分子生物学---第11章-分子生物学研究方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,教学目的、要求,1.掌握DNA克隆的一般步骤；用于DNA克隆酶的种类、特性及作用,2.掌握受体细胞的种类、载体的特性,3.掌握大肠杆菌载体质粒pBR322和pUC18/19,4.掌握基因组文库和cDNA文库的概念；构建的步骤,5.掌握核酸杂交的原理和步骤；探针标记的方法,6.掌握DNA测序的原理,7.掌握PCR的原理和反应过程,主要内容,第一节 DNA分子克隆概述,第二节 DNA分子克隆的四大要素,第三节 DNA的克隆,第四节 基因文库的构建,第五节 克隆基因的分离与鉴定,第一节 DNA分子克隆概述,一、基本概念,二、DNA克隆的基本过程,三、基因工程的诞生,四、基因工程的发展,DNA,克隆,(DNA,clonging,),：,是按人类的意愿，在体外对,DNA,分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该,DNA,分子的大量拷贝。,四大要素：,基因、载体、受体、工具酶,又称为：,DNA,重组、分子克隆、基因克隆、基因工程等。,一、基本概念,一、基本,概念,什么是基因工程,基因工程（Genetic Engineering）：,在,分子水平,上，分离不同生物的遗传物质，在体外,切割、,重组，然后把重组的DNA分子,引入,细胞或生物体内，使这种外源DNA(基因)在受体细胞中进行,复制与表达,，按人们的需要生产不同的,产物,或定向地创造生物的,新性状,，并稳定地遗传给下一代的技术。,DNA克隆,(DNA clonging),的基本过程,基因的分离,DNA,的体外重组,(,切、接,),重组,DNA,分子的转化和扩增,(,转、增,),转化子的筛选和鉴定,(,检,),外源基因的表达,二、DNA克隆的基本过程,基本过程,分,切,接,转,筛,第二节 DNA分子克隆的四大要素,一、分子克隆工具酶,二、分子克隆载体载体,三、目的基因,四、受体细胞,一、分子克隆工具酶,一般把DNA分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。,常用的工具酶：,1.限制性核酸内切酶,2.连接酶,3.DNA聚合酶,4.其他分子克隆工具酶,1.限制性核酸内切酶,(1)定义：,是一类识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3,-OH 基团5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。,(2)发现：,本来是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细菌中的一种防御机制。,1970,年，,Smith,等人首先从流感嗜血杆菌,d,株中,分离出,Hind II,和,Hind III。,限制性核酸内切酶的分类和命名,(3)命名,：,根据酶的微生物学名命名：,如,：,Escherichia coli,R,株中几种限制酶：,Eco,R I，,Eco,R,II，,Eco,R,V,E,co,R,I,微生物属名,微生物种名,微生物株或型,发现分离的先后顺序,1968年，沃纳.阿尔伯、丹尼尔.内新思和汉密尔顿.史密斯从大肠杆菌中提取出限制性内切酶。并于1978年获得诺贝尔生理学与医学奖.,(4)II型限制性内切酶的基本特性,识别序列8个碱基，每,（）个碱基出现一个靶序列；,回文结构,（palindrome）,三种不同的切口：,平末端,(blunt end),突出粘性末端,(5-cohensive end or stick),突出粘性末端,(3-cohensive end or stick),II类限制修饰系统是由限制内切酶和独立的甲基化酶组成的,二元系统,(,限制修饰系统，,R-M系统）,。修饰与限制内切酶识别位点相重叠的序列。,GAA TTC,CTT AAG,回文对称结构,5-cohensive end or stick,以EcoR I为例,G AATTC,CTTAA G,5,3,3,5,G,p,5,CTTAA,OH,3,OH,AATTC,3,p,G,5,5,5,3,3,EcoR I,CTGCA G,G ACGTC,5,3,3,5,CTGCA,p,5,G,OH,3,OH,G,3,p,ACGTC,5,产生,3-cohensive end,以Pst I为例,5,5,3,3,Pst I,TCG CGA,AGC GCT,5,3,3,5,blunt end,以Nru I为例,TCG,p,5,AGC,OH,3,5,3,OH,CGA,3,p,GCT,5,5,3,Nru I,R-M 系统,(5)II型限制性内切酶的用途,：,DNA克隆,DNA杂交与序列分析,改建质粒,构建基因组图谱和文库,(1),性质,：催化两个独立DNA片段的5磷酸基与3羟基之间形成,磷酸二酯键,，使DNA片段拼接起来，只对,双链,起作用，对单链不起作用,2、连接酶,(DNA ligase),(2)DNA连接酶的种类,E.coli,DNA,ligase,催化双链,DNA,片段互补粘末端的连接,(,“,粘接”,),T4 DNA,ligase,互补粘末端的连接,平末端的连接,(,“,端接”,),互补粘末端的连接,平末端的连接,3、,DNA聚合酶,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,大片段（,Klenow,）,T4-DNA,聚合酶,依赖于,RNA,的,DNA,聚合酶（反转录酶）,耐热,DNA,聚合酶,4.其他分子克隆工具酶,(1)末端脱氧核苷酸转移酶,(2)T4多核苷酸激酶,(3)碱性磷酸酶,(1)末端脱氧核苷酸转移酶,常用：,从,小牛胸腺中提取的一种碱性蛋白质,催化作用：,在二价阳离子存在下，催化,dNTP,加到,DNA,分子的,3-,羟基端。,用途：,在平末端合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端,给载体或,cDNA,加上互补的同聚物尾巴，用于外源基因重组，,标记,DNA,片段的,3,端,(2)T4多核苷酸激酶,来源：,从T4噬菌体感染后的E.coli中提取的具有激酶活性的蛋白质,作用：,催化,ATP,的,-,磷酸基转移至,DNA,或,RNA,片段的,5,末端,用途：,标记,DNA,片段的,5,端，制备杂交探针,基因化学合成中，寡核苷酸片段,5,磷酸化,用于测序引物的,5-,磷酸标记,(3)碱性磷酸酶,来源,：大肠杆菌,(bacterial alkaline,phosphatase,BAP),和小牛肠,(calf intestinal alkaline,phosphatase,CIP),作用：,脱磷酸化作用，去除,5,末端的磷酸基团,用途：,防止在重组中自身环化，从而提供重组效率,在,5,端标记前，去除非标记的,5,磷酸,二、分子克隆载体,1、概 述,2、质粒载体,3、噬菌体或病毒载体,4、人工染色体,5、表达载体,1.概 述,基因克隆载体？,能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以稳定维持的,DNA,分子。,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,基因克隆载体应具备的条件：,必须含有允许外源,DNA,片段组入的克隆位点，并且克隆位点应尽可能的多，,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,具有合适的筛选标记,必须是安全的,载体的分子量要小,具有针对受体细胞的,亲缘性或亲和性,载体的类型,来源,:,质粒、噬菌体、病毒、酵母人工染色体,功能,:,克隆型载体和表达型载体,受体细胞,:,原核细胞载体和真核细胞载体,(,穿梭载体,),2.质粒plasmid,是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状,DNA,分子。,存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。,(1).双抗生素抗性,pBR322,4.36kb,最早使用的载体之一,含有两个抗性基因,Tet,r,and,Amp,r,如果目的,DNA,片段插入到这两个基因中的任一编码区内，则该基因会发生插入失活。,当带有,抗菌素抗性基因,的,载体,进入受体菌后，受体菌才能生长。,不带有,抗菌素抗性基因,的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。,抗菌素选择原理,活,死,抗性基因,抗菌素,四环素抗性插入失活,(2),蓝白斑筛选,PUC18/19 vector,某个基因的插入失活。,这个基因是,lacZ,编码,b,-,半乳糖苷酶,.,lacZ基因互补显色筛选,b,-半乳糖苷酶氨,基端的一个片段,宿主细胞中的缺陷型,b,-半乳糖苷酶基因,a,-互补,IPTG,b,-半乳糖苷酶,X-gal,蓝色菌落,IPTG：异丙基-,b,-D-硫代半乳糖苷,X-gal：5-溴-4氯-3吲哚-,b,-D-半乳糖苷,pUC18/19,通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。,MCS,无插入时，互补，蓝菌斑。,MCS,有插入时，不互补，白菌斑。,IPTG,诱导的结果：,Shuttle vectors 穿梭载体,人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。,Most of the eukaryotic vectors are,constructed as shuttle vectors,H4 Eukaryotic Vectors,三、,受体细胞,受体细胞：能摄取外源,DNA,，,并使其稳定维持的细胞,受体细胞应具备的条件：,限制性缺陷型,外切酶和内切酶活性缺陷,重组整合缺陷型,用于基因扩增或高效表达的受体细胞,具有较高的转化效率,具有与载体选择标记互补的表型,感染寄生缺陷型,防止重组细菌扩散污染，生物武器除外,常用的受体细胞,原核生物细胞：,大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌,真核生物细胞：,酵母、植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞,四,、,目的基因,定义：,在分子克隆设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。,目的基因的分离是分子克隆操作的,关键步骤,来源：,各种生物,获得目的基因的途径,酶切直接分离法,构建基因组文库或,cDNA,文库,PCR,或,RT-PCR,扩增法,化学合成法,第三节 DNA的克隆,一、,基因的分离,二、,DNA,的体外重组(切、接),三、重组,DNA,分子的转化和扩增(转、增),四、转化子的筛选和鉴定(检),五、外源基因的表达,二、,DNA,的体外重组,(一)基因重组的概念,将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。该过程称为基因重组。,X,if the vector is phosphoralated,Recombinant DNA molecules,G4 Ligation,transformation and analysis of recombinants,The use of alkaline phosphate to prevent religation of vector molecules,碱性磷酸酶可以阻止载体分子自我环化,G4 Ligation,transformation and analysis of recombinants,(二)连接方法,1.互补粘性末端的连接,2.齐平末端的连接,3.DNA片段末端修饰后连接,4.DNA片段加连杆后连接,CCGG,GGCC,CGG,C,C,GGC,CCGG,GGCC,CCGG,GGCC,CGG,C,C,GGC,Hap,Hap,plasmid vector,target DNA,CGG,C,C,GGC,CGG,C,C,GGC,DNA ligase,recombination,plasmid,C,GGC,CGG,C,CGG,C,C,GGC,plasmid vector,target DNA,restriction endonuclease,同聚物加尾法,dCTP,dGTP,poly C,poly C,poly G,poly G,poly G,poly C,poly G,poly G,poly C,DNA ligase,recombination,plasmid,poly C,poly C,poly G,粘性末端修饰成平末端后进行连接,GGATCC,CCTAGG,BamH I,衔接物,DNA ligase,GGATCC,CCTAGG,GGATCC,CCTAGG,target DNA,GGATCC,CCTAGG,GGATCC,CCTAGG,BamH I,G,CCTAG,GATCC,G,G,CCTAG,GATCC,G,BamH I,切割的质粒载体,DNA ligase,recombination,plasmid,重组DNA导入的方法,化合物诱导转化法,Ca,2+,诱导的完整细菌细胞的转化,聚乙二醇,电穿孔转化法,微生物细胞、动植物细胞、原生质体,微弹轰击转化法,(,基因枪法,),植物组织,三、重组,DNA,分子的转化和扩增,10ng,载体,DNA,100,L,感受态菌,On ice,混合，静置,10,分钟,42C 1,分钟,加入,1mL LB,培养基,37,摇,1,小时,10-100,L,转化液涂含抗菌素的平板,吸附,DNA,摄入,DNA,重组DNA导入的方法,脂质体介导转化法,体内注射转化法,动植物细胞、细胞器,磷酸钙转染法,动物细胞,病毒,(,噬菌体,),颗粒转导法,构建基因文库和动物转基因,三、重组,DNA,分子的转化和扩增,脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。,脂质体（,lipofectin,）载体法,脂类包埋,DNA,，通过细胞膜进入细胞,。,直接把外源,DNA,注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。,显微注射法,(microinjection),磷酸钙沉淀法,第四节 基因文库的构建,一、基因文库的概念和文库的类别,二、基因组文库的构建,三、cDNA文库的构建,一、基因文库的概念和文库的类别,基本概念,基因文库：某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合称为该生物的基因文库。,一、基因文库的概念和文库的类别,文库的类别,基因组,DNA,文库：将某种生物基因组,DNA,用适当的限制酶切断后，与载体,DNA,重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组,DNA,的种群,cDNA,文库：将某种细胞的全部,mRNA,通过逆转合成,cDNA,，,然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群。,该文库具有,组织细胞特异性。,二、基因组文库的构建,(一)基因组DNA文库的载体制备,(二)基因组DNA的提取和部分酶切,(三)分离适当大小的基因组DNA片段,(三)外源DNA的连接转化或包装侵染,(四)基因组文库的鉴定和扩增,（2）,目前常用的载体,(一),构建基因文库的载体选用,载体能够容载的,DNA,片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。,载体容量越大，所要求的,DNA,片断数目越少，所需的重组子越少。,（1）对载体的要求,载体系列：,容量为,24 kb,cosmid,载体：,容量为,50 kb,YAC,：,容量为,1 Mb,BAC:,容量为,300 kb,断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。,(二)染色体,DNA,大片段的制备,超声波（,300bp,）或机械搅拌（,8kb,）。,物理切割法：,内切酶,Sau3A,进行局部消化。可得到,10-30kb,的随机片断。,酶切法：,(三)载体与基因组,DNA,大片段的连接,粘性末端直接连接,载体与外源,DNA,大片段的两个末端都有相同的粘性末端。,如：,Sau3A,与,BamHI,的酶切末端。,直接连接、人工接头或同聚物加尾。,人工接头法（,adapter,）,人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。,各种酶的接头可以向公司定做或购买。,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,粘性末端,同聚物加尾,(四),基因组文库的大小,一个文库要包含,99%,的基因组,DNA,时所需要的克隆数目。,N=,ln(1-p),ln(1-f),p:文库包含了整个基因组DNA的概率,（99%）,f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因,组DNA的,百分数,N：所需的重组载体数（克隆数）,For example,:for a probability of,0.99,with insert sizes of,20 kb,these values for the,E.coli,(4.6,10,6,bp)and human(310,9,bp)genomes are:,N,E.coli,=,=1.1 10,3,ln(1-0.99),ln1-(210,4,/4.610,6,),N,human,=,=6.9 10,5,ln(1-0.99),ln1-(2 10,4,/3 10,9,),These values explain why it is possible to make good,genomic libraries from prokaryotes in plasmids where,the insert size is 5-10kb,as only a few thousand,recombinants will be needed.,I,1,Genomic libraries,Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage l vector,.,The nonessential regions in the right half of the l genome usually are deleted to maximize the size of the exogenous DNA fragment that can be inserted.Then the l DNA is treated to remove the central replaceable region.In this example,the replaceable region is cut out with,Bam,HI,and the total DNA from human cells is partially digested with,Sau,3A.These two restriction enzymes produce fragments with complementary sticky ends(red lines).The l vector arms and 20-kb genomic fragments are mixed,ligated,and packaged in vitro to produce recombinant l phage virions,which are plated on a lawn of,E.coli,cells.In the diagrams of DNA regions,light and dark shades of the same color indicate complementary strands.,1.cDNA,以,mRNA,为模板,逆转录,出的,DNA,称,cDNA,。,2.cDNA library,三、,cDNA,文库的构建,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,利用某种生物的,总,mRNA,合成,cDNA,，再将这些,cDNA,与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称,cDNA,文库。,（,1,）,不含内含子序列。,（,2,）可以在细菌中直接表达。,（,3,）包含了所有,编码蛋白质的基因,。,（,4,）比,DNA,文库小,的多，容易构建。,4.,构建,cDNA,文库的一般步骤,（,1,）总,RNA,（,total RNA,）提取,3.cDNA,文库的特点,提取总,RNA,有商业化的试剂盒（,kit,）。,分离,mRNA,用商业化的,Oligo dT,纤维柱。,利用,mRNA,都含有一段,polyA,尾巴，将,mRNA,从总,RNA,（,rRNA,、,tRNA,等）中分离纯化。,mRNA只占总RNA的1%-2%。,（,2,）,mRNA,的分离纯化,原理,mRNA,的分离纯化,Column,（柱）,反转录酶,（,3,）,cDNA,的合成,cDNA,第一链合成,逆转录酶能以,RNA,为模板合成,DNA,。,用,Oligo dT,（或随机引物）作引物，合成,cDNA,的第一链。,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT,引物,用,碱,处理或用,RNaseH,降解,mRNA-DNA,杂交分子中的,mRNA,。,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA,第一链,3,3,5,5,引物,cDNA,第一链,3,5,引物,降解,mRNA,模板,或,RNaseH,碱,剩下的,cDNA,单链的,3,末端一般形成一个,弯回来的双链发卡结构,（机理不明），可成为合成第二条,cDNA,链的引物。用,DNA,聚合酶合成第二链,DNA.,。,cDNA,第一链,5,cDNA,第二链合成,DNA,聚合酶,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,cDNA,第二链合成,去掉发卡结构,核酸酶,S1,用,核酸酶,S1,可以切掉发卡结构（但这会导致,cDNA,中有用的序列被切掉！）。,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,cDNA,第一链,cDNA,第二链,5,3,5,3,mRNA,cDNA,3,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA,第一链,3,5,引物,mRNA,cDNA,第一链,3,5,mRNA,mRNA,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,cDNA,第二链,cDNA,第一链,3,5,RNaseH,DNA ligase,去引物,在双链,cDNA,末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。,或借助末端转移酶给载体和双链,cDNA,的,3,端分别加上几个,C,或,G,，成为粘性末端。,5.,cDNA,与载体连接：,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,6、目的cDNA克隆的筛选（,screening,）,用目的基因探针与文库中的重组载体进行,Southern blot,杂交。,文库,载体,探针,电泳后杂交放射自显影,测序分析,第五节 克隆基因的分离与鉴定,一、克隆子的筛选,二、重组体的鉴定,三、核酸杂交,四、核酸序列分析,五、PCR,一.,克隆子的筛选,克隆子：摄取外源,DNA,分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞,转化子：采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子,重组子：含有重组,DNA,分子的克隆子,三.,克隆子的筛选,根据载体选择标记基因筛选转化子,根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选,根据载体除草剂抗性基因和相应的选择药物筛选,营养缺陷型筛选,根据,lacZ,基因互补显色筛选,二、重组子的鉴定,根据重组,DNA,分子特征鉴定重组子,根据目的基因转录产物,(mRNA),鉴定重组子,根据目的基因翻译产物,(,蛋白质、酶、多肽,),鉴定重组子,根据重组DNA分子特征鉴定重组子,根据重组,DNA,分子大小鉴定重组子,根据重组,DNA,分子限制性内切核酸酶酶切图谱鉴定重组子,根据,PCR,扩增片段鉴定重组子,采用,DNA,杂交法鉴定重组子,根据,DNA,核苷酸序列鉴定重组子,限制性酶切图谱法,三、核酸杂交,分子杂交的原理：,不同来源的单链核酸（,DNA,或,RNA,），,只要它们具有大致相同的碱基序列，经过退火处理，就能重新形成杂种双螺旋,分子杂交的方法：,原位杂交,Sorthern,杂交,Northern,杂交,1.,DNA或RNA探针的标记,概念,探针：带有能检测的标记物的特定的DNA或RNA序列(片段)。,探针标记：使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程。,1.,DNA或RNA探针的标记,核酸探针的种类,根据是否使用放射性标记物,放射性标记探针：,分为均匀标记和末端标记,非放射性标记探针,根据核酸的性质,DNA,探针,(,单链和双链探针,),，,RNA,探针，,cDNA,探针，寡核苷酸探针,末端标记法,利用,Klenow,片段进行,3,末端标记,利用末端脱氧核苷酸转移酶进行,3,末端标记,利用,T4,多核苷酸激酶进行,5,末端标记,适用于寡核苷酸探针或短的,RNA,和,DNA,探针,均匀标记,切口平移法,随机引物合成法,以,M13,载体衍生序列为模板，用,Klenow,片段合成单链探针,切口平移法,原理,首先用,DNA,酶在双链,DNA,探针分子的一条链上制造一些缺口（,nick,）,缺口处会形成,3,羟基末端，,E.coli,DNA,聚合酶,I,就可将核苷酸连接到切口的,3,羟基末端，同时该酶具有从,5,至,3,的核酸外切酶活性，将缺口,5,侧核苷酸依次切除，从而使切口沿着,DNA,链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。,以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针,2.原位杂交筛选,特点：,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,1)待测DNA样品的制备、酶切,2)待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳,3)凝胶中DNA的变性：碱变性,4)转膜：,硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜/毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法,5)杂交,6)杂交结果的检测,2.Southern印迹杂交,转 膜,4.Northern blotting,用,DNA,（或,RNA,）探针检测,RNA,样品。,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取,RNA,，再用探针杂交。,Northern印迹杂交,与Southern杂交的不同,靶核酸：,RNA,RNA,电泳,(,需加变性剂如甲醛,),转膜：不需变性,四、核酸序列分析,1.生化方法：,Sanger的双脱氧链终止法,Sanger 等，1977年,2.化学方法：Maxam-Gilbert化学修饰法,Maxam和Gilbert，1977年,其他方法：如生物芯片、生物杂交等,在DNA的合成过程中加入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，因ddNTP在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因而形成一种具有相同5-引物端和以相应ddNTP残基为3端的长短不一系列混合物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中相应碱基的分布提供准确信息，从而读出DNA的序列。,ddNTP是Sanger双脱氧链终止法的关键。,1.Sanger的双脱氧链终止法,O,碱基,C,P,OH,H,1,2,3,4,5,O,碱基,C,P,OH,H,1,2,3,4,5,OH,脱氧核苷酸的连接,O,碱基,C,P,O,H,1,2,3,4,5,O,碱基,C,P,OH,H,1,2,3,4,5,H,2,O,脱氧核苷酸的连接,双脱氧链终止法测序的需求：,单链DNA模板,寡聚核苷酸引物:,需带有,放射性或荧光标记,。,DNA聚合酶,四种dNTPs,四种ddNTPs,用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。,Maxam-Gilbert化学修饰法,化学修饰试剂,硫酸二甲酯：,G,哌啶甲酸：,A+G,肼：,C+T,肼,NaCl,：,C,90,，,NaOH,：,AG,五、PCR,利用与靶DNA序列两端互补的一对引物来体外扩增DNA序列的技术。,1.PCR技术的原理和过程,无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过,高温变性,、,低温退火和中温延伸,三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。,一般样品是经过30次循环,最终,使基因放大了数百万倍,;扩增了特异区段的DNA带,。,高温变性,中温延伸,低温退火,PCR过程动画,*,Denaturation,变性,*,Anealing,退火,*,Extention,延伸,2.PCR循环,模板DNA,95,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,50,引物1,引物2,DNA引物,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,引物1,引物2,DNA引物,72,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,(二)、PCR的反应体系,标准的PCR反应体系,4种dNTP混合物 各200umol/L,引物 各10100pmol,模板DNA 0,.,12ug,Taq DNA聚合酶 2,.,5u,反应缓冲液(Mg,2+,)1,.,5mmol/L,1）定义,是指与待扩增的靶,DNA,区段两端序列互补的人工合成寡核苷算短片段,引物,1,：,5,端,DNA,序列互补的寡核苷酸,引物,2,：,3,端,DNA,序列互补的寡核苷酸,PCR的引物,引物1,引物2,互补,互补,引物设计的原则,长度：至少,16bp,通常为,1830bp,避免引物内部或引物之间存在互补序列,G+C,含量尽量控制在,40%,至,60%,之间，,4,种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及,T,在,3,末端的重复排列。,引物,3,端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致,PCR,失败,引物,3,端最好是,G,或,C,，但不要,GC,连排。,设计实例：,5,GAGTCCAGACC,GATACTCTCACAACATCTCCTATCCATAAATCCGCGCCGCTTTTATAGACTTAGATACAACCTTATCTATTTTTGAAACAGGAATTAAAGTAGTAGATCTTTTGGCCCCTTATCGTCGTGGGGGAAAAATCGGACTATTCGGTGGGGCTGGCGTGGGTAAAACAGTACTAATTATGGAATTGATCAACAACATTGCCAAAGCTCATGGTGGTGTATCCGTATTTGGTGGAGTAGGCGAACGAACTCGTGAAGGAAATGATCTTTACATGGAAATGAAAGAATCTGGAGTCAT,TAGGTACGCAGTC,3,以上是ATP合成酶基因的一个片断，若将对其进行扩增，则可以设计以下引物：,5端引物,CTCAGGTCTGG,3端引物,ATCCATGCGTCAG,经PCR反应后，可获得大量的该基因片断！,*,引物通常可由生物工程公司合成，如上海生工，目前每合成一个碱基大约需1.5元。,PCR的引物,2）引物浓度,0.1-0.5 mol/L,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,PCR的引物,0.10 0.25 0.35 0.4 0 0.50,不同dNTP浓度下的PCR,产物电泳比较,发现以0.50,mol/L,的特异性较好，,其它浓度都有错配现象，即出现非特异带。,指特异带,指非特异带,本章重点,1.DNA克隆的概念、基本过程,2.II型限制性内切酶的基本特性、回文对称结构,3.碱性磷酸酶、T4多核苷酸激酶、末端转移酶的作用,4.载体应具备的条件,5.质粒pBR322和pUC18/19的筛选标记及筛选原理,6.受体细胞应具备的条件及常用的受体细胞,7.熟悉基因重组的概念及方法,8.熟悉重组DNA导入受体细胞的方法,9.基因组文库和cDNA文库的概念。,10.基因组文库和cDNA文库构建的步骤,11.探针的概念,12.探针标记的方法,13.Southern 杂交和Nouthern杂交的比较,14.Sanger双脱氧测序的原理,15.什么是PCR，PCR的原理和反应过程、PCR反应体系的组成,16.引物设计应遵循的原则,