红细胞增多症或其他疾病均效果明显 5.6 ,放血排出的不止是成熟红细胞，同时还包括各个阶段的未成熟红细胞，机体感应到未成熟红细胞减少，会自发生产红细胞，红细胞会代偿性增加。网织红细胞是晚幼红细胞脱核后的未成熟红细胞，最终发展成成熟红细胞，是衡量骨髓造血功能和新生红细胞的重要指标 7 。本研究结果显示，虽然Hypoxia和Phlebotomy网织红细胞均有增加,但放血导致的红细胞增加不同于低氧引起的红细胞增加，低氧造成的红细胞增加是一种长期、慢性的恶性循环,最终导致红细胞越来越多。而放血组动态数据显示，网织红细胞的增加始终保持在一个范围内，各组间差异无统计学意义。综上所述，放血疗法可促进高原慢性低氧下雄性大鼠红细胞的衰亡,降低慢性低氧对雄性大鼠红细胞衰亡的抑制作用。同时放血不会持续刺激雄性大鼠红细胞衰亡，也不会持续刺激雄性大鼠网织红细胞增加。参考文献1Tang F,Feng L,Li RL,et al.Inhibition of Suicidal E-rythrocyte Death by Chronic Hypoxia J.High Alt Med Biol,2019,20(2):112-119.2 Ialongo C,Bernardini S.Phlebotomy,a bridge betweenlaboratory and patient J.Biochem Med(Zagreb),2016,26(1):17-33.3蒋白丽，汤锋，李占全.高海拔低氧环境下的微循环变化 J.中国高原医学与生物学杂志,2 0 2 0,41（4）：2 8 4-2 8 8.4聂鸿靖，田云梅，张东祥，等.高原低氧习服大鼠红细胞变形性的变化规律及其分子机制 J.中国应用生理学杂志,2 0 11,2 7(1):2 3-2 8.5刘海军,曲鑫.个体化静脉放血新技术在真性红细胞增多症患者中的应用 J.重庆医学,2 0 17,46(4):52 4-52 6.6 Yue XD,Ba D,Pu BWD,et al.Therapeutic Erythro-cytapheresis Is Effective in Treating High Altitude Polycythemiaon the Qinghai-Tibet Plateau J.Wilderness Environ Med,2020,31(4):426-430.7王学菊.网织红细胞的检测进展及其参数在临床疾病中的应用 J.医疗装备,2 0 2 1,34（5）：18 1-18 3.