植物细胞培养课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,第一节 植物细胞培养简介,一、概念：,在培养基中培养彼此分离的细胞、使之生长、增殖或分化。,二、类型：,1、固体培养(solid culture)：,在固体培养基中培养细胞=静止培养。,细胞被固定、不能移动;单细胞分裂后形成细胞团,优缺点:,1）所得到的各个细胞团均为单细胞形成，遗传成分和生理特性具有一致性；,2）细胞生长速度较慢；,3）不能长期、连续、大规模培养细胞。,2.液体培养（liquid culture）：,在运动的液体培养基中培养细胞。,又称悬浮细胞培养（suspension cell culture）。,细胞是分散的，可以长期培养。,有2种形式：,成批培养(batch culture),：,一个容器的细胞培养结束后，细胞被转移到新的容器中继续培养。,连续培养(continuous culture)：,在一个容器（或者系统）中连续不断的培养植物细胞。,成批培养,连续培养,悬浮细胞培养的特点,1）细胞生长速度较快；,2）可以长期、连续、大规模培养细胞；,3）不能跟踪单细胞的分裂和生长过程。,三、,细胞培养的应用,1.进行细胞生物学研究：,通过适当的培养技术，人们可以连续观察和记录（摄像）单个细胞的生长、分裂和分化的全过程。因此，细胞培养技术是研究细胞生长、分裂和分化的良好实验体系。,如某个或某种类型的植物细胞是怎样生长、分裂和分化的？化学物质（激素等）或者物理因素（重力、压力）等是怎样影响这些过程的？,细胞培养证明了植物细胞全能性,2.培育植物变异体：,有变异，才会有选择,人们总是希望获得具有某些抗性的品种，如抗病、抗虫、抗盐碱、抗铝、抗除草剂等。,（1）从自然变异的植株中进行选择：自然变异率低、机会小，工作量大，效率低。,（2）杂交育种：可以把抗性基因转移到需要改良的品种中，但时间长,（3）诱变植物（种子或芽）：工作量大,（,4）细胞培养：效率高。,先诱变细胞，再将细胞培养在有选择压力的培养皿中，具有抗性的细胞就可以分裂，诱导其形成完整植株，即可获得抗性变异体。在一个培养皿中，一次可以筛选10-20万个细胞,（一个细胞就是一潜在的植株）,。,3.,生产有用化合物：,利用大规模细胞培养技术可以在室内生产一些植物细胞合成的有用物质，如色素、香料、药物成分等。,第二节 细胞培养的建立、维持和生长特点,一、细胞培养的建立和维持,细胞培养通常是将植物材料接种在液体培养基中，经过摇荡建立起来的。,外植体,液体培养,振荡,培养上清液,愈伤组织,液体培养,继代培养,振荡,建立起来的悬浮细胞必须适时进行,继代培养。,继代培养（传代培养；subculture）：,将培养物（芽、愈伤组织、细胞等）分成若干份，接种到新鲜培养基上继续增殖的过程,。,愈伤组织,(,callus,),是一群无明显组织分化、有分裂能力的细胞群（团）。有多种类型，,在颜色、松散程度、含水量、生长速度等方面存在差异。,形成的因素：,创伤或（和）植物激素的诱导,分化,(,differentiation),形态、结构和功能相同的细胞变成形态、结构和功能互不同的细胞的过程，如分生组织细胞转变成薄壁组织、维管组织、厚壁组织等。,脱,分化,(去分化；de,differentiation),已分化、成熟的细胞失去原有的状态、重新恢复分裂能力的过程。外植体形成愈伤组织的过程就是脱分化的过程。,再分化(re,differentiation),愈伤组织形成其它组织或器官的过程,二、悬浮细胞的生长过程,1.悬浮细胞生长的特点,细胞培养周期：两次继代培养所间隔的时间。,在一个细胞培养周期中，细胞的生长情况经历了,慢快慢,的过程（下图）。,延滞期,快速生长期,静止期,下降期,渐降期,云南红豆杉细胞生长曲线,延滞期：,细胞继代培养开始后的一段增殖缓慢的时间。,快速生长期：,细胞数量、重量或体积直线上升的时期。,对数生长期,渐降期：,细胞生长速度逐渐减慢的时期。,静止期：,新生的细胞数量与死亡的细胞数量达到动态平衡的时期。,下降期：,活细胞数量不可逆下降的时期。,云南红豆杉细胞生长和蔗糖消耗动态,蔗糖浓度,细胞干重,细胞悬浮培养要求达到一定的接种细胞密度(cells/ml)，一般为0.5-2.510,5,个 细胞/ml。密度高，细胞分裂快，延滞期短；密度低则相反。如果密度太低，则细胞不能不分裂，最后全部死亡。因此，悬浮细胞培养时，要求达到,最低起始细胞密度（minimum initial cell density）。,最低起始细胞密度:细胞能够生长、分裂的最低接种密度,。,影响,最低起始细胞密度的因素,(1)植物种类：,生长快、容易培养的植物（如大多数草本植物），其最低起始细胞密度比较低；相反，则高。,(2),细胞的生理状况：,用快速生长期的细胞接种，则起始细胞密度可以比较低。,(3),培养基成 分：,用营养成分丰富的培养基或,条件化培养基(conditioned medium),培养细胞，,起始,细胞密度低。,条件化培养基,:培养过几天高密度细胞后的无细胞培养基,(4)培养方式：,采用看护培养（,nurse culture,）是降低最低起始细胞密度的有效方法之一。,看护培养（,nurse culture,）：,将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。,Nurse Culture,（微孔滤膜）,低密度细胞,高密度细胞,透析袋,第三节 单细胞培养技术,单细胞培养是培养彼此分离的单个细胞,是研究和观察细胞生长与分裂过程的有效方法。,单细胞培养常用的方法：微室培养和平板培养。,一、微室培养(,Culture in microchamber,),微室培养是在悬滴培养的基础上发展而来的。1955年DeRopp把含有细胞的液体培养基滴在玻璃板上以观测单细胞的生长。但他没有发现单细胞分裂，发生分裂的是含有几个细胞的小细胞团。,1957,年，,Torrey,改进了培养方法，采用微室培养。利用此培养技术培养豌豆根尖单细胞，得到了含几个细胞的细胞团。,1960,年，,Jones,用条件化培养基在微室中进行悬滴培养烟草杂种细胞，得到了含,30,个细胞的细胞团，并用录象记录了细胞分裂的全过程。,微室,载波片,石蜡,固体培养基和愈伤组织,单细胞,二、平板培养（,Plate culture,）,1960,年,Bergamann,首创，是在固体培养基中培养大量单细胞的一种方法。,1.单细胞悬浮液的制备：,（1）用不锈钢滤网（150,m),过滤快速生长期（旺盛分裂）的悬浮细胞，得到单细胞滤液；,（2）滤液经过离心,后，,细胞沉淀；,（3）倒出上清液,，用新鲜培养基重新悬浮细胞，并,调节细胞密度（视最终接种密度和固体培养基混合的比例而定；一般510,3,-510,5,cell/ml）,步骤：,细胞悬浮液与固体培养基混匀后，倒平板,2.,培养基制备,配制固体培养基，但浓度要比正常的高（与稀释倍数有关），高温灭菌后冷至35-40,。,条件化培养基的配制：,培养悬浮细胞的培养液,离心,取上清液,与高温灭菌的培养基等量混合,冷至35-40,备用。,3.,平板培养的制作：,将单细胞悬浮液按预定的比例与35-40固体培养基混合均匀后，倒入无菌培养皿中，培养基的厚度为5 mm左右。盖上盖子，摇动、布匀，用Parafilme膜封口后，进行培养。（或放入垫有湿润无菌滤纸的大培养皿中，以防水分的蒸发过快）。,4.培养条件：,温度为25，黑暗或弱光照。,平板培养的效果，可用,植板率（plate efficiency）,来衡量。,植板率（%）=每个平板中新形成的细胞团数/每个平板中接种的细胞数100,影响植板率,的因素,(1)植物种类：,生长快、容易培养的植物（如大多数草本植物），其植板率高；相反，则低。,(2),细胞的生理状况：,用快速生长期的细胞接种，则植板率高。,（3）接种细胞密度：,接种密度高，有利于细胞分裂，提高植板率，如烟草细胞。,烟草细胞接种密度和植板率,接种密度（,cell/ml,）,植板率,(%),90,0,180,9.9,360,45.7,720,90-100,接种密度过高，会使细胞团之间相互靠近、接触，这不仅造成计数困难，而且无法判断细胞团的归属，不利于细胞系克隆（clone）的选择。,(4)培养基成分：,用营养成分丰富的培养基或条件化培养基，植板率高。,(5)培养方式：,采用看护培养（,nurse culture,）是可以提高植板率。,平板培养是分离、筛选单细胞无性系的有效方法,第四节 植物细胞大规模培养 生产次生代谢物质,Production of Secondary Metabolites,by Large-scale Culture of Plant Cells,一、植物次生代谢和次生代谢产物,（一）次生代谢和次生代谢产物,初生代谢,：为维持植物正常的生长发育所必须的代谢，如呼吸作用、光合作用、蛋白质和氨基酸代谢、核酸和核苷酸代谢、脂肪代谢、激素代谢等。,初生代谢产物：,初生代谢过程中形成的各种产物。,初生代谢产物不稳定，在体内容易发生转化,。,次生代谢：,对植物正常的生长发育非必需的代谢，,其代谢产物称为次生代谢产物。,次生代谢是在初生代谢基础之上衍生而来的。,次生代谢产物,为,小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，也,往往是末端代谢产物，比较稳定，可以在体内积累。,植物次生代谢产物种类繁多，已经分离、鉴定的有10万个左右，按结构特点可分为,苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、萜类、甾体及其甙、生物碱七大类,。详细情况可参阅中药化学、天然产物化学等书。,鬼臼毒素（抗肿瘤）,苯丙素类,水飞蓟素：,治疗急、慢性肝炎、肝硬化、中毒性肝损伤等）的良药。,苯丙素类,天然色素，绛红色。抗菌、抗炎、抗病毒、止血。用于化妆品生产,紫草,紫草根,紫草素,醌类,芦丁、槲皮素：,治疗心脑血管疾病药物的主要成分。,槲皮素 R=H,芦丁 R=芸香糖,银杏黄酮、大豆黄酮：预防心血管疾病,黄酮类,麻黄碱：,止咳平喘,小檗碱：,抗菌消炎,奎宁：,抗疟疾,生物碱：,来源于生物体的一类,含氮有机化合物,。多,具有显著生物活性。,罂粟=鸦片,主要产地：,金三角地区（缅甸、老挝、泰国）、阿富汗、巴基斯坦、南美,吗啡,镇痛作用,鸦片：含丰富的吗啡、可待因等生物碱,药物：,镇痛,毒品：,麻痹、毒害神经、破坏免役力，容易成瘾,海洛因：由吗啡合成的,二乙酰吗啡,长春花,ajmalicine,阿吗碱,:$2000/kg,Vinblastine,长春碱,:$2 million/kg,Vincristine,长春新碱,:,$15 million/kg,阿吗碱,长春碱,长春新碱,紫杉醇(Paclitaxel=Taxol),紫杉醇的发现,50年代末-60年代初：癌症病人大量增加,60年代中期：美国食品与药物管理局（FDA）制定计划，广泛寻找、筛选治疗癌症的药物（动物、植物、微生物）,1969:美国农业部（USDA）采样员在Oregon洲采取到,太平洋紫杉（pacific yew，短叶红豆杉）,树皮，后经筛选试验发现有强烈的抑制肿瘤的作用,红豆杉(Taxus)：明星植物，药物黄金,Journal of American Chemistry Society,1971 May 5;93(9):2325-23257.,Plant antitumor agents.VI.The isolation and structure of taxol,a novel antileukemic and antitumor agent from,Taxus brevifolia,.,Wani MC,Taylor HL,Wall ME,Coggon P,McPhail AT,1971年：美国北卡州的三角化学研究所的化学家成功地分离出活性物质，起名紫杉醇，并发表了它的化学结构。,没有申请专利保护,1970S:紫杉醇有很好的治疗癌症但临床实验导致1人死亡，FDA否定了紫杉醇,1979：爱因斯坦医学院博士后Susan在,Science,上发表了紫杉醇抗肿瘤机理，重新激起人们对紫杉醇的兴趣。,1980S：发现了导致病人死亡的原因，并解决了紫杉醇安全制剂；广泛研究紫杉醇抗肿瘤作用，发现对多种癌症有效，对耐药性卵巢癌和乳腺癌有特效，且毒副作用远远小于当时发现的其它抗癌物质。,1992年：FDA正式批准紫杉醇为临床用药。,我国在中国医学科学研北京药物研究所方启程研究员主持下，开展了以我国红豆杉为原料的紫杉醇药物生产，成功研制了国产紫杉醇针剂“紫素”（1600元/支），导致进口针剂降到1900元/支）。,紫杉醇：4000-6000元/g；,进口针剂2980元/支（30mg紫杉醇）,紫杉醇为什么贵？,不仅是因为有特效（临床有效率40%），更主要是因为资源稀缺,红豆杉种类：,全世界11种（北半球）。,我国4种一变种：东北红豆杉、中国红豆杉、云南红豆杉、喜马拉雅红豆杉（西藏红豆杉）、南方红豆杉（中国红豆杉的变种）。,数量少：,稀少，散生、不成林,紫杉醇含量低：,干树皮中0.01%（万分之一）,生长缓慢：,小苗需要生长50-70年才可成树、提取紫杉醇，树剥皮即死。,红豆杉资源,1999年，红豆杉被列为我国一级保护植物,2000年后，云南汉德生物技术有限公司非法提取、出口紫杉醇，使野生云南红豆杉遭到毁灭性破坏,农民卖树皮1元/公斤；商贩5元/公斤卖给丽江汉德公司，丽江汉德公司生产半成品（氯仿提取物）1900元/公斤供应给云南汉德。云南汉德生产紫杉醇，20万美元/公斤卖给国外公司。,100公斤树皮能生产1公斤半成品；100公斤半成品可生产1公斤紫杉醇。,1万kg树皮=1kg紫杉醇(1万元增殖150万元),被剥皮的云南红豆杉,（二）获得次生代谢物的方法,植物次生代谢产物的重要性：,色素、香料、药物与保健品、食品添加剂、化工等重要原料等。全球2/3的药物直接或者间接来源于,植物次生代谢产物（天然产物、天然药物）。,1.从植物中提取：,可靠，但受到资源的限制，会破坏野生资源；人工栽培则占用土地、受病虫害、自然灾害等因素的限制。,2.化学合成：,产量高、成本低，但污染环境，而且有些物质结构复杂，难以人工合成，如海南粗榧内酯；有些虽然可以人工合成，但成本太高，如紫杉醇等。,尚未合成,成本太高合成,3.植物细胞大规模培养：,植物细胞具有,形态全能性,，,化学全能性,（在离体条件下可以合成整株植物能合成的物质）。,优点,：不破坏、不依赖野生资源，不受环境因素的影响，环境污染小，不占用土地资源，产量可以调控等，所以是一种很有前途的方法。,自1956年Routin和Nickell首次提出植物细胞培养技术生产天然产物的专利以来，人们在这方面做了大量的探索，取得了重要进展，,主要成就：,证明植物细胞在离体条件下可以合成次生代谢物质；,发现了提高细胞次生代谢物质含量的方法；,可以对植物细胞进行大规模培养（=75吨）；,成功商业生产了少数次生代谢物质,。,1974年：德国,Reihard等在药用植物,（希腊毛地黄）,细胞培养方面取得重要进展，成功地进行了治疗心脏病药物（地高辛）的,生物转化,。,含量高，疗效较好，副作用比较大,含量低，疗效好，副作用小,希腊毛地黄细胞系,胡之璧：上海中医药大学教授，中国工程院院士,胡氏细胞系,1985,年：,日本,Mitsui（三井）,石化工业公司用紫草细胞培养商业化生产,紫草素,（色素，抗菌抗病毒，用于化妆品）,。,1979年：,日本用植物细胞发酵方法大规模培养人参细胞，商业化生产,人参皂甙。,二、植物细胞大规模培养生产次生代谢物质研究的主要过程,1.选择外植体、诱导愈伤组织；,2.通过含量分析、选择高产细胞系；,3.研究培养条件(达到高产、稳产）；,4.建立悬浮细胞培养、优化培养条件(达到高产、稳产）；(参考3),5.小试；优化培养条件(参考4),6.中试;优化培养条件(参考5),7.大规模培养(参考6),8.工业化生产；产品分离、纯化。,适宜的外植体,细胞系,高产细胞系,诱导、建立,选择,高产、稳产细胞系,优化条件,大发酵罐,高产稳产,优化条件,悬浮培养,高产稳产,优化条件,小发酵罐,中试,参考,参考,优化条件,参考,高产稳产,产品提取分离,植物细胞工程流程图：,建立,放大培养,高产稳产,工业化生产,优化条件,放大培养,参考,三、提高次生代谢物产量的方法,植物细胞培养生产次生代谢物的研究进行了60年，只有少数成功的例子（如紫草素、人参皂甙）。,原因：,目标化合物的,产量低、不稳定、成本高。,因此，寻找提高次生代谢物产量的方法对于用植物细胞大规模培养工业化生产次生代谢物极为重要。,1.选择、培育高产细胞系,细胞系合成次生代谢物能力对用植物细胞大规模培养工业化生产次生代谢物有,决定性的影响,。,（1）不同植物、不同单株、不同外植体：,一种次生代谢物可能在多种植物中都有，但含量不同；在同一种植物中，不同植株之间会不同；同一株植物上，不同部位由于生理差异，往往也有不同的次生代谢物合成能力。,云南红豆杉,东北红豆杉,中国红豆杉,南方红豆杉,杂种红豆杉,（2）对细胞系进行,系统选择,：,在培养过程中，细胞系会出现变异。大量的试验证明，通过持续选择，可显著提高细胞系的生产能力。,云南红豆杉细胞系,黄白色细胞,深褐色细胞,云南红豆杉细胞系统选择的结果,植物种类,代谢物,整株植物(%),细胞培养物(%),长春花,长春质,0.0017,0.005,长春花,蛇根碱,2.0,栗米,草莽草酸,10,紫草,紫草素,1-2,15-20,人参,人参皂甙,0.5,2.2,黄连,小檗碱,2-4,13.4,洋紫苏,迷迭香酸,3.0,16,云南红豆杉,紫杉醇,0.02,0.11,中国红豆杉,紫杉烷(,Sinenxan,),微量,4-7，最高11,植株与细胞系中次生代谢物质含量比较,培养的紫草细胞,Sinenxan A：R=Ac,Sinenxan B：R=CH3CH2CO,Sinenxan C：R=CH3CH2CH(CH3)CO,紫杉烷Baccatin III的结构,（紫杉醇的母核）,紫杉烷Sinenxan的结构,紫杉醇,Taxol,（3）细胞诱变选择细胞系：,如Deus用X射线处理长春花细胞，获得了,蛇根碱,含量达2%的细胞系；Berlin等用化学诱变烟草细胞，获得了生产,肉桂酰腐胺,能力提高了10倍的细胞系。,（4）细胞系遗传改良：,利用基因工程技术超量表达限速酶基因、阻断或者改变基因表达，提高细胞系合成次生代谢产物能力。,甲羟戊酸途径与植物甾醇、皂素和三萜类物质的生物合成,2.优化培养基,次生代谢物的产量=细胞生长量细胞合成代谢物的能力,培养基：营养物质+激素,培养基中营养物质和激素的改变，不仅影响细胞的生长，也会影响细胞的代谢，必然会影响次生代谢物质的产量。,培养基,细胞产量(g DW/L),蛇根碱(mg/L),蛇根碱含量（%DW）,Blaydes,7.6,4.4,0.06,LS,9.3,0,0,MS,8.9,10.4,0.12,N-N,2.3,2.0,0.09,VM,5.0,0,0,White,0.8,0,0,B5,5.1,0,0,B5+2,4-D1mg/L1,4.6,0.5,0.01,B5+2,4 D 2 mg/L,5.2,0,0,B5+NAA 1.86 mg/L,7.6,1.2,0.02,Heller+IAA0.175+BA1.13 mg/L,5.4,6.6,0.12,培养基及激素对长春花细胞生长和,蛇根碱合成的影响,蔗糖浓度的影响:,维生素浓度的影响,NO,3,-,：NH,4,+,的影响,3.,饲喂前体物质（precursor）,每种次生代谢产物都有一条生物合成途径。,A,B,C,D,E,F,G,前体物质:,次生代谢物质生物合成途径中的中间物质,实验证明，在培养基中添加,前体物质,是提高次生代谢物产量的一个有效方法。,向鬼臼细胞培养基中添加前提物质使,鬼臼毒素,含量提高12倍,。,在添加前体物质之前，必须了解该次生代谢物的生物合成途径。,紫杉醇结构可以分为母核（baccatin III）和侧链两部分，侧链则是由苯丙氨酸与苯甲酸形成的,；,Baccatin III是二萜类化合物，而二萜类化合物的生物合成途径已经明确。,乙酰辅酶A,紫杉二烯,单萜化合物C10,倍半萜化合物C15,其它二萜化合物,异戊二烯,牻牛儿醇焦磷酸C10,牻牛儿醇焦磷酸C15,牻牛儿醇基牻牛儿醇焦磷酸C20,紫杉二烯环化酶,试验证明，向培养基中添加紫杉醇合成的,前体物质（牦牛儿醇、牦牛儿醇基牦牛儿醇、苯甲酸、苯丙氨酸等）,可以使红豆杉细胞中,紫杉醇,含量提高数倍。,4.使用诱导子（elicitor）,诱导子,:指能刺激细胞合成次生代谢产物的物质。,诱导子分为生物诱导子和非生物诱导子。生物诱导子是指微生物，特别是致病微生物（活菌、高温灭菌后的菌物或其匀浆物）、纤维素酶、果胶酶、微生物多糖等；非生物诱导子是指重金属离子（Ag+,V2+,Hg2+,Cu2+）或Ca2+等。诱导子一般是在细胞培养的中后期（接近细胞最大生长期）加入。,化合物,植物细胞,诱导前产量,诱导后产量,生物碱,罂粟,2.9 mg/L,78 mg/L,黄酮,芸香,0.01 mg/L,0.5mg/L,棉酚,棉花,2.0 mg/L,200 mg/L,皂素,薯蓣,130 mg/L,230mg/L,紫杉醇,红豆杉,2.5 mg/L,5.5mg/L,诱导子促进植物次生代谢物质合成的作用,5.改善培养环境（温度、光照、pH）,温度、光照和pH值对细胞生长和合成次生代谢物质的影响因植物种类而异，最佳条件需要通过试验才能确定。,光照：,光照可以刺激长春花细胞合成蛇根碱、银杏细胞合成黄酮，却抑制黄连细胞中小檗碱、红豆杉细胞中紫杉醇的合成。,温度：,对细胞生长和次生代谢物合成的影响往往不一致。如长春花和骆驼蓬细胞的最佳生长温度分别是27和30，但合成生物碱的最佳温度是分别是16和25。但胡萝卜在25和28时细胞合成花色素的能力无差异。,培养基的酸碱环境：,如雷公藤细胞合成雷公藤素乙的能力在pH6.0时最强；番薯细胞合成色醇的能力在pH6.3时最大，在pH4.8时则不能合成；胡萝卜细胞合成花色素的能力在pH4.5时最强，提高pH值则导致合成能力下降。,6.改进培养方法,（1）两步培养法,：,细胞生长与次生代谢物合成所需要的条件往往不同，并且不同步。对于生长和次生代谢物质合成不同步的植物细胞（如次生代谢物质在细胞生长后期积累），可以在前期采用促进细胞生长的培养基和培养条件，在后期采用促进次生代谢物合成的培养基和培养条件，从而兼顾细胞的生长量和次生代谢物的合成，达到提次生代谢物产量的目的。,云南红豆杉细胞生长与紫杉醇含量动态,紫杉醇含量,生长量,（2）两相培养法：,根据化学反应平衡原理知道，产物的积累会抑制化学反应正方向的速度（反馈调节），移去产物则可以促进化学反应朝正方向进行。同时，产物的积累还可能会对细胞生长有毒害。因此，如果能将次生代谢物收集起来，就可以促进代谢物的合成。两相培养可以解决这个问题。,两相培养法有2种方式。,液固培养:,液相是细胞和液体培养基，固相是能吸收次生代谢物的物质，如树脂、活性炭等。,液-液培养:,一层液相是细胞和液体培养基，另一层液相是能溶解次生代谢物的有机溶剂（如乙酸乙酯、正己烷等，对细胞无毒）。,这2种方法都可以减少培养基中次生代谢物浓度，防止负反馈调节，从而提高代谢物的产量。特别是在培养基中加入促进细胞内次生代谢物向培养基中分泌的物质（如DMSO）时，效果更好。,香竺葵细胞两相培养（液-液培养）：倍半萜的产量提高了500倍。,第四节 毛状根培养与次生代谢物生产,毛状根,（hariy root,发根）,是在,发根农杆菌,诱导下植物形成的细小、多分枝的不定根。,青蒿的毛状根,烟草的毛状根,毛状根的优点,：,（1）,生长快；（2）不依赖激素；（3）具有组织结构，对于生产一些需要细胞出现组织化才能大量合成的次生代谢产物特别有意义。,毛状根是,生产次生代谢产物的一个很有潜力的方法,。,悬浮细胞,再生根,毛状根,长春花：总生物碱含量,培养时间（days）,1986年：Mano Y.等建立的29个,日本莨菪,毛状根无性系均能生产,阿托品烷生物碱,，从中选育出的克隆，其,生长速度比正常植株高102倍，莨菪碱含量达1.3%，为原植株根中含量的3倍。,1987年：Yochikawa等人通过诱导,人参,毛状根，其生长速度为用外源激素诱导根的2倍，人参皂甙含量达干重的0.95%，为天然根的2倍(0.4%)以上。,1990年：Furuga等用20吨的发酵罐进行,人参,毛状根的培养，每月产量为4吨的新鲜培养物。,1993年：孙敏等诱导出,盐芙木,的毛状根，从296个无性系中筛选到4个生长快、分支多的萝芙木转化根系，其中一个的,利血平含量是干重的0.124%，为原植株的3倍。,1996年：芮和恺等诱导的,黄芪,毛状根16 d内,可增殖404倍,。,1997年：郑志仁等用发酵罐大量培养黄芪毛状根，3星期后，毛状根生长量分别达到35倍。,1997年：黄遵锡从短叶红豆杉诱导出毛状根，选育出的5株无性系20d 后生物量增加9倍，紫杉醇含量是愈伤组织的1.3-8.0倍。,毛状根的诱导,发根农杆菌，革兰氏阴性土壤杆菌，自然界中普遍存在，其特点是能感染双子叶植物，并引起植物形成肿瘤或者毛状根。,毛状根诱导机理：,发根农杆菌中Ri质粒上一段DNA（T-DNA，transfer DNA，含有,rolA,roB,rolC,rolD genes,)转到了植物细胞基因组中，引起植物细胞毛状根。,毛状根诱导过程：,1.外植体选择和表面消毒；,2.,发根农杆菌,的活化与培养,保存,的农杆菌在YEP培养基上化平板；,单菌落,接种在液体YEP培养基中，28,/200rpm,2 days；,1:30-50,放大培养,28,/200rpm,6-7h(OD,600,=0.5-0.8)；,离心收集,菌液，悬浮在MS0培养基中。,3.感染,（5-30min),4.共培养,（在无激素、有乙酰丁香酮的培养基上培养2-5天）,5.,毛状根,形成,（在无激素、有抗生素培养基）,毛状根的形成,毛状根诱导是发根农杆菌介导的植物转基因，诱导效率受到很多因素的影响,形态不一,的长春花毛状根,毛状根选择和培养条件优化,不同毛状根的生长速度不同,Ajmalicine(a)and serpentine(b)production on the basis of mg/g dry weight of different hairy root clones of C.roseus var.Prabal,不同毛状根的代谢产物合成能力不同,蛇根碱,阿玛碱,第五节 生物转化(Biotransformation),生物转化:,利用酶或生物细胞（微生物、植物、动物）对外源化合物进行结构修饰。,用途：,增加化合物的生物活性；生产化学合成的中间体。,生物转化过程中所发生的化学反应：,主要有氧化、还原、羟基化、甲基化、去甲基化、糖基化、酰基化、异构化等。,微生物的生物转化最常用。,植物细胞也是一个复杂的化学工厂，进行着各种酶促反应，,有时不能被微生物替代。,7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的生物转化,C7-木糖,紫杉醇,7,酶法水解,C10-乙酰化,细菌转化,7,10,10,利用生物转化来改变化合物结构的研究有很多报道，其中最有名、最成功的是利用毛地黄细胞（,Digitalis lanata,）将digitoxin转化为digoxin,羟基化,胡氏细胞株,digitoxin和digoxin,：从毛地黄中提取出来的强心甙，是治疗慢性心脏病的重要药物。,在植物中digitoxin量多，digoxin量少；但digitoxin疗效不如digoxin，且副作用大。德国科学家通过细胞系筛选，得到了一个可以将digitoxin 转化为digoxin的细胞系。用固定化细胞培养的方法，成功地实现了digitoxin生物转化（100%）的工业化生产。,天麻素(对羟基甲基苯吡喃葡糖苷),：天麻的主要活性成分,白花曼陀罗细胞,在2 000 mL 三角瓶中,加入1 800 mL LS培养基和1.5 g外源对羟基苯甲醛,其糖基化率最高可达85%,对羟基苯甲醛,天麻素,羟基化,烟草的悬浮细胞培养体系能够将外源的（,RS,）-borneol(冰片，龙脑)和（,RS,）-isoborneol（异龙脑）转化成（1,R,，4,R,）-camphor（樟脑）。实验表明（1,S,，2,S,，4,R,）-borneol 和（1,S,，2,R,，4,R,）-isoborneol被氧化成相应的酮，但是（1,S,，2,R,，4,S,）-borneol和（1,S,，2,S,，4,S,）-isoborneol不能被转化,氧化作用,化合物拆分,课程考试,翻译一篇植物组织或者细胞培养的英文论文（参考文献不用翻译）,Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Plant Cell Reports,