微生物基因工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,参考资料,吴乃虎,基因工程原理,（上下），科学出版社，2002,陈守文 喻子牛,生物生物技术-应用微生物学基础原理，科学出版社 2002年1月,张惠展,基因工程概论，华东理工大学出版社,童海宝,生物化工，化学工业出版社，2008年第2版,1 概述,1.1 发展概况,1.2 微生物与基因工程的关系,1.3 研究的主要内容,1.4 发展前景,微生物学,在分子、细胞或群体水平上研究各类微小生物,单细胞藻类,细菌,放线菌,真菌,病毒,立克次氏体支原体,衣原体,螺旋体原生动物,形态结构、生长繁殖、生理代谢、遗传变异、生态分布、分类进化等生命活动的基本规律,应用于工业发酵、医学卫生和生物工程,对象,内容,目的,他的学生陆续发现白喉，肺炎、破伤风、鼠疫等的病原细；,德国微生物学家科赫,对新兴的医学微生物学作出了巨大贡献,首先论证炭疽杆菌是炭疽病的病原菌,接着又发现结核病和霍乱病原细菌，并提倡采用消毒和杀菌方法，防止这些疾病的传播；,首创细菌染色法，以琼脂作凝固培养基培养细菌和分离单苗落，获得纯培养操作过程；,规定了鉴定病原细菌的方法和步骤，提出著名的科赫法则。,一种病原微生物必然存在於患病动物体内,但不应出现在健康动物内；,此病原微生物可从患病动物分离得到纯培养物；,将分离出的纯培养物人工接种敏感动物时，必定出现该疾病所特有的症状；,从人工接种的动物可以再次分离出性状与原有病原微生物相同的纯培养物。,-1860年，英国外科医生利斯特应用药物杀菌，并创立了无菌的外科手术操作方法。,1901,年，著名细菌学家和动物学家梅契尼科夫发现白细胞吞噬细菌的作用，对免疫学的发展作出了贡献。,1892,年，俄国植物生理学家伊万诺夫斯基发现烟草花叶病原体是比细菌还小的、能通过细菌过滤器的，光学显微镜不能窥测的生物，称之为过滤性病毒。,俄国出生的法国微生物学家维诺格拉茨基于,1887,年发现硫磺细菌，,1890,年发现硝化细菌，他论证了土壤中硫化作用和硝化作用的微生物学过程以及这些细菌的化能营养特性；,1915,1917,年，特沃特和埃雷尔观察细菌苗落上出现噬菌斑以及培养液中的溶菌现象，发现了细菌病毒,噬菌体。病毒的发现使人们对生物的概念从细胞形态扩大到了非细胞形态。,生物化学阶段,1897,年德国学者,E,毕希纳发现酵母菌无细胞提取液与酵母一样具有发酵糖液产生乙醇的作用，将微生物生命活动与酶化学结合起来；,G,诺伊贝格等人对酵母菌生理和对酒精发酵中间产物进行了分析；,A,J,克勒伊沃对微生物代谢进行研究，开拓比较生物化学的研究方向；,20,世纪,30,年代起，人们利用微生物进行乙醇、丙酮、丁醇、甘油、各种有机酸、氨基酸、蛋白质、油脂等的工业化生产。,1929,年，,A,弗莱明发现点青霉菌能抑制葡萄球菌的生长，揭示了微生物间的拮抗关系并发现了青霉素。,1949,年，,S,A,瓦克斯曼研究土壤微生物，发现了链霉素。此后陆续发现的新抗生素,抗生素除医用外，也应用于防治动植物的病害和食品保藏.,分子生物学阶段,1941,年，比德尔和塔特姆用,X,射线和紫外线照射链孢霉，使其产生变异，获得营养缺陷型，为分子遗传学打下了基础。,1944,年，埃弗里第一次证实了引起肺炎球菌形成荚膜遗传性状转化的物质是脱氧核糖核酸,(DNA),。,1953,年，沃森和克里克提出了,DNA,分子的双螺旋结构模型和核酸半保留复制学说。,近年来，原核微生物基因重组的研究不断获得进展，现,代微生物学的研究将继续向分子水平深入，向生产的深度和广度发展,1957,年，科恩伯格等成功地进行了,DNA,的体外组合和操纵。,富兰克尔,-,康拉特等通过烟草花叶病毒重组试验，证明核糖核酸,(RNA),是遗传信息的载体，为奠定分子生物学基础起了重要作用。随后相继发现转运核糖核酸,(tRNA),的作用机制、基因三联密码、病毒的细微结构和感染增殖过程、生物固氮机制等微生物学中的重要理论。,微生物作用,在自然界物质循环中作用,空气与水净化，污水处理,工农业生产：菌体，代谢产物，代谢活动,对生命科学的贡献,1.2 微生物与基因工程,基因工程的基本过程：,目的基因的获得,重组载体的构建,重组载体导入宿主细胞,阳性重组子的筛选,基因的测序和鉴定,基因的控制表达。,微生物参与基因工程的每个环节,微生物的多样性提供基因来源；,基因工程的克隆载体由病毒、噬菌体和细菌质粒DNA改建而成；,基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得；,原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母是基因工程中最重要、最广泛应用的克隆载体宿主。,动植物基因工程穿梭载体构建在大肠杆菌中完成外源基因或重组体DNA的拼接和改造。,大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是采用重组细胞通过微生物发酵罐的方式大量生产目的蛋白。,基因工程推动了微生物学的发展,基因工程应用于基因工程药物、基因治疗、改造传统工业发酵菌种、动植物基因工程改良及环境保护中各个方面，促进微生物学的发展,应用于新的微生物资源的开发，认识和了解微生物世界中更多的微生物种类、微生物代谢、微生物遗传等将产生积极的影响。,研究的主要内容,微生物基因的应用前景,基因工程与医药卫生,基因工程与农牧业、食品工业,基因工程与环境保护,微生物基因工程与医药卫生,基因工程药品的生产,微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。,如基因工程胰岛素、基因工程干扰素、人造血液,/,白细胞介素、乙肝疫苗。,“DNA,探针”快速检测肝炎病毒,给遗传病患者导入正常基因。,基因诊断与基因治疗,基因工程与农牧业、食品工业,培育新特动植物品种，如生长快，耐逆境、肉质好的转基因鱼（中国），乳汁中含有人生长激素的转基因牛（阿根廷），抗青枯病甜椒、转鱼基因抗寒番茄等。,基因工程与环境保护,DNA探针查测环境中的病毒和细菌污染；,基因工程,“,超级细菌,”,分解和吞食环境有害物质,。,2,微生物的遗传物质,2.1.证明遗传物质是DNA(有时是RNA)的三个经典实验,2.2 DNA的结构和复制,2.3.原核生物的染色体和复制,2.4.真核生物的染色体和复制,2.5.基因结构和基因组,2.1证实遗传物质是DNA的经典实验,2.1.1细菌的转化,2.1.2噬菌体感染实验,2.1.3病毒重建实验,Figure 2.1.1,转化的本质是,DNA.,2.1.1 DNA,是遗传物质,细菌转化实验：,在转化作用中参入到接受体细菌细胞,的那段提纯的,DNA,。,首先在肺炎球菌,（,pneumococcustype,）的转化作用中,被发现，亦称,transforming factor,。,Figure 2.1.2 The genetic material of phage T2 is DNA,.,2.1.2 DNA is the genetic material,病毒噬菌体,T2,能够感染大肠杆菌。当把噬菌体微粒加入大肠杆菌中后，它们吸附在大肠杆菌的表面，把其体内的部分物质注入到大肠杆菌内部，大约,20,分钟后大肠杆菌就会破裂，释放出大量的子代噬菌体的颗粒,Figurer right:Eukaryotic cells can acquire a new phenotype as the result of transfection by added DNA.,1.2 DNA is the genetic material,当,DNA,加入到某种在培养基中培养的真核单细胞生物群落中，核酸就会进入到细胞中去，其中有一部分就会合成出一些新的蛋白质。右图表示的就是一个标准实验,。,2.2 DNA的结构和复制,DNA,的结构,DNA,双螺旋结构,多核苷酸链反向平行排列,RNA结构,RNA种类,原核生物,与,真核细胞的染色体,原核原核,真核细胞,DNA的复制,真核生物,DNA,复制,原核生物,DNA,复制,DNA复制的过程,复制的引发,DNA链的延伸,DNA复制的终止,包括,DNA,复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成,RNA,分子，,RNA,引物的合成，,DNA,聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物,RNA,的,3-OH,末端复制引发的关键步骤就是前导链,DNA,的合成,D,NA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶的作用。当冈崎,片段形成后，DNA聚合酶通过其53外切酶活性切除,冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为,引物由53合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶,将其接起来，形成完整的DNA滞后链。,在DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复,终止位点处终止不一定等全部DNA合成完毕。目前对,制终止位点的结构和功能了解少,DNA,复制,2.,4,基因结构和基因组,+*-,基因(gene),合成有功能的,蛋白质多肽链,或,RNA,所必需的全部核苷酸序列。,一般是,DNA序列,（或,RNA病毒中的RNA,）。,具有编码一定生物功能分子的核苷酸序列,2.,4,.1,基因,与,基因结构,一个典型的真核基因,包括：,编码序列：外显子(exon),插入外显子之间的非编码序列,-,内合子,(intron),5-端和3-端非翻译区(UTR),调控序列(可位于上述三种序列中),2.,4,.2基因组,(genome),是指一种生物体中的整套(单倍体)遗传信息，,如,一个受精卵或一个体细胞的细胞核中所有DNA分子的总和。,基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。,每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值(C-Value)。,原核生物基因组,细菌染色体基因组：通常仅由一条环状双链DNA分子组成,1细菌DNA大部分为编码序列。,2结构基因中没有内含子，也无重叠现象。,3具有操纵子结构。,质粒：,某些细菌中独立于染色体外的能自主复制的共价环状双链DNA。,细菌基因组的特点,原核生物基因组,1,每种病毒核酸只有一种，或者DNA，或者RNA；,2病毒核酸大小差别很大，3 kb300kb；,3大部分病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成,4具有操纵子的结构，具有重叠基因的结构,5真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子,6除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。,病毒基因组的特点,大肠杆菌基因组,基因组约4.6M bp,不同菌株的基因组大小有细微的差别。,基因组中，绝大多数基因都以操纵子（operon）方式组合成表达单位。总共有600个操纵子，每个含2个或更多的顺反子。,操纵子含有一组彼此邻接的结构基因，基因间隔仅1至2个核苷酸。乳糖操纵子（lactose operon）是大肠杆菌中最具代表的例子之一，它含有3个涉及乳糖分解的基因。,乳糖不是大肠杆菌生存环境中通常遇到的营养成分，只有在乳糖作为唯一碳源时，乳糖操纵子才打开。,大肠杆菌基因密码子的使用频率和真核基因中密码子的使用频率不同。如外源真核基因富含大肠杆菌罕用密码子，则很难在大肠杆菌细胞中得到有效表达。,有两种策略可使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：,（1）更换同义密码子法。,（2）外源基因和相关tRNA同步克隆法,X174噬菌体的基因组,是以大肠杆菌为宿主的噬菌体,直径约为250nm的正20面体构造。,基因组(Genome)由约5,400个核苷酸组成的单链环状的DNA;从遗传学分析来看有9个基因,按-A-B-C-D-E-J-F-G-H-的顺序存在。,F是与构成噬菌体外壳的蛋白质相对应的基因。,H和J是分别与构成穗子(,Spike,)和穗子尖(,spike tip,)蛋白质相对应的基因。J还被认为是噬菌体的结构蛋白质的基因。由于感染而进入宿主细胞的噬菌体DNA以双链结构的形式复制,而此时作为基因A的产物的蛋白质,真核生物基因组,1.体细胞内的基因组为二倍体。,2.基因组远远大于原核生物的基因组，具有多复制起点。,3.基因组中不编码的区域多于编码区域。,4.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的（断裂基因）。,5.真核细胞基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。,6.单一序列为主，存在大量重复序列。,真核生物基因组的特点,真核生物基因组,(一),高度,重复序列(重复次数1O,6,),约占10-60，在人基因组中约占20,真核基因组中,DNA,序列的分类,(,二,),中度,重复序列,(,重复次数,1O,2,1O,5,),(,三,),单拷贝,序列,(Unique Sequence),1.,卫星,DNA(Satellite DNA),2.,反相重复,DNA,：,回文结构：,GGTACC,/,CCATGG,常见于基因的调控区和特异蛋白结合区。,重复单位序列相似，但不完全一样，,散在分布于基因组中,序列的长度和拷贝数非常不均一，,中度重复序列一般具有种属特异性，可作为,DNA,标记,中度重复序列可能是转座元件。,大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列。,Types of repeat,卫星DNA(Satellite DNA),三、基因家族(gene family),一,组功能相似、核苷酸序列具有同源性的基因,可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。,基因家族的特点：,基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(,gene cluster,)或串联重复基因，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；,有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；,有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因(,Pseudogene,)a1表示与a1相似的假基因,基因家族分类,编码RNA的:,rRNA、tRNA、snRNA,等；,编码蛋白质的,:,组蛋白基因,珠蛋白基因,生长激素,rRNA 基因,l00copy,rRNA基因簇(重复单元,18S-5.8S-28S RNA）,珠蛋白基因,超基因家族,(Supergene family),由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，,但功能不同,免疫球蛋白超基因家族,丝氨酸蛋白酶族,ras超基因家族,真核生物基因组与原核生物基因组的主要区别：,3,微生物遗传与基因工程,3.1 质粒和转座因子,3.2 基因突变及修复,3.3 细菌基因转移和重组,3.1 质粒和转座因子,质粒（plasmid）：,为多数细菌和某些真核细胞染色体外的环状双链DNA分子。其特点是能在宿主细胞内独立复制，带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状。但质粒并不是它的宿主细胞所必需的。,转座子,(transposons,),：在原核生物与真核生物基因组中存在着可从一个染色体位点转移到另一位点的一些,DNA,序列。转座子是基因组突变的主要因素之一。,质粒的分子结构,双链环状,DNA,分子，大约,1-200 Kb,。具有自主复制和转录能力，不能独立存活，在子细胞中保持恒定的拷贝并表达其遗传信息,。,质粒的遗传学类型,为耐药性质粒，由抗性转移因子DNA和决定抗性因子DNA两部分,成,。,后者含有对抗生素的抗性基因，使宿主细菌产生对抗生素的抗性。,F 质粒：,R 质粒：,col 质粒：,噬粒phagemid,为性质粒，是一个小的超螺旋闭环DNA（约95kb）。可将宿主染色体基因转移至另一宿主基因组中，其本身转移到缺乏F质粒的细胞。,含有合成大肠杆菌素基因的质粒，能杀死不含大肠杆菌素的亲缘细菌,或称质粒噬菌体。,能把完整的质粒引入某种噬菌体DNA成为一种嵌合体。,嵌合体DNA的遗传学行为取决于某一复制子的强弱。,表现噬菌体行为称质粒噬菌体；,表现质粒的行为称噬菌体质粒,质粒,DNA,的特性,质粒的复制,依赖细菌染色体的多种酶系统。,质粒在细胞内的复制分两种类型：,严紧型质粒的复制：,只在细胞周期的一定阶段进行复制，与细菌的繁殖密切相关。需要蛋白质合成和,DNA pol,的存在。,每个细胞只有,1,5,个拷贝。,质粒复制方式：,均为半保留复制，并在复制周期内保持环状结构。,质粒复制形式多样，包括：,单向复制、双向复制、单向与双向并存。,松弛型质粒的复制：,在整个细胞周期中随时都可进行复制。需用,DNA pol,的存在。在细胞内有,10,200,个以上,甚至多达数千个,基因突变与修复,基因的核苷酸顺序或数目发生改变。仅涉及,DNA分子中,单个碱基的改变称点突变（,point mutation）,。,涉及多个,碱基的还有缺失、重复和插入。,具有突变表型的细胞或个体。,突变体,mutant,基因突变,gene mutation,从对遗传信息的改变可分为,:,基因突变类型,同义突变,无义突变,错义突变,碱基序列的改变没有引起产物氨基酸序列的改变,与密码子的简并性有关,。,某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变成了终止密码子，使蛋白质合成提前终止，因而蛋白质产物一般是没有活性的。,碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变。,包括：,致死突变,，即,错义突变严重影响蛋白质活性甚至完全无活性，从而影响了表现型。,渗漏突变,：,突变的产物仍有部分活性，使表型介于野生型与突变型之间的中间类型。,中性突变,：,突变不影响或基本上不影响蛋白质的活性，不表现明显的性状变化，称为。,按其发生的原因,:,1),自发突变（,spontaneous mutation,）,：在自然情况下发生的突变。,2),诱发突变（,induced mutation,）,：人们有意识地利用物理、化学诱变因素引起的突变。,随机性：,可发生在体细胞和生殖细胞中。生殖细胞,的突变频率高于体细胞。体细胞突变在显性或纯合状,态才能表现，出现嵌合体。,稀有性：,突变率很低。高等动植物,10,-5,10,-8,，细菌,10,-4,10,-10,，反应了物种的基因的相对稳定性。,（,3,）突变的性质,可逆性,1),野生型基因 。,2),回复突变率一般低于正突变率。,3),真正的回复突变很少发生。常被第二个位点的突变所抑制，抑制因子突变（,suppressor mutation,）。,4),回复突变的有无是区别基因突变与染色体缺失或重复的标志。,正突变,回复突变,突变型,突变的多方向性和复等位基因,：,同一基因可突变为多个等位基因。突变的基因可以再突变。这一系列的等位基因就叫做复等位基因。这是由于同一座位内的不同点上的结构发生变化产生的。,突变的有害性和有利性：,一般有害突变多，有利突变少,如,.5-BU,是胸腺嘧啶(,T),的结构类似物，酮式结构易与,A,配对；烯醇式结构易与,G,配对。,碱基类似物,点突变的诱变机制,A.TA.,5-BU,（酮式）,G.5-BU,（烯醇式）,G.C,A.,5-BU,G.CA.T,2-AP,是腺嘌呤的类似物，既可与,T,配对，也可与,C,配对。,A.T 2-AP.T2-AP.CG.C,G.C2-AP.C 2-AP.T A.T,（,1,）烷化剂:甲磺酸乙酯(,EMS)、,亚硝基胍(,NG),等。通过改变碱基结构使碱基错配。当,G,烷基化后可与,T,配对，导致碱基转换。,G.CA.T,。,或烷化剂使嘌呤脱落，造成转换、颠换；,DNA,链的断裂或交联。,碱基改变,（,2,）嵌入剂：,如：,吖啶橙、吖啶黄素、原黄素等碱基对的类似物，易造成移码突变。,（,1,）紫外线,：产生环丁烷嘧啶二聚体和,6-4,光产物。,双链间形成，阻碍,DNA,的复制。,同一链上相邻,T,间形成，阻碍碱基的正常配对和,腺嘌呤的正常掺入，使复制在这个点上停止或错,误进行，产生碱基顺序改变了的新链。,碱基损伤,（,2,）黄曲霉,(B1),的作用,：使鸟嘌呤,G,脱落，,SOS,修复引入,A,造成,G.C,A.T,。,基因的定点突变,1,）寡核苷酸诱导的基因定点突变,：将某基因克隆到载体上人工合成含有突变位点的一对引物（突变位点位于引物中心附近，两端有足够的序列足以互补配对）,PCR,扩增,Dpn,酶切将突变,DNA,转入受体筛选重组子。,2,）双引物法：,将某基因克隆到载体上人工合成一对互补的含有突变碱基的引物,在基因的上游和下游各设计一个引物，分别与突变位置处的一个引物进行,PCR,扩增,两个,PCR,产物混合,延伸后就可获得有特定位点突变的基因。,自发突变的机制,1 DNA,复制错误(,errors of DNA replication),a,转换,b,颠换,A,T,G,C,C,移码突变：,增加或减少一个或几个碱基对的突变，引起密码编组的移动。如：,Hb Wayne,是,138,位,UCC,失去一个,C,，使,链的合成不在原来应该终止的地方停止，一直到,146,位合成精氨酸后才终止，从而使,链延长。,d,缺失和重复突变,e,插入突变,（转座子）,自发损伤,a,脱嘌呤,：碱基和脱氧核糖间的糖苷键受到破坏，从而引起一个鸟嘌呤或腺嘌呤从,DNA,分子上脱落下来。,b,脱氨基,：如胞嘧啶脱氨基后变成尿嘧啶。,U=A,结果,G-CA-T,。,3,氧化损伤：,O,2,-,，,OH,-,，,H,2,O,2,可对,DNA,造成损伤。,如：,8-oxo dG,与,A,配对，导致,G,.C,dG,.A,T.A,动态突变,在基因的编码区、,3,或,5,-UTR,、启动子区、内含子区出现的三核苷酸重复，及其他长短不等的小卫星、微卫星序列的重复拷贝数，在减数分裂或体细胞有丝分裂过程中发生扩增而造成遗传物质的不稳定。亦称为基因组的不稳定性，可造成基因功能丧失或获得异常改变的产物。,DNA,损伤修复机制,光复活,(photoreactivation),（原核）：,可见光存在的,条件下，在光复活酶作用下将,UV,引起嘧啶二聚体,分解为,单体的过程。,其过程包括：,光复活酶与,T=T,结合形成复合物;,复合物吸收可见光切断,T=T,之间的,C-C,共价键,使二体,变成单体;,光复活酶从,DNA,链解离。,切除修复（核苷酸外切修复、暗修复）,切除修复：在,DNA,内切酶、,DNA,聚合酶、外切酶、,DNA,连接酶等共同作用下，将,DNA,受损部位部分切除，并以其中一条链为模板，合成修复。消除由,UV,引起的损伤,，也能消除由,电离辐射和化学诱变剂引起的其他损伤,。切除的片段可由几十到上万,bp,，,分别称短补丁修复、长补丁修复。,（,2,）,DNA,糖苷酶修复及,AP,核酸酶修复途径,E.coli,不明显的损伤,需要特异性修复。,DNA,糖苷酶修复：如果碱基被共价修饰，糖基化酶可作用于,C-N,糖苷键，使碱基释放，产生无碱基(,AP),位点,再由,AP,内切酶修复系统修复。,AP,内切酶修复系统修复：由内切酶、外切酶、聚合酶和连接酶活性来完成，以修复,AP,位点。,错配修复系统,修复杂种,DNA,错配碱基及基因转变。,重组修复,(1)复制：,以损伤单链为模板复制时，越过损伤部位，对应位点留下缺口；未损伤单链复制成完整双链。,(2)重组：,缺口单链与完整同源单链重组，缺口转移到完整链，使损伤单链的互补链完整，损伤单链仍然保留。,(3)再合成：,转移后的缺口以新的互补链为模板聚合补齐。,SOS,修复,a,通过式修复,：损伤较大时(如产生很多的,T=T)，,正常的,DNA,多聚酶复制到损伤位点时，其活性受到抑制，短暂抑制后产生一种新的,DNA,多聚酶，由于其修复校正功能较低，新合成的,DNA,碱基错配频率较高，易引起突变。,b,切除式修复,：,DNA,双链均有损伤且距离较近时的一种可能的修复机制。,基因突变的检测,病毒和细菌基因突变的检测,利用寄主范围、生长速度、噬菌斑大小、形态等性状可检测病毒突变。,通过在培养基中添加抗生素或噬菌体即可筛选细菌抗性突变体。,细菌营养缺陷型的检测：利用在完全培养基上能正常生长，在基本培养基上不能生长的影印培养实验。首先采用青霉素富集法浓缩大量突变体，再进行负选择。,真菌营养缺陷型的检出菌丝过滤法,分生孢子诱变处理基本培养基,未萌发孢子萌发菌丝,培养去除,(,过滤,),少数 死亡营养,野生型 孢子缺陷型,(,去除,),营养培养基,Muller-5,法,Muller-5,品系:,B(,棒眼)-,W,a,(,杏眼)-,sc(,小盾片少刚),并具重复倒位。,“,并连,X,染色体,”,法,（2）常染色体突变,平衡致死系(,Cy,和,S),13-17,诱变剂与致癌物质,Ames试验,BNAmes1975年建立并不断发展完善沙门氏菌回复突变试验-称之为Ames试验，已被世界各国广为采用，检测污染物的遗传毒性效应。,特点：,快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。,应用,：1）检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；,2）检测水源水和饮用水的致突变性探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；,3）检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；,诱变剂与致癌物质,Ames试验,4）检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；,5）检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；,6）研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；,7）检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；,8）筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等。,AMES,检测试验原理,鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷,型（his）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。,细菌基因转移和重组,基因重组：,是指一个基因的DNA序列是由两个或两个以上的亲本DNA组合起来的。基因重组是遗传的基本现象,。,细菌基因转移和重组的方式有转化、接合、转导、溶原性转换和原生质体融合,细菌的转导,当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction),细菌的接合作用,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA 就可从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌)，这种类型的DNA转移称为接合作用(conjugation)。,细菌的遗传转化,转化作用(transformation)通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。,基因定位和基因组测序,基因定位方法：,质量性状基因定位,数量性状基因定位,真核生物的基因定位,1）确定基因所在的染色体,2）确定基因的距离和位置,真核生物的基因定位,1）单体定位法,2)三体定位法,原理：三体杂交后代的非3：1比值,3)体细胞杂交法 原理：某种酶与染色体的线性关系,4）克隆基因定位法,5)缺失法：,根据某一性状与染色体的结构变化确定；,6)性状与性别联系法：,性状与性别紧密相连,说明基因在性染色体上,7）基因剂量效应法,:有的基因多一份就会多表达一份,8)染色体原位杂交法,9）连锁不平衡分析定位：,相互连锁的性状同时出现的概率高,确定基因所在的染色体,原核生物的基因定位,相互连锁的基因共同转化的可能性远远大于两个不连锁的,基因,。,首先判断两个基因是否连锁。因为两个不连锁的基,因也会发生共同转化。,方法1：降低DNA浓度，基因,AB,同时转化频率与单独转化,频率相等，说明连锁。若不连锁，则,AB,同时下降比例远,远大于单个基因转化时频率,1）,中断杂交法,2）交换重组法,3）转化作图法,基因单方向转移，离原点越近的基因转 移的越早，两个基因相离越远，转移时二者相隔的时间就越长,两个基因相隔越远，交换的可能性就越 大，产生的相应重组子就越多,限制性酶在基因组DNA上有固定的切点，可以把基,因组切成不同长度的片段，根据这些片段确每一个,切点的位置，即可得到该基因组的物理图谱,4）转导法,：,5）共转导法,6）缺失定位法,7）转录定位,8）标记获救法,9）,限制酶作图法,两个基因越远，发生单个转导的频率越高；,位置越近的基因越容易被共同包装，发生共转导的机会越多,根据所测基因在某一已知染色体区段中是否存在来定位,根据基因在转录过程中的行为、出现的早晚进行定位,结合物理图谱，确定基因在某一已知物理图谱位置的片断上,真核生物基因重组,噬菌体基因重组,发生时期 减分某一阶段 感染后任何阶段,交换次数 一次 可以多次,相互重组子 数目相等 不一定相等,DNA,数目,4,个,2,个,噬菌体的基因定位,噬菌体基因重组的特征,与真核生物一样,重组时以线形存在，有相反重组子出现,单交换、双交换都有意义,噬菌体基因重组与真核生物基因重组的区别,衰退：,菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的,存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标,记的丢失等现象，称为菌种的衰退。,衰退的原因：,基因突变,分离现象,菌种保藏,菌种的衰退与复壮的,菌落和细胞形态的改变；,生长速度缓慢，产孢子越来越少；,抵抗力、抗不良环境能力减弱等。,代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；,常见的衰退现象,广义的复壮,：,是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种,菌种的复壮,使衰退的菌种恢复原来优良性状,狭义的复壮,：,是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；,纯种分离：,平板划线法、涂布法、倾,注法、单细胞挑取法等；,寄主体内生长进行复壮,：,如,Bacillus thuringiensis,的复壮；,淘汰已衰退的个体,:,采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）,.,采用有效的菌种保藏方法,。,菌种的复壮措施,控制传代次数,:,在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10,-4,，自,发突变的频率为10,-8,10,-9,，采用良好的菌种保藏方法，可以减少,移种和传代的数）；,选择合适的培养条件,:,采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微,生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；,采用有效的菌种保藏方法,。,防止菌种衰退的方法：,二、菌种保藏,目的,存活，不丢失，不污染；防止优良性状丧失；随时为生产、科研提供优良菌种,原理,选用优良的纯种，最好是休眠体,(,如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件,(,要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）,方法,低温,保藏,法,菌种管置4冰箱保藏，定时传代。原理：低温下，微生物代谢强度明显下降,石蜡油低温,保藏,法,橡皮塞取代棉塞、加石蜡油,干燥保藏法,将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏,如砂土管法,.,适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年,真空冷冻干燥法,加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。,液氮超低温保藏法,将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196）。,适用于各种微生物的较理想的保藏方法。,滴入小试管（在放入大试管干燥器中）,藏在玻璃管内 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法（,L-,干燥法）,冷冻真空干燥法,细粒状载体（土壤、沙粒、土壤,+,沙粒）,球块状载体（硅胶、瓷球）,合适的载体 有机基质（曲料、麦粒）,滤纸片,薄片状载体 明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成）,血清蛋白小片（,乙烯薄膜,）,干法保藏菌种的方法,几种常用菌种保藏方法的比较,4,微生物基因表达调控与基因工程,4.1 微生物学与基因工程的关系,4.2 微生物与基因工程工具酶,4.3 微生物与克隆载体,4.4 微生物作为克隆载体的宿主,4.5 基因工程的常用技术和方法,4.1,微生物学与基因工程的关系,基因工程离不开微生物的参与：,-微生物的多样性提供基因来源；,-基因工程的克隆载体由病毒、噬菌体和细菌质粒DNA改建而成；,-基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得；,-原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母是基因工程中最重要、最广泛应用的克隆载体宿主。,-动植物基因工程穿梭载体构建在大肠杆菌中完成外源基因或重组体DNA的拼接和改造。,-大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是采用重组细胞通过微生物发酵罐的方式大量生产目的蛋白。,基因工程也推动了微生物学的发展,对于新的微生物资源的开发，认识和了解微生物世界中更多的,微生物种类、微生物代谢、微生物遗传等将产生积极的影响。,微生物与基因工程工具酶,基因工程的操作,，依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。这些酶称之为,“,工具酶,”,。,工具酶是对野生菌株,（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品,.,基因工程工具酶,限制性内切酶,-,在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。降解不同源DNA，而不降解同源DNA。,甲基化酶：,亦称修饰酶(modification enzyme)，修饰限制酶识列，在该序列位点的胞嘧啶（C）5-氨基上加一个甲制性内切酶识别而免于切割。,DNA连接酶：,能够催化DNA中相邻的3,-羟基和5,-磷酸基末端之间形成3，5-磷酸二酯键,.,DNA聚合酶,RNA聚合酶,磷酸激酶和磷酸酶,:,核酸酶,核酶,限制性核酸内切酶的分类,限制性核酸内切酶的类型,限制性核酸内切酶的命名,Escherichia,Coli,Ry13,EcoR I,属名,种名,株系,编号,若种名头,2,个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。,限制性核酸内切酶的活性单位,50L Buffer中，含1g底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1g DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。,buffer（pH=8.0）：,50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl,2,1mmol/L DTT或巯基乙醇 100g BSA/ml,（DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白),限制性核酸内切酶的识别序列,绝大多数的型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，这些识别序列又叫核酸内切酶切割位点或靶序列。识别序列有连续的,(,如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构,。,A B C C B A,A B C C B A,A B N B A,A B N B A,或,或,A B B A,A B B A,不同核酸内切酶的特异识别位点,Pst,：,5 C T G C A G3,3 G A C G T C.5,EcoR,：,5 G A A T T C 3,3 C T T A A G 5,限制性核酸内切酶的应用,重组DNA前的切割,构建新质粒,构建物理图谱,DNA分子杂交,用限制性内切酶消化受体DNA,制备DNA探针,亚克隆以用作序列分析,基因定位，DNA,同源性研究,甲基化酶分两类,维持性甲基化酶,：用于在新合成的DNA链上进行甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。,构建性甲基化酶,：用于在非甲基化的DNA链上进行甲基化的酶。,封闭DNA链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。,构建新的酶切位点,用甲基化酶进行甲基化的作用,DNA聚合酶分类,DNA聚合酶在,DNA复制,时起关键作用。,DNA,聚合酶主要有三类：,聚合酶,（pol）：参与DNA修复，是基因工程中的常用酶,聚合酶(pol),聚合酶(pol)：聚合酶参,与DNA复制,RNA 聚合酶（RNA