植物病原细菌研究方法.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物病原细菌研究方法,内容提纲：,细菌的基本形态特征,常规细菌生理生化检测方法,细菌种类鉴定方法,植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法,有益细菌的利用研究,细菌的基本形态特征,细菌,（,bacteria,）是单细胞原核微生物，个体微小，形态简单，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。,细菌的形态和大小,细菌的细胞结构,细菌的繁殖与群体形态,（一）细菌的大小,细菌大小的测定：,(1),测量：,测微尺,(2),长度单位：,微米,(m),(3),表示：,球菌：,直径,杆菌：,宽,长,螺菌：,宽、长、螺距,通常,球菌直径,：,0.2,1.5,m,，,杆菌,:,长,1,5 m,宽,0.5,1 m,。,例如：,大肠杆菌：平均长度：,2 m,；宽度,0,.5,m,1500,个大肠杆菌头尾相接等于,3,mm;,10,9,个大肠杆菌重1,mg.,由于菌种,不同,，细菌的大小存在很大的差异；对于同一个菌种，细胞的大小也常随着菌龄变化。另外，对于同一个菌种染色前后其细胞大小都有所不同。所以，有关细菌大小的记载，常是平均值或代表性数值。,菌名,直径或宽,长,（,m m,）,乳链球菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,霍乱弧菌,0.5,1,0.8,1,0.5 (1,3),(0.8,1.2)(,1.2,3,),(0.2,0.6),(1,3,),细菌细胞的大小,（二）、,细菌的形态,不同细菌的形态可以说是千差万别，丰富多彩，但就单个有机体而言，其,基本形态,可分为,球状,、,杆状,与,螺旋状,三种,.,除了球菌、杆菌、蛆旋菌三种基本形态外，还有许多具其他形态的细菌。例如柄杆菌细胞上有柄、菌丝、附器等细胞质伸出物，细胞呈杆状或梭状，并有特征性的细柄；球衣菌能形成衣峭，杆状的细胞呈链状排列在衣鞘内而成为丝状,而支原体由于只有细胞膜，没有纫胞壁，故细胞柔软，形态多变，具有高度多形性。另外，人们还发现了细胞呈星形和方形的细菌。,球状、杆状和螺旋状,细菌的三种基本形态,:,1.,球 菌,单球菌,双球菌,链球菌,四联球菌,八叠球菌,葡萄球菌,2.,杆菌,杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。,杆菌的形态：,短杆状、长杆状、棒杆状、梭状、梭杆状、月亮状、分枝状、竹节状等；按杆菌细胞的排列方式则有链状、栅状、,“,八,”,字状以及有鞘衣的丝状等。,2.,杆 菌,短杆菌,长杆菌,梭状芽孢杆菌,链状,杆菌,单杆菌,2.,杆 菌,杆菌细胞两端的形态特征,2.,杆 菌,3,、螺旋菌,螺旋状的细菌称为螺旋菌。根据其弯曲情况分为：,弧菌：,螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌、逗号弧菌,螺旋菌：,螺旋满,2,6,环，螺旋状 例：干酪螺菌,螺旋体：,旋转周数在,6,环以上，菌体柔软。例：梅毒密螺旋体,螺旋菌,弧菌,螺旋体,3,、螺旋菌,细菌的特殊形态：,柄细菌、肾形菌、臂微菌、网格硫细 菌、贝日阿托氏菌,(,丝状,),、具有子实体的粘细菌、三角形、方形等特殊形态的细菌。,细菌的特殊形态,二、细菌的细胞结构,基本结构包括：,细胞壁、细胞膜、细胞质、核区、间体、核糖体、气泡和储藏物。,特殊结构包括：,荚膜、鞭毛、纤毛、芽孢。,细菌细胞结构,1.,固体斜面培养,2.,液体培养基,3.,半固体培养,植物病原细菌概述,绝大多数为好气性细菌；生长温度大多为,25-28,，少数可以,20,或在,35,中（如青枯菌）生长。,植物病原细菌都不产生芽孢，因此对高温比较敏感，一般在,50,左右的热水中处理,10,分钟即失活，适宜的,pH,为,6-7,。,植物病原细菌的革兰氏染色,（细菌的革兰氏染色反应是细菌分类鉴定的一个重要特征）,常规细菌生理生化检测方法,细菌细胞壁的结构,革兰氏,阳性,菌细胞壁：,由肽聚糖和磷壁酸组成,磷壁酸：,占,40%,。,G,+,菌所特有,其主链由数十个磷酸甘油或磷酸核糖醇组成,有的还有由,D,Ala,和还原糖组成的侧链。,肽聚糖,:,占,3070%,不同菌种中肽聚糖,(,肽链,),组分不同,。,革兰氏,阴性,菌细胞壁：,分内壁层和外壁层。,内壁层：,紧贴胞膜,仅由,1,2,层肽聚糖分子构成,占细胞壁干重,5-10%,无磷壁酸。,外壁层：,位于肽聚糖层的外部。,脂多糖,;,脂蛋白,、,包括,:,蛋白质层,:,基质蛋白,、,外壁蛋白,;,磷脂,.,革兰氏染色的原理,革兰氏染色原理：,第一步：,结晶紫使菌体着上紫色；,第二步：,碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内；,第三步：,酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应；,G,+,菌：,细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫,-,碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色；,G,菌：,肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫,-,碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。,革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹麦医生,Hans Christian Gram,于,1884,年,创立,。,基本步骤：,涂片固定,结晶紫初染,1min,碘液媒染,1min,95%,乙醇脱色,0.5min,番红复染,min,结果,:,革兰氏,阳性菌,紫色,；,革兰氏,阴性菌,红色,。,革兰氏染色法：,实验材料,待测细菌,枯草芽孢杆菌（,G,+,）,甘蓝黑腐病菌（,G,-,）,染液：,结晶紫草酸铵染剂、鲁戈尔碘液、复染剂（番红,O,）,用具：,移植饵、清洁无脂载玻片,清洁无脂载玻片,阳性对照菌,（紫色或蓝黑色）,待 测 菌,阴性对照菌,（红色）,示范图,对照菌呈现正确颜色，实验才为成功,涂片,干燥,固定,染色,1min,水洗、吸干,镜检,简单染色,制备涂片标本染色,阳性菌,阴性菌,革兰氏染色法,革兰氏染色阴性,大肠杆菌,革兰氏染色阳性,枯草芽孢杆菌,注：,（,1,）、,实验细菌为活跃生长期的培养物；,（,2,）、,菌液不能太浓，涂片不宜过厚，造成假阳性；,（,3,）、,火焰固定涂片，以载玻片不烫手为宜；,（,4,）、,脱色时间把握好，过长，假阴性；过短，假阳性。,鞭毛：,某些细菌表面由细胞内生出的细长、波曲、毛发状的结构。,鞭毛具有运动功能，一般认为鞭毛靠鞭毛丝旋转而动，,它们是细菌的“运动器官”,。,鞭毛的长度：,一般为,15,20,m,，最长可达,70,m,。,鞭毛的直径：,为,0.01,0.02,m.,不同细菌的鞭毛数目和着生位置不同，鞭毛数目一般一至数十条。,细菌鞭毛染色,鞭毛的着生方式：,周生,鞭毛的化学组成：,主要由鞭毛蛋白构成，还含有少量的多糖、脂类和核酸等。,鞭毛起源于细胞质膜内侧的基粒。,细胞质区内有一个颗粒状小体，此小体为基粒，鞭毛自基粒长出穿过细胞壁延伸到细胞外部。,鞭毛的结构：,鞭毛丝,鞭毛 鞭毛钩,基体,鞭毛的观察：,电镜,特殊鞭毛染色，在光学显微镜下观察,半固体穿刺培养,从固体培养基上的菌落形态判断,一般情况下：,菌落形状大，薄且不规则，边缘极不平整，可能有鞭毛。菌落十分圆滑，边缘平整且相对较厚，可能没有鞭毛。,实验菌种及药品,1,菌种：,枯草芽孢杆菌,2,染液,染液,A,：,单宁酸,5.0g,氯化铁（,Fecl,3,6H,2,O,）,1.5g,福尔马林（,15,）,2.0ml,（,15%,福尔马林：,40%,甲醛,4ml+,蒸馏水,6ml,）,NaOH(1%)1.0ml,蒸馏水,100ml,染液,B,：,硝酸银,2g,蒸馏水,100ml,三、染色方法：,银盐染色法,硝酸银溶于蒸馏水中。取,10ml,作回滴用，向其余,90ml,硝酸银溶液中逐滴加浓氢氧化铵，先形成很浓的沉淀，再继续滴加浓氢氧化铵至沉淀消失为止。然后慢慢滴入备用的硝酸银溶液则出现少量雾状沉淀，但轻轻摇动后，沉淀又消失，再滴入硝酸银溶液，直到摇动后雾状沉淀不再消失为止。此液不耐保存，,4,小时内染色效果最佳。,四、鞭毛染色步骤：,（,1,）,将菌株在,NA,斜面上于,30,恒温箱中培养,17-20,小时，取出，沿壁管轻轻加入,3-5ml,的灭菌水掩盖斜面菌苔。,斜放静置,10,分钟,，使细菌自然游出，,勿摇动,，备用。,（,2,）,用移植环取菌悬液于,无划痕的无脂玻片,上，倾斜玻片，使之成带状，将玻片在空气中,自然风干,。,（,3,）,滴加,染液,A,于干燥的涂片上，覆盖涂片，染色,10-13,分钟，倾去染液，用蒸馏水充分洗去染液；风干后，再滴加,染液,B,覆盖涂片染色,30,秒至,1,分钟,，立即用蒸馏水冲洗，放于空气中干燥，在高倍镜或油镜下镜检。,（,4,）,在金色背景下，细菌,鞭毛深褐色到黑色,，,菌体浅褐色,。,菌体,鞭毛,菌体,鞭毛,菌体,鞭毛,芽孢,概念：,某些菌生长到一定阶段，细胞内形成一个圆形、椭圆形或卵圆形的内生孢子，是对不良环境有较强抵抗力的休眠体。,芽孢,能形成芽孢的细菌种类：,在杆菌中能形成芽孢的种类,较多，在球菌和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢。,产生芽孢的几个属：,芽孢杆菌属,梭状芽孢杆菌属,芽孢乳杆菌属,生孢八叠球菌属（其中的一个种）,芽孢,的形态及其,在细胞中的位置：,A,近中央,B,末端,C,中央,细菌芽孢的各种类型,芽孢的组成和结构,芽孢有多层结构，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮层和核心,.,芽孢的结构,芽孢的外壁层厚而致密，主要成分为脂蛋白，通透性差,不易着色。,核心含有大量的,DNA、RNA、,蛋白质酶等物质，还含有,2,6,吡啶二羧酸,（,DPA）,DPA,是芽孢特有的成分。一般以,DPA,Ca,的形式存在,。,皮层主要含芽孢肽聚糖、,DPA,Ca，,皮层体积大，比较致密。,芽孢平均含水量低,约,40%.,芽孢的特性,:,具有很强的,抗热、抗干燥、抗辐射、抗化学药物能力。,含水量低、壁厚而致密，通透性差,不易着色。,新陈代谢几乎停止，处于休眠状态。,一个芽孢萌发产生一个个体。,芽孢的抗热机制：,目前尚不清楚，但可能与以下因素有关，如含水量低、壁厚而致密，芽孢中的酶分子量小，比较耐热。,芽孢染色,（孔雀绿藏红染色）,染剂,孔雀绿水溶液,5,染剂,藏红水溶液,0.5,或 碱性品红水溶液,0.05,染色方法：,1,、涂片固定；,2,、加染剂,在酒精灯火焰上加热染色,1min,，勿使染液沸腾和干燥；,3,、水洗；,4,、染剂,染色,15s,；,5,、水洗，风干后镜检。菌体染成红色，芽孢染成绿色。,芽孢,菌体,常规鉴定方法,全自动微生物鉴定仪,-Biolog,植物病原细菌的鉴定方法,菌落特征比较,常规细菌鉴定方法,参考：,东秀珠等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，,2001,全自动微生物鉴定仪,-Biolog,鉴定原理,Biolog,公司独创的,碳源,利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选,95,种不同碳源，配合四唑类显色物质（如,TTC,、,TV,），固定于,96,孔板上（,A1,孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的,氧化还原酶与显色物质发生反应,而导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），,与标准菌株数据库进行比对,，即可得出最终鉴定结果。,主要特点,快速读取结果,鉴定板由读数仪自动读取吸光值，软件将该吸光值与数据库对比，就可在瞬时给出鉴定结果。试验结果可由系统进行自动分析、记录和打印。,强大的数据库,Biolog,微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包括细菌、酵母和丝状真菌在内总计,1973,种微生物，几乎涵盖了所有的人类、动物、植物病原菌以及食品和环境微生物。,BIOLOG,在植物病原菌鉴定方面,可鉴定常见的,假单胞菌,(,Pseudomonas,77,种,),、,伯克霍尔德菌,(,Burkholderia,),、,黄单孢菌属,(,Xanthomonas,),、,果胶杆菌属,(,Pectobacterium,),、,食酸菌属,(,Acidovorax,),、,根瘤菌属,(,Rhizobium,),等近,200,种植物致病菌，特别适合各农业大学、研究所及相关机构进行植物病理分析和研究用。,BIOLOG,在食品工业应用及研究领域提供大量的数据库，包括,70,多种乳酸菌,、,30,多种双歧杆菌,及各类常见的食品必检的致病菌数据库，包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌,(,含阪崎肠杆菌,),、葡萄球菌、弯曲菌、假单胞菌、弧菌、梭菌、志贺氏菌等，用于食品、药品及化妆品行业用于致病微生物鉴定、工业应用微生物研究、质量控制及产品研发等。,BIOLOG,专门分开提供一个,DP(,危险微生物,),数据库，包含鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、马尔他布鲁氏菌、土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌,(,鼻疽假单孢菌,),、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、苏云金芽孢杆菌、假结核耶尔森氏菌、蜡样芽胞杆菌等,12,种强致病微生物，适用于国家疾病控制中心、国家安全机构及军事机构用于生物武器检测及防治研究。,目前广泛用于美国军方进行生物恐怖检测及预防研究。,鉴定,初始,首先按常规微生物操作方法分离出纯种。,鉴定步骤如下：,第一步,用,Biolog,专用培养基将纯种扩大培养。,第二步,按要求配制一定浊度,(,细胞浓度,),的菌悬液。,第三步,将菌悬液接种至微孔鉴定板,(Microplate),，培养一定时间。,第四步,将培养后的鉴定板放入读数仪中读数，软件自动给出鉴定结果。,植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法,一、症状特征,十字花科软腐病,瓜萎蔫病,肿瘤,由细菌侵染所致病害的病部，无论是维管束系统受害的，还是薄壁组织受害的，都可以在徒手切片中看到有大量细菌从病部喷出，这种现象称为,菌溢现象,(,bacteria exudation,，,BE,),。菌溢现象为细菌病害特有，是区分细菌病害或真菌、病毒病害的最简便的手段之一。,二、显微镜检查（菌溢现象）,菌溢现象操作方法,细菌病害的病组织，内含有大量菌体，可通过菌溢现象或诊断，具体方法：,取病健组织交界部位一小块，置于截玻片上。,加一滴无菌水后，加盖玻片。,低倍镜下，暗光，观察。,可看到病斑切口处有大量细菌云雾状涌出。,菌溢现象,1,、凝集反应,颗粒性抗原如细菌与其特异性抗体在电解质影响下，很快结合成可见的凝集块。,载玻片凝集,反应是最快速的测定方法：在清洁载玻片上加两滴生理盐水配的菌悬液，用移植环取少量抗血清与其中一滴菌悬液混合，另一滴不加血清作为对照。经,35,分钟，可以看到原来均匀悬浮的细菌凝集成团，对照则不发生这种变化。,另一种常用方法是,试管凝集,反应，虽然没有玻片凝集反应快捷，但能测定,血清效价,和作定量研究。,分子生物学检测技术,2,、酶联免疫吸附法,（,Enzyme linked immune sorbent assay,ELISA,）,该方法是将微量的酶与测定的抗原或抗体结合，大大的提高抗原和抗体反应的灵敏度。,抗体夹心,ELISA,法通常比其他,ELISA,方法敏感,2,5,倍。,先用抗体包被聚苯乙烯微量滴定板孔，然后加测定抗原样本，抗原被抗体吸附，然后将酶联抗体加在被吸附的抗原上。最后再加酶的底物，酶催化底物而显色，用分光光度计检测。,4,、核酸杂交及,PCR,诊断技术,利用核酸链间碱基配对,核酸杂交来识别特定核酸顺序的方法。,将一个预先分离纯化或合成的已知核酸序列片段，加以标记，就成为,核酸探针,(probe),。,用核酸探针可以探测待查标本核酸中与探针具有互补的碱基顺序。,如果两者有互补顺序则杂交成功,结果阳性,;,若待查标本核酸与探针顺序无关则杂交失败,结果呈阴性。,由于大多数植物病毒的核酸是,RNA,其探针为互补,DNA(complementary DNA,cDNA),，称为,cDNA,探针,。,4.1,核酸杂交,核酸杂交,4.2 PCR,诊断技术,聚合酶链式反应,（,Polymerase chain reaction,PCR,）是一种体外扩增特异性,DNA,的技术，在短时间内可以大量扩增核酸。,整个扩增包括,3,个重复的步骤：（,1,）,DNA,热变性，双链变单链；（,2,）引物退火，当温度降低时，两个引物分别结合到靶,DNA,的两条链的,3,末端，（,3,）引物延伸，在,DNA,聚合酶的催化下，引物由,5,3,扩增,延长。分别和相对的,DNA,链互补。,Real-time fluorescent PCR,REP-PCR,Immuno-PCR,RAPD-PCR,Nested-PCR,在植物病原细菌检测和鉴定中应用的,PCR,技术,三、分离培养与致病性测定,培养基,稀释法或划线,法培养。观察单个菌落特点。,将分离的细菌接种于寄主植物或过敏性发应植物，观察所得症状，从而完成,柯赫氏法则,的诊断程序。,四、链霉素防治,植物病原细菌对链霉素敏感，可用于防治细菌病害。,三,、,植物病原细菌的主要类群及分类地位,五界生物分类系统，细菌属于原核生物界。,参考：,伯杰氏系统细菌手册,四、主要属,长期以来，植物病原细菌仅限于,5,个属：,土壤杆菌属,（,Agrobacterium,）,欧氏杆菌属,（,Erwinia,）,假单胞杆菌属,（,Pseudomonas,）,黄单胞杆菌属,（,Xanthomonas,）,棒形杆菌属,（,Clavibacter,）,五属细菌分类检索表,A,.,革兰氏染色阳性，一般不能游动,棒形杆菌属,（,Clavibacter,）,AA,.,革兰氏染色阴性，能游动。,B.,鞭毛极生,C,.,鞭毛一般多条，在培养基上产生水溶性黄绿色或蓝绿色色素,假单胞杆菌属,（,Pseudomonas,）,CC.,鞭毛一般单条，在培养基上产生非水溶性色素,黄假胞杆菌属,（,Xanthomonas,）,BB.,鞭毛周生,C,.,鞭毛,1,4,条，引起肿瘤,土壤杆菌属,（,Agrobacterium,）,CC.,鞭毛多条，引致腐烂或萎蔫,欧氏杆菌属,（,Erwinia,）,供试菌株,革兰氏反应阳性,杆菌或球菌,形成丝状细胞,Streptomyces,（链霉菌属）,形成芽孢,36,生长，在,7,NaCl,中生长,Curtobacterium,短小杆菌属,尿酶,Rhodococcus,红球菌属,Clavibacter,棒形杆菌属,革兰氏反应阴性,不形成芽孢,Bacillus,芽孢杆菌属；,Clostridium,梭状芽孢杆菌属,+,-,+,-,植物病原细菌,主要属简要检查方法,好氧性或不活泼性,滑行运动，在琼脂平板,上铺开生长，短或长,杆形弯曲、氧化酶阳性,以鞭毛游动,在,KingsB,培养基,上产生荧光色素,发酵性,Cytophaga,噬胞菌属；,Flexibacter,屈桡杆菌属,+,-,革兰氏反应阴性,不运动，菌落光滑短,杆状、氧化酶阴性,Flavobacterium,黄杆菌属,溶果胶活性,+,-,Erwinia,（软腐组群）,Erwinia,（不溶果胶组群）,Pseudomonas,（无荧光组群）,在,1,葡萄糖营养琼脂上,为白色菌落，周鞭，致瘤,Agrobacterium,土壤杆菌属,Xanthomonas,黄单胞菌属,在,1,葡萄糖营养琼脂上,为黄色菌落，单极鞭,Pseudomonas,（荧光组群）,有益细菌的利用研究,生物防治,利用其他对植物无害的生物来影响或抑制病原物的生存和活动，从而降低病害的发生率或严重度。,（,1,）抗菌作用,(antibiosis),（,2,）溶菌作用,(lysis),（,3,）竞争作用,(competition),（,4,）重寄生作用,(hyperparasitism),（,5,）捕食作用（,predation,）,（,6,）交互保护作用,(cross protection),Sir Alexander Fleming discovered the antibiotic penicillin.He had the insight to recognize the significance of the,inhibition,of bacterial growth in the vicinity of a fungal contaminant when most other scientists probably would have simply discarded the contaminated plates.,Alexander Fleming(1881-1955),亚历山大,弗莱明,英国细菌学家,葡萄球菌,青霉菌,1928,年的一天，弗莱明在他的一间简陋的实验室里研究导致人体发热的葡萄,球菌。由于盖子没有盖好，他发觉培养细菌用的琼脂上附了一层青霉菌。这是从,楼上的一位研究青霉菌的学者的窗口飘落进来的。使弗莱明感到惊讶的是，在青,霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不见了。这个偶然的发现深深吸引了他，他设法培养,这种霉菌进行多次试验，证明青霉素可以在几小时内将葡萄球菌全部杀死。弗莱,明据此发明了葡萄球菌的克星,青霉素。,由于青霉素的发现和大量生产，拯救了千百万肺炎、脑膜炎、脓肿、败血症,患者的生命，及时抢救了许多的伤病员。青霉素的出现，当时曾轰动世界。,为了表彰这一造福人类的贡献，弗莱明、钱恩、弗罗里于,1945,年共同获得诺,贝尔医学和生理学奖。,青霉素的发现者,英国细菌学家弗莱明,图中央是青霉菌，周围是致病细菌。距青霉素最远的细菌个大、色浓，活力十足；距青霉菌较近的细菌个较小、色较浅，活力较差；而最接近青霉菌的细菌个最小、色发白，显然已经死亡,葡萄球菌这些形如珍珠的东西就是危害人体健,康的葡萄菌，青霉素能消灭它们。,与弗莱明共同获得,1945,年诺贝尔生理学和医学奖。,1940,提纯出青霉素,澳大利亚病理学家霍华德,.,弗罗里,植物病害的生物防治中的应用,平板拮抗测试,待测细菌,病原真菌,注：病原真菌和待测细菌同时接种,拮抗菌对病原菌的抑制作用,正常菌丝,畸形菌丝,