蛋白质工程演讲周五第四组.ppt

,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,1,目录,要点,1.,什么是端粒，端粒的发现和结构,要点,2.,什么是端粒酶和端粒酶的结构和功能,要点,3.,端粒酶的主要功能,要点,4.,端粒酶与细胞衰老和癌症的关系,2025/10/9 周四,导语,2009 年度诺贝尔生理学或医学奖在瑞典卡罗林斯卡医学院揭晓，美国加利福尼亚旧金山大学的Elizabeth H.,Blackburn、美国巴尔的摩约翰霍普金斯医学院的Carol W.Greider 和美国哈佛医学院的Jack W.Szostak 获得该奖，以表彰他们发现了端粒和端粒酶保护染色体的机制。端粒是染色体末端由DNA 重复序列组成的一种特殊结构，具有维持染色体结构稳定性的功能，会随染色体复制与细胞分裂而缩短。端粒酶作用于端粒，依靠自身RNA 模板合成端粒DNA，维持端粒的长度与结构完整。端粒和端粒酶的发现解释了生物学中长期未解决的染色体末端复制问题，推动了生物学和生物医学相关领域的发展，为研究衰老、与衰老相关的疾病和肿瘤发生发展的分子机制提供了新的思路。,2025/10/9 周四,1、2 端粒的发现,更早的1938 年，Hermann Muller(因为发明用X射线突变基因而获得诺奖)利用X 射线照射果蝇产生突变体，注意到染色体的末端跟其他区域的染色体不同，它非常稳定，从未观测到断裂缺失或者倒位(inversion)。他因此先见性地认为染色体的末端比较特殊，它需要被封闭(sealed)起来，并给它一个专有的名称端粒telomere，来自希腊词根telos(末端)和meros(部分)。,2025/10/9 周四,2025/10/9 周四,传统观念认为真核细胞染色体末端是以线性方式结尾的。电镜观察源于人与鼠的纯化端粒DNA，发现大多数端粒DNA是以T环（telomere loop)结构结尾的，并证实T环是端粒3c单链伸入到端粒双链TTAGGG 重复序列形成的同时在其伸入处置换出一段与自身序列后形成的,同时在其伸入处置换出一段与自身序列相同的单链后,与互补链配对形成 D结构。(displacementloop),1、3 端粒的结构,1、3 端粒的结构,T环的大小随端粒重复序列的长短而定,一般来说,长的端粒序列可形成较大的T环，而短端粒只能形成较小的T 环结构。当端粒缩短到一定程度时将不能形成T环结构。形成T环结构所需的最小端粒长度具有种属特异性。端粒T环与D环的形成与端粒相关蛋白密切相关，并共同形成每一染色体末端的DNA蛋白复合体结构。,1、3 端粒结构,哺乳动物端粒模型发卡结构,1、4 稳定染色体末端结构,端粒T环结构（telomere loop)，使染色体末端封闭起来，免遭破坏,。,端粒D环结构（displacement loop)，结合TRF等蛋白阻止染色体末端融合和损伤反应。,2025/10/9 周四,2、1 端粒酶,1,、概念：,端粒酶是一种,RNA,与蛋白的复合体，它以自身,RNA,上的一个片段为模板通过逆转录合成端粒重复序列，并通过一种,RNA,依赖性聚合酶（如逆转录酶）机制加到染色体,3,末端以延伸端粒。,2,、组成：,端粒酶由三个亚单位组成：端粒酶,RNA,（,hTR,）,端粒酶逆转录酶（,TERT,）,端粒酶结合蛋白（,TEP,）,2、2 端粒酶的结构,2008,年美国科学家利用,X,射线结晶学方法，揭示了端粒酶（,Telomerase,）关键部位的三维结构图,端粒酶结构示意图。,蛋白质（绿色）与,RNA,（浅褐色）及,DNA,（紫色）联合在一起。,2025/10/9 周四,2、2端粒酶的结构,2025/10/9 周四,2、3 端粒酶的组成,各成分的特点,端粒酶,RNA,人类,端粒酶,RNA,模板序列为,CUAACCCUAAC,，,由,450,个核苷酸组成,。,端粒酶,RNA,亚基,是合成端粒,DNA,的,模板,对于端粒酶的结构和催化活性都十分重要,。,端粒酶,RNA,基因缺失,的小鼠，自身细胞,丧失端粒酶活性,，,而在快速增殖的器官中，细胞也会快速凋亡。另外，端粒酶,RNA,还可作为肿瘤的特异治疗靶点。目前，用能抑制基因表达的,反义核苷酸,anti-hTR,转染癌细胞，可抑制端粒酶的活性，促进细胞凋亡。,2025/10/9 周四,2、3 端粒酶的组成,端粒酶,RNA,转录模板功能,：,远端区,参与和,底物的结合,近端区,能添加特定的,核苷酸,，,对底物识别并不重要,模板边界区,与,端粒酶催化亚基,TERT,结合，也与,端粒酶相关因子,Estlp,和,Ku,结合,。,2025/10/9 周四,2、3 端粒酶的组成,端粒酶逆转录酶（,TERT,）,TERT,是端粒酶活性所必须的，作为,RNA,依赖的,DNA,聚合酶,，,区别于一般的蛋白逆转录,DNA,聚合酶，,TERT,可以识别,单链富含,G,的寡核苷酸引物,，,以其,RNA,组分,的碱基为模板与端粒重复序列进行碱基互补配对，在合成，延伸碱基序列中起催化作用。,2025/10/9 周四,2、3 端粒酶的组成,TERT,的晶体结构由三部分组成,：,RNA,结合区（,TRBD,）,，,逆转录区,和,羧基末端延伸区（,CTE,）,。,TRBD,主要由螺旋组成，含有,CP,和,T,两个保守区域，与单链和双链,RNA,结合,，,逆转录区由螺旋和折叠,组成，呈现像,手指,和,手掌,形状的结构，而,CTE,区,由延长的螺旋组成，其表面有长的,loop,结构,，,这种新的二级结构折叠方式使,CTE,区成为,TERT,的,“,拇指,”。,2025/10/9 周四,2、3 端粒酶的组成,TERT,内的,N,残基,对多种功能是重要的，包括与,端粒酶,RNA,结合,，,端粒酶,RNA,装配,和,催化作用,，,与,p53,的相互作用和细胞永生化。,TERT,的,C,残基,也在人类原始纤维母细胞的永生化，端粒组装的竞争，核仁内定位，引物结合和渐进性延长等方面起重要作用。,2025/10/9 周四,四膜虫端粒酶对端粒,DNA,的复制模式图,2,、,4,末端补齐机制,端粒酶能自主地对端粒,DNA,富含,G,的链进行延长，而富含,G,的链又能通过,GC,配对,使其终端回折形成特殊的,发卡结构,，这样,DNA,复制时新链,5,端缺失的就可以得到补齐，为真核生物解决了,DNA,末端复制问题,端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶，它可以,维持端粒的长度,，,维持细胞增殖潜能,。,端粒酶以,自身,RNA,为模板合成,端粒酶重复序列，具有,逆转录酶,活性，它的活性不依赖于,DNA,聚合酶，对,RNA,酶、蛋白酶和高温均敏感,。,端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在,生殖细胞,和,干细胞,中可检测到高水平的端粒酶活性。,2025/10/9 周四,2,、,5,端粒酶,3、,1,端粒酶的主要功能,端粒酶的主要作用是维持端粒的长度,端粒酶不但可以维持已经存在的端粒DNA，同时端粒酶反转录酶能够识别断裂染色体的末端，重新将端粒重复序列加到染色体的断裂末端或非端粒DNA上。,2025/10/9 周四,3、1 端粒酶的主要功能,端粒酶能利用端粒3端单链为引物，自身的RNA 为模板合成端粒重复序列添加到染色体末端，从而延长端粒的长度人的生殖细胞、造血干细胞及T，B 淋巴细胞中端粒酶有不同程度的表达，而在正常的体细胞中，端粒酶处于失活状态，因此体细胞随细胞分裂次数的增加端粒逐渐缩短端粒的长度与有丝分裂次数相关，所以端粒又有细胞的“有丝分裂钟”之称。,2025/10/9 周四,3、1 端粒酶的主要功能,2025/10/9 周四,实验证明,Fitzgerd以几种开花植物为材料，研究了端粒酶体外合成端粒的方式，并根据端粒酶在合成端粒时对引物DNA 的要求将端粒酶分为3 类：,第一类端粒酶要求RNA 模板与引物具严格的Watson-Crick 碱基配对，如大豆和胡萝卜中的端粒酶第二类端粒酶存在于拟南芥、玉米和花椰菜中,2025/10/9 周四,实验证明,此类端粒酶通过将引物DNA 的3端定位于模板RNA 的偏好位点来有效地延伸非端粒DNA 的末端第三类如高粱的端粒酶，引物可以结合于模板RNA 不相邻的位点上细胞可越过M1 期继续分裂，端粒进一步缩短，染色体不稳定，出现各种异常变化(如末端融合、环状染色体、双着丝粒等)，很快进人M2死亡期(mortalitystage 2)或危机期(crisis)绝大多数细胞死亡，极少数细胞由于端粒酶抑制途径中某个基因的突变，允许端粒酶活性的表达，端粒长度得以稳定，细胞越过M2 期获得永生化。,2025/10/9 周四,3、2 端粒酶的主要功能,端粒酶使体外细胞寿命延长,将克隆的端粒酶cDNA 导入质粒，然后转染无端粒酶活性的正常人细胞，与未转染的细胞进行培养比较，发现细胞的生长寿命至少提高了20 倍，对照细胞培养数代后出现强半乳糖苷酶活性(衰老标志),这一研究表明：端粒酶在体外细胞延长细胞寿命的细胞具有更为广泛的用途,2025/10/9 周四,3、2 端粒酶的主要功能,首先,，,在研究生长和分化的生理生化特征方面克隆的永生化细胞比已经建立的肿瘤细胞系具有更大的优势，因为它更能代表机体内的正常生理状态；,2025/10/9 周四,3、2 端粒酶的主要功能,其次，,能长期生存的正常的人类细胞可用来生产工程化的生物技术产品；再次，扩增了数代的遗传上重新年轻化的细胞可在基因治疗时用作自体的或异体的细胞这样一来，经端粒酶处理过的年轻化的细胞不管是在生物学研究、制药工业和医学上都具有重要意义,2025/10/9 周四,3、2 端粒酶的主要功能,2025/10/9 周四,2025/10/9 周四,4、1端粒、端粒酶与细胞衰老,如何使人体衰老延迟，一直都是人类所不断追求的。虽然科学家们发现了一些抗衰老的药物和方法，但都不够理想。,2025/10/9 周四,4、1、1 假说,端粒假说,(Harley),:端粒缩短到不能继续维持细胞分裂时,便会启动终止细胞分裂的信号,细胞周期检验点基因如p53 或(和)RB 表达,细胞周期阻滞,细胞进入M,死亡期,被称为复制性衰老。当p53或(和)RB 失活时,细胞可逃脱复制性衰老而继续分裂增殖,端粒变得更短,最终端粒末端功能丧失,染色体失稳,表现出染色体断裂、重组等引起大规模的细胞死亡现象,只有极少数细胞因为激活了端粒酶活性而发生逃逸,成为永生化细胞。,2025/10/9 周四,2025/10/9 周四,4、1、2 端粒和细胞衰老的关系,端粒,:随着年龄的增长和细胞裂次数的增多，端粒会逐渐缩短,一般丢失速度为50-200bp/次。由此可见端粒长度决定了细胞的分裂次数,它作为有丝分裂“分裂钟”的物质基础,调控着细胞的复制寿命,超过分裂极限后细胞自然衰老死亡。,4、1、2 端粒和细胞衰老的关系,4、1、3 端粒酶和细胞衰老的关系,4、1、4 人的端粒和端粒酶,1）正常人体细胞缺乏端粒酶活性。,2）与其他有端粒酶活性的生物体细胞相比，人体细胞有很长的端粒。,3）人的,胚胎细胞,具有明显的可探测的端粒酶活性,。,4、1、3 人的端粒和端粒酶,1）,正常人体细胞缺乏端粒酶活性。,2）与其他有端粒酶活性的生物体细胞相比，人体细胞有很长的端粒。,3）人的,胚胎细胞,具有明显的可探测的端粒酶活性。,4、2 端粒、端粒酶和癌症,4、2、1 端粒酶与肿瘤的相关性,正常体细胞没有端粒酶活性，但永生化细胞系和超过85%的肿瘤细胞显示端粒酶活性，以防止端粒逐渐缩短。已发现端粒酶的激活存在于人类各种肿瘤和肿瘤衍生的细胞系中，KheirollahiM 等对50例患者进行端粒酶活性的检测，其中包括26 例脑膜瘤和星形细胞瘤患者，结果显示，脑组织中端粒酶活性呈阳性的有39 例（39/50=65%）；同时,单样本t 检验,表明，端粒酶活性在完全脑膜瘤、星形细胞瘤中的影响是显著的（P0.001）。,4、2、1 端粒酶与肿瘤的相关性,端粒在许多癌细胞系中是不正常的，端粒酶活性也提高了80%-90%,无端粒酶活性的肿瘤细胞常显示有端粒延伸替代机制()的作用,这与癌细胞具有无限复制能力相一致。,4、2、2 端粒酶抑制剂-抗癌治疗,在85%以上的肿瘤细胞和组织中高度表达端粒酶，因此端粒酶是作为肿瘤治疗的重要靶标，端粒酶抑制剂将成为一种新的抗癌药物。,肿瘤部位/类型,与肿瘤邻近正常组织/良性病变,肿瘤组织（%）,肺,3/68（4.4%）,109/136（80.1%）,乳腺,2/28（7.1%）,19/24（79.6%）,前列腺,1/18（5.6%）,23/27（85.1%）,结肠,0/45（0）,22/23（95.6%）,肝,1/1（100%）,卵巢,0/8（0）,7/7（100%）,肾,0/55（0）,40/55（72.7%）,神经母细胞瘤,0/17（0）,94/100（94%）,血液（淋巴瘤，,CLL ALL）,21/23（91.3%）,脑,6/8（75%）,其它（头顶部，,Wilms,瘤）,8/93（8.6%）,24/26 (92.3),合计,14/332（4.2%）,365/430 (84.8),表一 人体肿瘤组织端粒酶活性,4、2、2端粒酶抑制剂-抗癌治疗,1）、反义寡核苷酸是端粒酶抑制剂研究领域中的热点,它与端粒DNA互补并结合到染色体末端的富含鸟嘌呤的单链；这能与端粒酶RNA的结合并最终阻碍端粒酶RNA的活性。,2）、逆转录酶抑制剂能抑制端粒酶的亚单位hTERT的活性，这将阻止核苷酸与端粒末端序列的结合。,3）、突变的端粒酶基因被引入恶性细胞，这将使细胞的端粒酶处于静止状态并与活化型相互竞争进而抑制其活性。,2025/10/9 周四,参考文献,1 郗鹏.端粒和端粒酶的发现2009年度诺贝尔生理学或医学展成果介绍J.科技导报，,2009，27（24）：2933.,2 McClintock B.The behavior in successive nuclear divisions of a,chromosome rroken at meiosis.Proc Natl Acad Sci USA,1939,25:405-416.,3 Muller HJ.The remaking of chromosomes.Collecting Net,1938,13:,182-198.,4 Zipser Y,Piade A,Kosow er NS.Erythrocyt e thiol status regulates band,3,phosphot yrosine level via oxidat ion/reduct ion of band 3associated,phosphotyrosine phosphat ase.FEBS Lett,1997,406(1-2):126-130.,参考文献,5,Tsujimoto HDe novo synthesis of telomere sequences atthe healed breakpoints of wheat deletion chromosomesJMolecular and General Genetics，1999，(262)：851-856,6,Harley C B，Kim N W，Prowse K R，et al Telomerase，cell immortality and cancerJCold Spring Harbor SympQuant Biol，1994，59：307-311,7,Rhyu M 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