分子生物学5-1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,本章主要内容,一、重组DNA技术回顾,二、DNA基本操作技术,三、RNA基本操作技术,四、SNP的理论与应用,五、基因克隆技术,六、蛋白质组与蛋白质组学技术,一、重组DNA技术回顾,分子生物学的三大成就,40,年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是,DNA,而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；,50,年代提示了,DNA,分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；,50,年代末至,60,年代，相继提出了,中心法则,和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,重组DNA的核心是用,限制性内切核酸酶,（restriction endonuclease，RE）和,DNA连接酶,对DNA分子进行,体外切割与连接,。,工具酶的发现和应用被认为是现代生物工程技术史上最重要的事件（P156 表51）。,重组DNA技术：,是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出,人类所需要的新的生物类型和生物产品,。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,Hin,d ：,AAG,CTT,TTC,GAA,A AGCTT,TTCGA A,Eco,R：,GAT,ATC,CTA,TAG,GAT ATC,CTA TAG,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,特殊性质的限制酶,同裂酶（异源同工酶）,：,指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为,同识同切,；切割点也可以是不同的，产生3或5粘性末端，称为,同识异切,。,同尾酶,：,指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶，它们作用后产生,相同的粘性末端,。,可变酶,：,识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。,Bst,p，其识别顺序为GGTNACC。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,2、连接酶,连接的部位：,磷酸和脱氧核糖之间的键：磷酸二酯键（梯子的扶手）,结果：,两个相同的未端的连接。,举例：,Ecoli,DNA连接酶：粘端DNA或切口间的连接；平端连接。,T,4,DNA连接酶：粘端DNA或切口间的连接。,粘性末端的DNA分子最容易相互连接，连接效率也是最高的。,连接反应的最适合温度是1216,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,3、运载体,作用：将外源基因送入受体细胞。,具备的条件：,能在宿主细胞内复制，并稳定地保存；,具有多个限制酶切点；,具有遗传表型或筛选标记,可导入受体细胞，对受体细胞无害。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,举例：质粒、噬菌体和动植物病毒。,克隆载体,用来克隆和扩增DNA片段的载体。,有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类。,表达型载体,为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为表达型载体。,表达型载体除需载体必备条件外，还需相应的启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控构件。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,pBR322质粒,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,噬菌体,组成特点,双链线状,DNA,分子，,全长,50kb,，,含,66,个基因，,在其分子两端各含有,12,个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为,COS,位点,（,cohesive-end site,）。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,噬菌体两种生长途径（示意图）,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,载 体 的 构 建 过 程,主要内容或步骤:,从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。,将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。,将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。,从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。,将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,二、DNA基本操作技术,1、核酸凝胶电泳技术,1.1 原理,将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。,在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈,多聚阴离子状态,（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会,由负极正极移动,。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,1.2 常用固体支持介质,琼脂糖（agarose）,和,聚丙烯酰胺（polyarylamide）,都属于固体支持介质，使用支持介质的目的是防止电泳过程中的对流和扩散，使得被分离的成分得到最大的分辨率。,固体支持介质可以形成复杂的网孔结构，DNA要穿过这些网孔才能到达正极，因此分子量小，结构致密的DNA分子就更容易穿过这些网孔，泳动的速度也越快。,琼脂糖是一种从红色海藻产物琼脂中提取出的线性多糖聚合物，经化学修饰后形成低熔点琼脂糖，常用于DNA片段制备的电泳。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,低熔点（LMP）的琼脂糖是一种熔点为6265 的琼脂衍生物，它一旦熔解，便可在37下持续保持液体状态达数小时之久，而在25下也可持续保持液体状态约10分钟。LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收DNA分子。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,凝胶类型及浓度,分离DNA片段的大小范围（bp）,0.3%琼脂糖,500001000,0.7%琼脂糖,200001000,1.4%琼脂糖,6000300,4%聚丙烯酰胺,1000 100,10%聚丙烯酰胺,500 25,20%聚丙烯酰胺,50 1,DNA大小与迁移距离的关系,在一定范围内，DNA分子迁移的距离与其核苷酸对（bp）的对数成反比。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,DNA分子的状态与迁移速度的关系,在无EB下电泳，cccDNA泳动速度最快，linear DNA次之，ocDNA最慢。随着EB浓度的增加，更多的EB结合到DNA上，cccDNA分子的负超螺旋逐渐解开，其分子半径增加，迁移速率减小。达到游离染料的临界浓度时，不再有超螺旋，cccDNA分子的迁移速率达最小值。继续增加EB，便形成正超螺旋，DNA分子变得更加致密，迁移速率迅速增加。对绝大多数cccDNA分子而言，游离EB的临界浓度介于0.10.5g/ml。由于电荷的中和，以及EB赋予DNA较大的刚性，随着EB浓度的增加，linearDNA和ocDNA的迁移速率也有不同程度的减小。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,指示剂,常用的指示剂有,溴酚兰,和,二甲苯青,及,银染色,.,溴酚兰,在碱性液体中 呈紫兰色，在,0.6%、1%、1.4%和2%,琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与,1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb,的双链线性DNA片段大致相同。,二甲苯青,的水溶液呈兰色，在 1%和1.4%琼脂糖中迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA相似.,指示剂一般与蔗糖、甘油组成载样缓冲液.作用有,增加样 品密度.,在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置.,使样品呈色，加样操作更方便,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,染色,在凝胶电泳中，一般加入,溴化乙锭,（,EB,）-ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,银染,银染色,:,银染色液中的银离子,(Ag+),可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使,Ag+,还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色,.,主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色,.,也用于琼脂糖凝胶染色,.,其灵敏度比,EB,高,200,倍,.,但银染色后，,DNA,不宜回收。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,大分子DNA的电泳分离,在常规琼脂糖凝胶电泳中，有效分离天然DNA分子的大小最大只能到1520kb。更大的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率相同。此时凝胶不能再按分子大小分离DNA，而是在单向恒定电场的作用下，仅以“一端向前”的方式游动穿过整个胶板。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,脉冲电泳(PFGE-Pulse-field gel electrophoresis),1983年，Schwartz等提出了脉冲电场凝胶电泳(PFGE)的设计思想，从而找到了解决这一问题的办法。这一方法在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大DNA分子便滞留在爬行管里，直至沿新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。若DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA分子就可以按其大小分开。分子越大，转向所需的时间越长，总的迁移距离就越短，从而达到分离的目的。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,脉冲电场凝胶电泳(PFGE)的种类,垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field),场翻转系统(field inversion),旋转胶系统(rotating gel),箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field),第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,影响分辨率的因素,脉冲时间（,0.1s-1000s),：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。,电压,：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。,电场夹角,：电场方向的夹角常为,110,0,-120,0,，研究证实,90,0,夹角也非常有效的。,温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，,PFGE,一般应在,4,进行。较高的温度,DNA,泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,2、细菌转化与目标DNA分子的增殖,细菌转化,（,transformation,）：指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫供体菌株，接受转化DNA的菌株叫受体菌株。,在基因克隆中，需要扩增的DNA片段连接到,载体(vector),上，再将重组的载体导入宿主细胞中，重组载体在宿主细胞中复制，目的DNA片段也同时得到扩增。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,绝大多数细菌，包括大肠杆菌（,E.coil,），正常条件下仅能获取少量的DNA，因此，为了提高转化效率，必需对受体细菌进行物理或化学处理，以增加它们获取DNA的能力。这种处理过的细胞称为感受态细胞。,细菌转化常用的方法：,CaCl,2,法,电击法,三亲交配法,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,大肠杆菌培养基,液体培养基（LB液体培养基：1g蛋白胨，0.5g酵母粉，1g NaCl，加重蒸水100ml，用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。）、固体培养基（在液体培养基的基础上加琼脂或琼脂糖）。,有些培养基需要加一些,不耐高温的成分，应在培养基高压灭菌后冷却到一定温度再加入，这些成分的母液可通过过滤除菌。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,在液体培养基中生长,用于转化的大肠杆菌受体菌应采用对数期的细菌；用于提取质粒的应采用饱和期的细菌。在经预备实验测出生长曲线后，通过测定培养液的O.D.600就可以知道液体培养基中的细菌处于什么期。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,2.1 CaCl,2,法,CaCl,2,法是制备大肠杆菌感受态最常用的方法。将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0,）预处理的低渗CaCl,2,溶液中，会造成细胞膨胀，细胞膜的通透性发生变化，极易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物。此时，将该体系转移到42,下热激90s，外源DNA就可能被细胞吸收。,CaCl,2,法关键点：,细菌必须处于生长对数期,实验操作必须在低温下,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,2.2 电击法（electroporation）,在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。,实验简单，不需要制备感受态菌，转化效率高10,9,10,10,/ug,原理,利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,2.3 三亲本杂交结合法,部分质粒含有,tra,基因，指令宿主细胞（如大肠杆菌）产生菌毛（pilus），合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移到另一细胞中。含,tra,基因的质粒称为,接合质粒,（conjugative plasmid）。一般来说，接合质粒分子较大，拷贝数较少，并且宿主广，比较不安全，不宜用作外源基因的载体。不含,tra,基因的质粒称为,非接合型质粒,（non-conjugative plasmid），这类质粒分子小，拷贝数多，不会自行接合转移，比较安全。因此，用于构建克隆载体的质粒一般是非接合型质粒。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,三亲本杂交（tri-parental mating）接合转化法,是基于非接合型质粒的迁移作用（mobilization）而建立的一种DNA转化方法，此法尤其适用于那些难以采用CaCl,2,诱导转化法或电穿孔法等进行重组DNA分子直接转化的受体菌。非接合型质粒不能像接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移，但如果在宿主细胞中存在另外一种相容性的接合型质粒（此处称之为,辅助质粒,），非接合型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,导入真核细胞的方法,CaCl,2,转化,电击法,磷酸钙-DNA共沉淀法,DEAE-葡聚糖介导转染,脂质体法,显微注射法,基因枪法,农杆菌介导法,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,重组质粒的鉴定和筛选,抗生素平板筛选（插入失活）,半乳糖苷酶蓝白筛选,小量制备载体DNA作限制酶切分析,Southern 印迹杂交分析,菌落或噬菌斑原位杂交分析,Spi 筛选,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,抗生素平板筛选（插入失活）,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,Lac操纵子调控模型,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,互补的原理,现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸（肽）的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框，但可使少数几个氨基酸插入到半乳糖苷酶的氨基端，而不影响功能。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,互补的原理,这种载体适用于可编码半乳糖苷酶 C 端部分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但这两个肽段可以融为一体，形成具有酶学活性的半乳糖苷酶。这种互补叫做互补。,半乳糖苷酶能将无色的x-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）转变成蓝色的5-溴-4-氯靛蓝，用这种方法可方便地检测出该酶活性的存在。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,互补的应用,当外源DNA插入到载体,lacZ,的多克隆位点上后，破坏了肽，从而不能发生互补，不能产生有活性的半乳糖苷酶。,当培养基中存在IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）和x-gal时，由携带了外源DNA的重组载体转化的细胞长成白色菌落（或无色噬菌斑），而由没有携带外源DNA的空白载体转化的细胞长成蓝色菌落（或蓝色噬菌斑）。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,限制性内切酶图谱、PCR分析,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,重组体DNA分子的外包装法,利用噬菌体颗粒能够有效的将DNA注入宿主细胞，发明了重组体DNA分子的外包装法。,噬菌体DNA分子可分为3个区。左臂区含有编码头部和尾部结构的蛋白基因，右臂区含有负责DNA复制、使宿主细胞裂解的基因，以及这些基因表达的调控序列。中央区的基因对于形成噬菌体是不必需的，这一段可被外源DNA取代。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,环状分子,左臂,左臂,右臂,右臂,中央区,中央区,（40%）,Cos位点,将噬菌体改建成载体的措施,消除基因组必需区内不必要的限制性内切酶酶切位点。,在可替代区构建所需的酶切位点。,可在外源,DNA,插入位点之前加入适当的启动子，以表达外源,DNA,。,加入易检测的表型基因（如,lacZ,）。,重组,噬菌体最好能够包装，以增加转导率。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,在载体中，只有单个切点供外源DNA插入的叫,插入型载体（insertion vectors）,；那些具有成对的切点，且切点间的片段又可被除去并被外源DNA取代的载体叫,取代型载体或替换型载体（replacement vectors）,。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,3、聚合酶链式反应,聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）,是一种体外扩增DNA片段的方法，与用载体和宿主细胞的体内扩增相比，有简便、快速的优点，并有许多特殊的用处。,其原理是：以DNA的一条链为模板，在有RNA引物、4种脱氧核苷酸（dNTP）时，和DNA聚合酶的条件下，在引物所结合的位置向3方向合成新的互补链。其反应以双链DNA的变性、退火、延伸为一个循环。经过多次循环（25-30次），便目标DNA片段得以大量扩增。由于每一次循环所产生的新链均可成为新的模板用于下一轮循环，故PCR产物以指数方式增加。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,PCR原理图,PCR反应的体系,DNA,模板,一对引物,耐热的,DNA,聚合酶,4dNTP,缓冲液,Mg,2+,、,K,+,离子,酶活性保护剂,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,PCR仪,PCR仪实际上就是一种温度循环仪，它能够快速地升降温和保持恒温，全部由电脑控制。常用的反应容器有0.2ml的薄壁Eppendorf管和毛细玻璃管。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,对DNA模板的要求,对DNA模板纯度的要求不很高，但必须除去DNA聚合酶抑制剂。理论上有一个DNA模板分子就可以扩增出大量的产物，实际上使用pgng级的模板量。模板一般是双链分子，也可以是单链分子。模板DNA分子不宜太长，可用切点稀少的限制酶切成较短的片段。由于环状DNA模板的扩增效率较线状DNA模板低，所以最好先将环状DNA用限制酶切成线状再行扩增。,RNA模板应先逆转录成cDNA再进行PCR扩增。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,引物,长度一般为,1530,个核苷酸。引物太短与模板结合的位点特异性差，引物太长与模板结合的速率下降，影响,PCR,的效率。,不应有超过,3,个连续的,C,或,G,。引物自身不存在互补序列，两个引物之间也不能有超过,4,个连续碱基互补的情况，,G+C,含量为,40-60,。,当引物的,3,端有足够长与模板互补的序列时，引物的,5,端可以不与模板互补，利用这点可在,PCR,产物的两端加上特殊序列（如限制性内切酶位点）。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,BamH,I,4.为了方便PCR产物的检测和分析，可以在引物的5端以同位素或非同位素修饰（,32,P、荧光素、生物素等）。,5.当要扩增的DNA序列不知，但知其编码的氨基酸序列，可反推出DNA序列，为设计引物提供依据。因简并密码的存在，反推出的DNA序列是不唯一的，这时应采用简并引物。,常用的引物设计软件：Oligo，Primer,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,Taq,DNA聚合酶,现在常用的,Taq,酶，在,95,的变性温度下（,20,秒），经过,50,次循环仍保持,65%,的酶活性。对于,Taq,酶的聚合酶活性来说，最佳作用温度为,7580,，,60,时聚合酶活性仅剩,1/2,，,37,时聚合酶活性仅剩,1/10,。但在许多情况下，需要在低于最适温度条件下进行聚合反应，以免引物从模板上解离下来。,Taq,酶有,53,的聚合活性和,53,的外切活性，但缺少,35,的外切活性，所以没有校正功能，有时会发生错误合成。使用,Taq,酶还往往在所有扩增产物的,3,端增加一个非模板依赖的,A,。现在作为商品供应的,Taq,酶有从嗜热水生菌中提纯的天然酶和利用大肠杆菌生产的基因工程酶。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,RT-PCR：用于在mRNA反转录为cDNA之后进行的PCR扩增。,RT-PCR,(reverse transcript PCR，反转录PCR),mRNA cDNA 模板,反转录酶,Oligo dT,加入不含DNA酶的RNA酶将多余mRNA消化,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,嵌套PCR,(nested PCR),通过两对嵌套引物进行两次PCR扩增特异目的基因,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,反向PCR,(inverted PCR),用于扩增已知序列两侧未知序列,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,锚式PCR,(anchored PCR),第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,RACE,Rapid Amplification of cDNA Ends,利用锚式PCR的方法，扩增mRNA 3端或5端的全长cDNA序列称为RACE（cDNA末端快速扩增法）。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,锚式PCR扩增已知序列3侧序列,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,锚式PCR扩增已知序列5侧序列,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,锚式PCR扩增全长的mRNA序列,要扩增全长的mRNA，先用oligo(dT)作引物逆转录该mRNA成全长的cDNA第一链，再给cDNA第一链的3端进行同聚物加尾（如GGGGG），最后用oligo(dT)和oligo(dC)进行扩增。,一般都是先分别做3RACE和5RACE后，将上述两者结果进行拼接，再合成两端特异引物进行RT-PCR得到全长mRNA序列。,第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,不对称PCR,(asymmetric PCR),第五章 DNA、RNA及蛋白质操作技术,