微生物遗传第一章基因突变1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,介绍微生物遗传学发展简史,绪论,一、微生物遗传学发展成为一门独立的学科之前的历史,二、微生物遗传学发展的过程,（一）、萌芽时期,（二）、发展时期,（三）、发展成为一门独立的学科,1、在链孢霉中发现了营养缺陷型,2、细菌抗药性突变的研究证明了基因突变的结果,3、细菌基因重组的发现,4、转化因子的化学本质的鉴定,5、噬菌体遗传学的发展,三、微生物遗传学与经典遗传学之间的关系,第一章,基因突变,第二节 突变的概念及其作用机制,一、突变（mutation),由于染色体或基因本身一瞬间的变化，而产生的遗,传性状的变异叫突变。,二、突变的类型,1、从突变作用的条件划分,1.1,自发突变,1.2,诱发突变,在自然条件下，未经诱变剂处理而发生的突变(实际上是由一些原因不详的低剂量诱变因素长期综合反应的结果)。,人为控制的，已知剂量的某些诱变物质作用的结果。,2.1,同义突变,2.2,错义突变,2.3,无意义突变,2、从突变引起的遗传信息的改变,通常不能从表型上区别，因为DNA上某一碱基对发生置换反应虽使DNA的核苷酸顺序发生变化，但参入到多肽链中仍然是原来的氨基酸，故蛋白质仍没发生改变。,当DNA发生改变时，使mRNA某一位置上的密码由一种氨基酸变成另一种氨基酸，使得这一蛋白质结构有所改变，从而导致酶失活或,部分失活。,DNA由于突变，使得mRNA某一密码子变成了三个无意义密码子（即 UAG、UAA、UGA）中的任何一个，结果当翻译到达这一位置时，肽链不能继续延长，产生一个失活的多肽。,三、基因突变的规律,1.抗药性突变的产生和药物存在无关（基因突变与环境条件无直接对应的关系）,1.1 波动实验（图1-1）,1,2,3,6,5,通过影印培养，从没有接触链霉素的敏感细菌中筛选链霉素抗性细菌的实验图解,含有链霉素,非抗性菌落,抗性菌落,4,表示不加链霉素,表示加链霉素,S,不含有链霉素,S,S,1.2 用影印法实验证明抗链霉素的突变与链霉素存在无关,2、抗药性突变以一定的突变率发生在个别的细菌中,突变率的定义：每一细胞每一世代中所发生突变的机率。,公式：,M2 -M1,突变率=-(固体),N 2-N1,M2 -M1,突变率=(-)/g,ln2(液体中),N 2-N1,-lnP,O,突变率=-(泊桑公式),N,突变型数目,突变频度=-(泊桑公式),总菌数,g为细胞分裂的世代数,一世代,一世代,一世代,一世代,一世代,一世代,一世代,一个细胞分裂世代数计算,细胞分裂次数,1,2,3,4,5,细胞数,2,4,8,16,32,细胞世代数,1,1+2=3,1+2+4=7,1+2+4+8=15,1+2+4+8+16=31,g=2,n,-1(n为细胞分裂次数),3、对于各种药物的抗性突变的发生彼此独立无关,4、抗性突变是稳定性的,5、抗性突变能以一定的频率发生回复突变,6、通过理化因子的处理可以提高突变的频率,四、突变的分子机制,1、化学诱变剂的诱变作用机制,1.1 碱基类似物引起的突变,1.1.1 5BU的诱变作用机制 (图1-3),1.1.2 2AP的诱变作用机制 (图1-4),1.1.3 正反互变作用 (图1-5),1.1.4 环出效应 (图1-6),5-,BU,变构,图1-3,A(a),T(k),5-BrU(k),G(k),5-BrU(e),C(a),mispairing,T(k),A(a),5-BrU(k),G(k),C(e),5-BrU(e),A(a,),G(k),G(k),A(a),Replication error,Incorporation error,5-BrU(k),5-BrU(e),图1-,4,A(氨基式）,A(亚氨基式）,图1-5,G（氨基式）,G(烯醇式兼亚氨基式),G,T,T,C,A,A,A,G,G,T,A,T,T,C,A,A,G,A,T,A,T,T,C,A,A,A,G,G,T,A,T,环出效应 1,图1-6,A,T,T,C,G,G,A,A,A,T,A,T,C,G,A,T,G,A,A,A,T,T,A,T,T,C,G,G,A,A,环出效应 2,1.2、改变DNA的化学结构的诱变剂（和DNA直接起化学反应）,1.2.1 亚硝酸引起的突变,1.2.2 羟胺（NH2OH）的专一诱变作用,1.2.3 烷化剂的诱变作用,1.3 吖啶类的药物引起的移码突变,移码突变：,由于DNA分子中的一对或少数几对核苷酸的,增加或缺失而造成整个DNA分子的碱基顺序发生移动的,基因突变类型。,吖啶类的分子结构特征：,NH2,NH2,N,吖啶橙（2.8-双二甲基氨基吖啶）,N,CH,2,CH,3,N,CH,2,CH,3,吖啶黄（2.8-二氨基，3.7-二甲基吖啶）,NH,2,NH,2,N,CH,3,ICR-191,CL,N,NH,(,CH,2,),3,NH(CH,2,),2,CL,OCH,3,2、物理诱变因素,2.1 紫外线(UV)诱发作用的分子机理,2.2 X射线和r射线,2.3 热所引起的变异,3、生物诱变因素转座遗传因子,3.1 IS因子（,insertion sequence,)插入顺序,a.Tn能以10,-3,10,-8,频率转座，引起插入突变或极性突变；,3.2 转座子又称易位子（,transposon,)Tn,易位子（Tn)的生物学效应：,b.由于Tn往往带有抗性基因，因此，能使受体带上抗性，当,Tn,切除或消除后抗性也会消失；,c.Tn插入会使插入位置上出现受体DNA的少数核苷酸发生重复；,d.转座后原来的位置上仍保留原有的转座子；,e.转座在同一复制子内转座，根据方向可以造成染色体断裂,或是发生染色体畸形；,f.Tn被准确切除后使插入位点基因发生回复突变。T,n,被非准,确切除后，有可能使近旁的染色体发生倒位，缺失等变异。,IS因子,与,Tn,具有的共同特点：,a.都能在同一细胞从一个,基因,位点转移到另一个基因位点，,或从一个复制子上跳到另一个复制子上，当它转移到哪,一个基因内就会引起该基因突变。,b.它们不是一个独立从一个的复制单位（只是一个片段）,所以它们自身不能复制，也不能独立从一个细胞转移到,另一个细胞中去，只能在细胞内进行转移，但它可以借,助载体在细胞间进行转移。,C.在进行转移时，本身没有脱离原来的位置，而是在转移前,首先复制。因此，复制后的转座了一般不因发生转移而丢,失。,3.3 转座噬菌体（,transposon,phage,),是具有转座功能的一类可引起突变的温和噬菌体。这类噬菌体不论是进入裂解还是处于溶源状态，均可整合到寄主染色体上。,Mu噬菌体DNA分子结构示意图,CAB 头部,和尾部基因,寄主DNA,寄主DNA,G,gin mom,A、B基因是转座所必需的，C区对A、B基因有负调节作用，G片段是可倒位的区段,R,IR,IR,tnpA,tnpR,ampR,转座子,Tn3,的基因图,共整合,解离,+,TnpA,TnpR,图 1-8 Tn3的转座过程,当一个细胞带有两个质粒，其中一个带有Tn3（用细线表示复制子，箭头表示Tn3），另一个质粒不带有Tn3(用粗线表示）,一.光复活作用（光修复）,第三节 DNA损伤的修复,是指DNA由u.v(紫外线)引起的损伤，由于可见光的照射而得以恢复为正常结构的现象。,phR 471aa,光复活,-TT-,-AA-,-,TT-,-,-AA-,-TT-,-AA-,-,TT-,-,-AA-,Before replication&Error-free,400,nm Blue light&,phR,gene,(photo-reactivation enzyme),可见光激活,uv,二.切补修复,三.重组修复,（一）提高原有修复酶和重组酶的活性,（二）诱导产生新的DNA多聚酶,1.recA基因以及lexA基因的作用,2.修复机制,四.S,OS修复,倾向错误的,sos,修复,RecA-P;三种功能,DNA 重组活性,与S.S.DNA结合活性,少数蛋白的proteinase活性,当DNA正常复制时,（无复制受阻，无DNA损伤，无TT dimer）,RecA-p不表现proteinase活性,当DNA复制受阻/DNA damaged,能量大量消耗,细胞内原少量表达的RecA-p,与S.S,DNA结合,激活RecA-p的proteinase活性,修复损伤,LexA-p降解,RecA-p高效表达,300 times up,SOS open,当DNA复制度过难关后,SOS repair 是一种error-prone 极强的修复机制,是进化中形成的“竭尽全力，治病救人”的措施,（正常状态下，SOS是关闭的）,RecA-p很快消失,LexA gene on,SOS off,五适应性修复,细胞壁,蛋白质.氨基酸干扰酶活性因素,体内修复系统,分离.生理延迟,诱导剂进入细胞,诱导剂接触细胞质,造成前突变,引起突变,突变表现型的表现,六突变的形成过程,七修复作用和突变诱发的关系,可以分为校正差错和引起差错这两类,1、每一个基因座位都用英文名字的斜体小写的三个字母,表示；,2、产生同一表型的不同基因位点（即一个产物由几个基,因共同决定），在三个小斜体字母后面加上一个大写,的字母表示；,3、一个基因的不同位点突变，在这个突变型基因座位符,号后面写上数目字表示；,4、基因是根据基因突变的表型效应来命名的；,5、质粒命名一般用小写字母P代表质粒（Plasmid)，在P,后面用两个大写字母分别代表发现这一质粒的作者或,是实验室名称，在名称后面加上质粒的编号；,八基因符号的命名规则要点,6、染色体上的缺失可以用,表示，缺失部位在符号的,小括号中如（lac pro)，质粒上缺失部位写在符号,后面的中括号内 ,；,7、质粒上的插入罗马字,表示，相互易位用T（1；6）,表示，非相互易位用T（1,6）表示,；,8、菌株的名称：有些菌株带有多个突变基因，为了便于,管理和书写方便，往往用简单的序列表示，不同实验,采用不同的英文大写字母表示：如FD1004是复旦大学,的代号。,一个菌株在第一次论文中出现时应详细描述其,基因型及有关表型。基因型符号写出时，一般顺序,是先写营养方面的缺陷型，然后写糖发酵标记，抗,性标记，最后写象质粒一类的附加体以及在细菌中,的状态。,2.营养缺陷型筛选的过程,第四节 突变型筛选,一、营养缺陷型的筛选,1.营养缺陷型：,在营养的合成上，若某个菌株丧失了合成某营养物质（氨基酸、碱基、维生素等）能力，从而表现出营养上的缺陷，这种突变型菌株在基本培养基上不能生长，只有在完全培养基或基本培养基中加入该菌株所缺陷的物质才能生长，这种突变型菌株称营养缺陷型,2.1诱发,野生型霉菌或放线菌的孢子能在基本培养基中萌发并长成菌丝，缺陷型的孢子则一般不能萌发，或虽能萌发却不能长成菌丝。所以把经诱变剂处理的孢子悬浮在基本培养液中，振荡培养液若干小时后滤去菌丝，缺陷型孢子便得以浓缩。,b.饥饿法,a.菌丝过滤法,微生物的某些缺陷型菌株在基些培养条件下会死亡，可是如果在某一细胞中发生了另一营养缺陷型的突变，这一细胞反而避免死亡，从而可被浓缩。,2.2淘汰野生型,d.差别杀菌法,c.青霉素法,青霉素只能杀死能生长繁殖的细菌，可不能杀死停止分裂的细菌。在只能使野生型生长而不能使营养缺陷型生长的基本培养基中，野生型被杀死而缺陷型则不被杀死，从而使,营养缺陷型得于浓缩。,细菌的芽孢远较营养体耐热。使经诱变剂处理的细菌的细胞形成芽孢。把芽孢在基本培养基液中培养一段时间，然后加热杀死营养体。由于野生型芽孢能萌发所以被杀死，缺陷型不能萌发所以不被杀死而得到浓缩。,2.3 营养缺陷型的检出,a.夹层法,b.限量补充法,先在培养皿上倒上一层不含细菌的基本培养基，待冷凝以后加上一层含菌的的基本培养基，冷凝以后再加上一层不含菌的培养基。经培养出现菌落以后在培养皿底上把菌落做上标记，然后加上一层完全培养基，再经培养以后出现的菌落多数是营养缺陷型。,将经诱变剂处理的细菌接种在含有微量补充养料（例如0.01%蛋白胨）的基本培养基上。野生型迅速长成为较大的菌落，缺陷型则较慢长成较小的菌落。如果只需要某一种缺陷型，可以在基本培养基中加入微量的单一氨基酸、碱基等物质。所补充的量，最好先用已有的缺陷型进行测定。,d.点样法,c.影印法,将经处理的细菌涂在完全培养基的表面，待出现菌落以后，用灭菌丝绒将菌落影印接种在基本培养基表面。待菌落出现以后比较两个培养皿，凡在完全培养基上出现的菌落而在基本培养基同一个位置上不出现菌落者，这一菌落初步断定是一个缺陷型。,把经过浓缩缺陷型的菌落接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一个菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能生长的菌落是营养缺陷型。,图 鉴定营养缺陷型的生长谱法,2.4营养缺陷型的鉴定,二胸腺嘧啶缺陷型的筛选,（,T,+,）,（,T,-,）,U,V,（,T,-,）,42,（,T,-,）,30,A（T,+,）,42,B,某一氨基酸活化酶的温度敏感突变型的筛选,（,T-,）：基本培养基 （,T+,）基本培养基,+,胸腺嘧啶,三利用胸腺嘧啶缺陷型筛选某氨基酸活化酶的温度敏感突变型,四一些特殊类型的突变型的筛选,（一）抗性突变型的筛选,1.梯度培养皿,（二）温度敏感突变型的筛选,2.药物临界致死浓度,临界致死浓度：,能完全抑制微生物生长的最低药物浓度,3.滤纸片法,（三）发酵突变型的筛选,半乳糖代谢过程,半乳糖,+,ATP,galK,半乳糖,-1-,磷酸,尿苷二磷酸半乳糖,galT,galE,尿苷二磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖,五利用鉴别性培养方法筛选突变,1.低毒力霍乱弧菌的筛选,2.乳糖发酵突变型的筛选,