分子生物学8第八章-基因表达调控.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节,基因表达调控的概述（空间密码）,第二节 乳糖操纵元（Lac Operon）,第三节 Trp Operon及弱化作用机理,第四节 基因转录的时序调控,第五节 Prok.翻译水平的调控,第六节 DNA序列重排对基因转录的调控,第七节 Euk.基因表达调控的特异性,第一节,基因表达调控的概述,基因表达调控(gene regulation or gene control):,任何影响基因转录过程和翻译过程的开启、关闭和这两个过程速率的较为直接的因素及其作用,涉及：,RNA转录的开/关，数量，选择性加工,蛋白质翻译速率，数量，加工与 降解和分泌,原核生物对环境的适应，相关的应答,真核生物的细胞分化,组织特化,个体发育,以及环境对个体表型的影响都是基因表达的结果,内在信息 内,外,(,信号分子,),结合信息,ORF only Helix,Nt,seq,.,遗传信息存在于模版链 三维空间结构,/DNA,序列,的一级结构上,(IR,Box,paracodon,),三联体密码 空间，调控密码,(,钥匙与锁,),简并 简并,摇摆,同工受体,cis 1 trans 2 cis 2,trans 1 cis 1,trans 3 cis 3,I 类 II类,表达,specifical binding,aa base,DNA RNA protein,遗传信息表达的方式（Euk.）,组成型表达（,constitutive expression,）,Housekeeping gene,诱导型表达,（,inducible expression by signaling molecular,）,Luxury gene,顺、反因子间互作方式的基因表达调控,顺式作用元件（cis-acting element）:,能够影响同一条或相连DNA序列活性的特定DNA片段。例如，启动子,反式作用因子（trans-acting factor）:,一种基因的蛋白质产物，能够影响位于基因组另一条染色体上的（或基因组别处的）另一个基因的表达活性。例如，RNA polymerase,正调控系统,:没有调节蛋白存在时，结构基因是关闭,的，而加入有活性的调节蛋白后,结构基,因的表达活性被开启,无辅基诱导物或激活物,负控制系统:,没有调节蛋白存在时，结构基因是开启的，,加入这种有活性的调节蛋白后，结构基因表,达活性被关闭,阻遏蛋白,所谓“关闭”指表达水平很低,本底水平的基因表达(12个,mRNA,分子细胞周期),“开启”也常有程度的差异,无论是正调控还是负控制，都可以通过调节蛋白质与小分子物质（诱导物或辅阻遏物）的相互作用而达到诱导状态或阻遏状态。,二、基因表达调控的分子机制,1、调控蛋白质的对称性与其识别序列的对称性,调控蛋白大多都是同种分子的多聚体二聚体、四聚体,二倍旋转对称,通过单体和多聚体间的平衡迅速开启和关闭基因活性,同种二聚体要求识别序列为某种重复序列，提高调控作用的特异性,in major groove,特异和非特异结合力,2、调控蛋白的DNA结合结构域的主要花式,主要有：,螺旋-转角-,螺旋（HTH）,Cys-Cys锌指 Cys-His锌指,调控蛋白上存在与DNA和其它蛋白质相互作用的位点,螺旋-转角-螺旋,*两个,螺旋被一个转角隔开,*一个螺旋起识别结合DNA的作用,3个,helix,H1与H2平行 H2与H3形成HTH motif H3位于大沟中，与DNA特异结合,C蛋白N端有五个螺旋，2和3与DNA相互作用,C端负责二聚体形成N端负责与DNA接触,锌指结构,概念:与DNA结合的蛋白质中一小组保守AA与一个Zn,2+,结,合起来形成蛋白质中一个相对独立的结构域,按结合的AA不同有两种类型,a、,Cys-His(C2/H2)锌指,经典的锌指蛋白,中部芳香族氨基酸保守，,加上Zn,和Cys和His之间的配位结构形成,疏水核,经典的锌指蛋白、,类固醇受体（激素）,不同锌指蛋白中锌指数目多少不等,锌指可以串联重复排列，两指间7-8aa,TFA 有9个锌指、通用转录因子SP1有3个,经典锌指的三维结构：一个,发卡和一个螺旋,锌指上的,螺旋负责与DNA作用,b、,Cys-Cys(C2/C2)锌指,Zn,与4个Cys残基,形成配位键,酵母的转录激活因子GAL4、哺乳类的固醇类激素受体为典型代表。,糖皮质激素受体,ZYJ272,The DNA-binding domain of Cys2-Cys2 zinc finger proteins(Figure 1.Glucocorticoid receptor)is composed of two irregular antiparallel beta-sheets and an alpha-helix,followed by an extended loop.,3、调控蛋白与蛋白质结合的方式,（1）HLH,结构特点：长4050个AA残基中含有两个既亲水又亲,酯的,螺旋,被不同长度的连接区隔开(环),此类蛋白借助两个螺旋对应面上,疏水基团,的相互作用形成,二聚体(同种或不同种亚基),鉴定的较清楚的,蛋白质与蛋白质相互作用的结构基元有,螺旋-环-螺旋（HLH）Leu拉链,HLH基元附近有个高度碱性的区段为结合DAN所必须,bHLH,MyoD-DNA,MyoD基因家族成员以肌肉特异性基因转录激活物的形式发挥作用，它们具有bHLH结构域，与肌肉特异性基因调控区常见的顺式作用元件E-box结合。,例如，MyoD蛋白可以与鸡肌肉乙酰胆碱受体的一个亚基基因相结合从而启动这个基因；MyoD基因也可以自身激活，也就是其编码的MyoD蛋白可以结合至自身的上游DNA上而使其处于活化状态。,（2）Leu拉链(Leu zipper),蛋白上含有4或5个精确的,相距7个AA的Leu残基,概念：调控蛋白上富含亮氨酸残基的结构域参与形成二聚体,Leu出现在,-螺旋疏水的,一侧，并直线排列,于是，两个蛋白分子的两,个,螺旋之间依赖Leu,残基之间的疏水作用形成,一条拉链,GCN4,（单体酵母转录激活因子）,Leu拉链区的,氨基端约30个残基的碱性区,与DNA结合,两个Leu拉链作用形成Y型结构，拉链为茎、碱性区分叉对称,成臂拉链蛋白的目标DNA为没有间隔的反向重复,第二节 乳糖操纵元,操纵元(Operon):,基因表达调控的一个完整单元,包括结,构基因和控制区(O、P)以及调节基因(I),的整个核苷酸序列,操纵元中各结构基因按一定比例协调翻译,聚有极性突变效应：,操纵元中一个近基因的无义突变能够影响远基因表，,且根据距离远近呈极性梯度效应,P、O紧密连锁或彼此重叠，I基因位点不固定,顺式作用元件、反式作用因子,一、乳糖操纵元,Jacob&Monod（法国）,1、结构:,2、调节基因 I,产物为阻遏蛋白,四聚体为活性形式,转录方式为,组成型转录,LacI的表达效率很低,原因,其启动子与RNApol的亲和性很低,阻遏蛋白有两个结合位点,:,操作子位点、,诱导物位点,二、Lac Operon的负调控,1、细胞内无诱导物时,呈阻遏状态,阻遏蛋白和操作子的结合,影响了RNApol在-10序列上,形成开放型的启动子复合物,2、细胞内有诱导物时,呈诱导状态,诱导物与阻遏蛋白迅速结合而改变其构象,从O上解离,RNApol,3、诱导物,别乳糖(allolactose),透性酶使乳糖进入细胞后，由,-半乳糖苷酶催化产生,-半乳糖苷酶来源于乳糖操纵元的本底组成型合成,RNApol利用LacO处于游离状态的瞬间进行转录,(阻遏蛋白与LacO有10min20min的结合半衰期),一个mRNA细胞周期,安慰诱导物（义务诱导物）,可诱导半乳糖苷酶产生但不是其底物,*,IPTG，异丙基-,-D硫代半乳糖苷,*TMG，巯甲基半乳糖苷,*ONPG，O-硝基半乳糖苷,4、阻遏蛋白与操作子的相互作用,阻遏蛋白与操作子是否发生相互作用？,阻遏蛋白四聚体结合与膜上，可以与野生型,DNA,片段形,成复合物。并可被,IPTG,抑制。,而用,lacO,c,突变体的,DNA,片段，则不能与阻遏蛋白结合,硝酸纤维素膜可以和蛋白质结合而不与结合,IR序列以+11为对称轴两边为两段各6bp的重复序列,11,+5到+17之间,大部分在左侧,5,21,操作子与阻遏蛋白的结合位点,被保护免于甲基化,与阻遏蛋白紧密相连,甲基化被加强的碱基,组成型突变碱基,阻遏蛋白上与操作子结合的位点,LacO,360,1,60,长头片段,抗胰蛋白酶核心,51,短头片段,阻遏蛋白与操作子的解离,诱导物进入细胞后的可能作用方式,1.直接作用 与操作子上的阻遏蛋白结合,2.间接作用 与细胞中自由四聚体结合,实验结果：,1.阻遏蛋白四聚体操作子复合物半衰期数十分钟，,而诱导作用快得多,2.阻遏蛋白IPTG复合物可以与操作子结合,3.体内不存在游离的阻遏蛋白四聚体,因此，直接作用是正确的,解离过程,无诱导物存在时，细胞内一个阻遏蛋白四聚体结合在操作子上，其余全部随机结合在其他DNA序列上。,加入诱导物后，阻遏蛋白因变构效应使之与lacO的亲和力下降1000倍，但与非特异性序列亲和力不变。,阻遏蛋白四聚体与操作子的结合常数是随机序列的4*10,6,倍。,操作子结合阻遏蛋白的长度26bp，因此大肠杆菌中有4.2*10,6,/26=1.6*10,5,个非特异性结合位点。因此，在无诱导物时，阻遏蛋白四聚体结合操作子的几率仅是结合非特异序列几率的25倍（4*10,6/,1.6*10,5,25）,三、Lac Operon的正调控CAP-cAMP复合物,cAMP,cAMP,CAP蛋白,Low glucose=high cAMP,总结,lac,operon transcription-control region,正控制：,CAP protein,负控制：,repressor,第三节 Trp Operon及,弱化作用机理,一、结构,结构基因,末端-,终止子trpt(,依赖,)、trpt(,不依赖,),邻氨基苯甲,酸合成酶,吲哚甘油磷酸合成酶,Trp合成酶,相距很远的,trpR编码阻遏蛋白,其活性形式为四聚体,并且只有结合trp时才有活性,控制区域 P、O和前导区及弱化子,trpO与tepE之间的162bp的前导区可转录到mRNA中,trpO的结构,*位于trpP内，20bp,有完美的IR序列,*trpP有正常的35和10区，10区完全在trpO内,二、阻遏调控机制,无trp时,有trp时,无活性,二、弱化作用控制-,基因转录的翻译调控,通过核糖体对前导区的翻译而对转录进行调控,弱化子（attenuator):Trp Operon中trpE前的一段,非结构基因的对应序列（123150），其中,包括不依赖,因子的终止子，由于翻译的作用使,转录终止，这段序列称为,(衰减子),发现,缺失增加结构基因的表达，且与阻遏蛋白无关,弱化子调控的表现：（与阻遏蛋白的负调控结果类似）,*无trp时，所有RNApol都能通过弱化子,*有trp时，部分逃过阻遏蛋白监督的RNApol在弱化子,处大部分被扣留，而只有10能通过,1、Trp Operon mRNA的前导序列结构,下游-14aa的前导肽的ORF，其中两个相连的trp的,codon,UGG,对弱化作用的实现起重要作用,下游长28bp的不依赖,因子的终止子为,弱化子的核心部分,前面有核糖体结合位点（SD序列）,2、前导序列的二级结构,决定RNApol在弱化子处是终止转录还是继续转录,1和2、3和4配对,序列1和2、3和4配对时，RNApol在3、4区的不依赖,因,子的终止子处终止,其后的trpE等基因表达受到限制。,2和3配对,序列2和3配对时，RNApol继,续转录，使前导序列后的结构,基因得以转录,3、弱化子弱化控制的机制,Prok.无核膜，转录和翻译偶联,（1）细胞缺少trp，Trp-tRNA,Trp,水,平低，核糖体停顿在两个邻,近的Trp密码子处，此时核,糖体占据序列1，此时序列4,还没转录出来，序列2和3有,机会配对，RNApol可通过弱化子。,(3)此外,Arg饥饿时有相同的后果,(2)当细胞有,Trp,时,Trp-tRNATrp,水平很高,核糖体顺利地翻,译出前导肽而在终止密码子处,(+70,UGA位于序列1和2之,间),解离,此时,核糖体占据了序列1和部分序列2,使序列2不,能有效地和序列3配对,因而序列3和4产生终止子发夹结,构,转录终止。,实现弱化子对转录的调控关键是,时间,和,空间,上的巧妙安排,空间上：两个Trp的codon位置至关重要,时间上：核糖体停顿在两个Trp codon上时，序列4还没,转录出来，否则,这种巧妙安排的一个原因就是RNApol在转录完+90序列处时产生一次延宕给与核糖体以追赶的机会,5、Prok.中弱化子（衰减子）的普遍性,许多负责氨基酸合成的operon都受弱化子的控制，尤其是,His operon中，弱化子是唯一的调控机制,第四节 基因转录的时序调控,时序调控:Prok,.,在生长发育的各个阶段，基因的表达是按照,一定的时间顺序而展开的,如:噬菌体的复制和颗粒的包装,*有效利用能源避免浪费,*避免了某些基因表达时机不当所带来的危害,是多种蛋白质与RNApol作用的结果,一、枯草杆菌嗜菌体中,亚基的替换,1、枯草杆菌中phageSPO1早、中、晚期基因表达的转换,早期基因-寄主的RNApol全酶,55,早期基因28编码的gp,28,取代,55,含有gp,28,的全酶转录中期基因,中期基因33、34编码的gp,33,、gp,34,取代gp,28,以gp,33,gp,34,为,亚基的全酶转录晚期基因,2、枯草杆菌芽孢形成过程中,亚基的替换,二、大肠杆菌热震惊基因的表达,大肠杆菌生长在较高的温度下（42-50度），某些基因,则迅速的表达，这种现象称为,热震惊反应,。,在热震惊反应中大量表达的基因称为热震惊基因,为什么高温条件下热震惊基因会迅速表达？,正长情况下大肠杆菌只有一种亚基(70)，是不能识别热震惊基因的启动子的。大肠杆菌中有一个rpoH基因，编码一个32KD的蛋白质。这个基因在应急反应中表达，作为一个亚基识别热震惊基因的启动子,-35序列前有TNNCNCNC，-10序列前有CCCC,三、T4噬菌体生长中RNA聚合酶亚基的修饰和亚基的替换,T4为烈性噬菌体，进入寄主后，利用寄主的RNA聚合酶转录第一批早期基因,ADP核糖基转移酶,(ADPRT),ADPRT与DNA一起进入寄主细胞，ADPRT将ADP核糖基连接到寄主RNA聚合酶亚基的精氨酸胍基上。修饰后的聚合酶与Mot的结合能力提高.Mot替换亚基，识别第二批早期基因。,第一批早期,Mot,第二批早期,寄主,ADP核糖基,四、T7噬菌体用自身RNA聚合酶代替寄主的RNA聚合酶,I,II,III,0.3,0.7,1,2,TE,T,0.3寄主限制酶抑制剂,0.7蛋白激酶，使寄主RNA聚合酶磷酸化失活,1T7RNA聚合酶,2寄主RNA聚合酶抑制剂,二、,phage裂解性生长和溶源状态的调控,phage进入寄主,体内后可能进入两种不同的周期,裂解周期-环形分子,大部分基因表达,溶源周期-以线性分,子形式整合到寄主的,染色体上,使大部分基,因不表达,Phage的操纵元组织情况,(一),phage裂解生长过程中的基因表达,进入寄主cell的,phage 的DNA上没有任何,调节蛋白，因此寄主的RNApol便结合于PL和PR,1、抗终止蛋白PN和调节蛋白Cro首先被转录,2、PN蛋白的作用导致P,L,和P,R,控制的迟早期基因的表达,表达产物,C,蛋白、,C,蛋白,、,O蛋白、P蛋白、Q蛋白,3、PQ蛋白的作用导致P,R,控制的晚期基因的表达,表达产物头尾蛋白、溶菌酶蛋白,（二）溶源途径,巧妙的调控，小区段表达，整合到寄主染色体上,*此外，C促进Pint启动子转录，使int gene表达产生,整合酶,1、溶源化的建立PE启动子的转录,*C、C蛋白共同确立PE处C的转录（左向）,PE(Establisment Promoter),*C阻遏与裂解生长有关基因的转录，其中转录出的,CmRNA含有S-D序列，因此有很高的翻译活性,Pint启动子,N蛋白和Cro蛋白被转录,N蛋白抗终止C、C蛋白被转录,C,作用于,P,E,(P,RE,),转录C,左向转录,阻遏蛋白结合于O,R,O,L,C,导致自身从P,RM,处转录,C、C蛋白是C合成的正调控因子，作用于PE,处，C是关键。,Cro蛋白间接抑制C、C的转录，直接阻止C的转录。,2、溶源化的维持P,M,启动子的转录,已产生的整合酶使,整合并实现溶源化（attp、attB）。,溶源化的维持需要低水平的C转录，保持自身阻遏循,环，这个功能由P,M,完成。,C蛋白对P,M,正调控,，但P,M,起始转录的C没有S-D,序列，因此翻译效率很低，但足以维持溶源状态。,溶源状态的维持通过C蛋白结合于OL、OR上而实现。,溶源周期,3、C、C蛋白对C和Cro的影响,C和Cro是,phage的两种调节蛋白，,其中Cro能关闭C的表达,溶源化状态的进入与否靠二者结合操作子的情况决定，数量,是谁占上风的关键,二者与操作子的亲和次序为,C蛋白 OL1OL2OL3 OR1OR2OR3,Cro蛋白 OL3OL2OL1 OR3OR2OR1,结合的结果阻止PL和PR的转录,C、C蛋白是C和Cro蛋白谁占上风的关键,因为在C、C的帮助下C表达,而Cro蛋白远早于C蛋白的表达,OL1和OR1分别与P,L,和P,R,最靠近,二者互相阻遏，二者的数量多少决定了寄主的命运,OR3与PM接近,正常情况下，寄主的,hfl,基因产物大量存在导致Cro占上风,因为hfl编码一种蛋白酶水解C,Cro蛋白对左右两个早期操作子亲和力较弱，使两,个操纵元初期表达一段时间才关闭,因此产生足够的O、P蛋白（复制有关）和PQ，从而使菌,4、导致溶源化的因素,（1）营养耗竭：寄主能源濒临枯竭时，导致cAMP产生等,一系列生理变化,*cAMP对hfl基因负调控，使分解C,蛋白的酶大大,减少，,C又能抑制该酶，因而,C、C,C,体走向裂解,（2）MOI值过高（10）：MOI指感染时,噬菌体与,细菌的比例，称感染复数,*C蛋白其作用的形式是寡聚体形式，单体不稳,定无活性,*一两个噬菌体感染寄主时，产生的C,不足以形成,寡聚体,*MOI值过高时，足够C寡聚体产生，确立从P,E,转录C,，,CmRNA的高翻译活性导致C数量,占上风，PE活跃转录的同时抑制了Cro基因的表达,*由于C和操作子亲和力较强，导致C、C不再,表达，但由于C对PM的正调控，产生能够维持溶,源状态数量的C,第五节 翻译水平的调控,翻译的调控主要发生在翻译的起始阶段，基因表达时翻译,的效率主要取决于mRNA的一级结构和高级结构,因此，mRNA的翻译起始区域往往是调控的靶位点,一、反义,RNA,的调控作用,反义,RNA：,又称干扰,mRNA,的互补,RNA,，简称,micRNA,（,mRNA-interfering complementary RNA,）,指与靶,mRNA,具有互补序列的调控,RNA,，通过互补,的,RN,A序列与特定靶,mRNA,结合，起负调控作用,属于核酸与核酸的相互作用,作用机理,目前为止，只有原核生物发现了这种调控系统,例如：1985 Hoopes等人发现的,噬菌体 C抑制晚期基因的,转录就是通过micRNA起作用,Q基因有一个依赖于C的启动子P,aQ,（抗Q），其转录方向与Q,基因相反，即转录产物RNA与Q基因的5端的一半完全互补，从,而抑制Q基因的翻译，抑制晚期基因的表达,转录产生反义RNA的基因称为,反义基因,结合位点：mRNA的SD序列、起始密码子、氨基酸N端的,部分密码子结合,反义RNA调节膜蛋白的合成,E.Coli的外膜中有两种膜蛋白：OmpC和OmpF。二者在外膜中的含量受渗透压的调控。,当渗透压增高时，OmpCOmpF。渗透压降低时，OmpCOmpF。,细胞膜上有一个渗透压感应器，EnvZ，当渗透压增高时EnvZ可以激活OmpR（一种正调控蛋白）。,OmpR可以激活,ompC,和,micF,两个基因的转录。二者紧密连锁，反向转录。调控区位于两个基因中间。,micF,的转录产物即为OmpF的反义RNA,二、mRNA本身的二级结构影响翻译的进行,E.Coli的RNA嗜菌体（,如，MS2、R17、f2,）都具有相似的基因组成。A、CP、Rep、Lys,A:附着蛋白；CP:衣壳蛋白；Rep:复制酶；Lys:裂解蛋白,Lys与CP和Rep基因重叠,A,CP,Rep,Lys,当嗜菌体的RNA进入E.coli后，分子内形成许多碱基配对的二级结构。,A基因和Rep基因的核糖体结合位点均处于二级结构中。只有CP基因可以为核糖体识别而合成衣壳蛋白。,核糖体对CP基因的翻译冲开了Rep基因核糖体结合位点的二级结构，核糖体才能与之结合翻译出RNA复制酶。,嗜菌体的生命过程中CP蛋白的需要量要比RNA复制酶多很多。,CP达到一定浓度时可以与Rep基因的核糖体集合位点结合，封闭了Rep基因的翻译。,RNA复制酶与寄主RNA结合形成RNA复制酶复合体。,复合体组成后，以原有的嗜菌体RNA（正链）为模板复制出负链，在以负链为模板产生更多的正链。,在正链刚开始复制时，与A基因核糖体结合位点互补的序列还没有复制出来。这时候核糖体就结合上去进行翻译。,当结合了12个核糖体后，互补序列就复制出来了。核糖体就无法翻译了。所以每产生一个正链，大约有12 个A蛋白产生。,mRNA寿命对基因表达的调控,决定mRNA寿命的许多因素都影响到基因的表达。,这些因素主要有：,1.核糖体对mRNA具有保护作用,2.mRNA分子的末端二级结构可以阻止外切酶的进攻。,终止子形成的茎环结构使mRNA的稳定性增加,而RNAase可以识别某些mRNA特定的二级结构，从而达到调控目的。,三、蛋白质合成的自体调控,*有些蛋白质能够直接控制自身mRNA的可翻译性,主要是一些核酸结合蛋白或者是与核酸分子相互作用,为其生理功能的蛋白质,*即这些蛋白质的mRNA上可能也有其结合位点,1、释放因子RF2合成的自体调控,利用自身释放肽链的职能提前终止其mRNA的翻译,*当细胞内RF2供应充足时，RF2促成核糖体在上述UGA处肽链,合成的终止,*若细胞缺乏RF2，则核糖体以,未知机制,向前滑动一个Nt，,发生移框，继续合成到最后一个密码子,RF2蛋白质340个AA codons不处于同一阅读框,5.GUU CUU AGG GGG UAU CUU,U,GAC,UAC GAC.3,NH,2,Val Leu Arg Gly Tyr Leu,Asp,Tyr Asp COOH,20 21 22 23 24 25,26 27 28,2、核糖体蛋白合成的自体调控,*E.coli核糖体蛋白质的合成与rRNA（EF_Tu）合成严格协调,（数目）,通过控制翻译的起点,即控制核糖体与自身mRNA的结,合而对其自身蛋白质mRNA可翻译性进行控制,*核糖体蛋白质与RNApol各亚基及延伸因子等混合编组在不,同的操纵元中,*每个operon有,一个核糖体蛋白质作为自身operon调节蛋白,*每个操纵元的mRNA上具有与调节蛋白的结合位点,-靠近或包含SD序列,*操纵元,mRNA,上与调节蛋白的结合位点与组装核糖体时与蛋白质相结合的,rRNA,位点高度同源，具有相似的二级结构,mRNA上与调节蛋白的结合位点,23SrRNA上与,该蛋白,的结合位点,L11/L1 opreon,*调节蛋白与,rRNA,的结合力高于与自身,mRNA,的结合力,*调控方式,当细胞内核糖体蛋白较少时，有游离的rRNA存在，调控蛋白优先结合rRNA，此时,调控蛋白控制的自身操纵元mRNA,继续翻译,相反情况，调控蛋白结合自身mRNA，此时,调控蛋白控制的自身操纵元mRNA,停止翻译,调控实质：核酸的合成水平调节了蛋白质的合成,翻译水平调节,四、严谨反应调控,（stringent response control）,基本概念：原核生物在不良的,营养条件下（,AA,饥饿）,，,自动停止或降低（,1020,倍）,rRNA、tRNA,转录，从而调节,蛋白质合成速度,的严谨现象,相关因子：,严谨因子,：焦磷酸转移酶 由relA基因编码,正常情况下很少表达,信号分子,：魔斑（magic spot）:,ppGpp,魔斑（magic spot）:,pppGpp,之所以称为魔斑-AA饥饿时，E.coli的薄层层析图,谱上有两种Nt与常见的Nt的迁移率不一样,调控机制,空转反应：AA饥饿时，无负载的tRNA进入核糖体的A,位后，新肽键不能形成，但GTP不断消耗,空转反应导致信号分子的产生 ppGpp pppGpp,ppGpp可与RNApol作用，使其不易变构.从而抑制tRNA、rRNA转录,放慢转录起始、延伸过程，放慢蛋白质合成过程，通过紧缩开支，渡过难关,第六节,DNA,序列重排对基因转录的调控,Prok.中研究最多的是鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛基因的相变,过程,一、沙门氏菌的、相及基因分布,on,off,rh1-p,on,off,二、,H,2,rh1,转录单元的表达机制,*,H,2,rh1,转录单元的表达受其上游一段,995bpDNA,序列排列方向控制,*,995bp,序列两端各有一段,14bp,的,IR,IRL 114 IRR 982995,*,H2,基因的起始密码子与,995bp,相隔,16bp,，,启动子,位于,995bp,序列末端,*,995bp,序列中,hin,基因,产物可催化,995bp,序列的倒位,Fla.Mov.H,1,O,Hin,H,2,rh1(阻遏蛋白),IR L(1-14),IR,R(982-995),P,P,Hin-P 转座酶,H2 鞭毛蛋白 H1 阻遏蛋白,Fla-P,H,1,O,Hin,H,2,rh1(阻遏蛋白),IR L(1-14),IR,R(982-995),P,P,H1,鞭毛蛋白,相变机制,三、相变的意义,逃脱寄主抗体的进攻,细菌侵染寄主时处于I相,产生H1鞭毛蛋白,寄主可以针对其制造抗体,而细菌利用相变产生一定的II相后代.又可以在寄主体内生存了.,第七节 Euk.基因表达调控,一、Prok.与Euk.基因表达上的遗传差异,Repetitive gene Overlapping gene,非编码区 大量 少量,Splitting gene,很少出现,Post-transcription,transcription&translation,RNA processing 偶联,Eukaryote Prokaryote,DNA,DNA+,histon,chromatin Naked DNA,Enhancer&silencer,弱化子,Attenuater,Monocistron,polycistron,(,operon,),m,5,C,gene off,乙酰化,磷酸化,甲酰化,糖基化,转录因子,trans factor,活性形式,Eukaryote Prokaryote,Housekeeping gene(constitutive),Basic promoter+T.F.,Luxury gene(inducible),多种组合的Trans-Factor,Positive control(mostly),严谨性，专化性，复杂性,(cAMP+CAP)site+,35+10,单一类型,保险性,Negative control,Eukaryote Prokaryote,基因表达上的主要异同,以转录水平调控为主,真核生物染色质的状态对基因表达的调控,m,5,C与基因表达的相关,转录后多种方式的加工调节(RNA加工运输),Trans F+Cis F.,Gene on/off,相异：,相似：,个体发育的阶段和不同组织调控不同,以positive control为主,Positive control的必要性与优越性,a)真核生物genome大，某一种cis-factor出现的机率高,但随机出现a set of(trans-F+cis-F.)完全相同的机率小,灵活,性,可与多个(种)trans-Factor结合,严谨性,b)特异基因表达,细胞分化,如果 1000/10000(10%)基因表达（9000基因关闭）,Negative control;,9000 repressor required,Positive control;,停止合成 9000 特异tran-factor,即只合成1000特异expresser,经济,合理,有效,二、Euk.DNA水平的调控,1、基因拷贝数的改变,a)基因的丢失（DNA fragment or chromosome lose）,蛔虫胚胎发育过程中有27%DNA的丢失,细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除,这些基因的活性,某些低等Euk.：原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物,体细胞内丢失整条或部分染色体,将来分化产生生殖细胞的细胞内不发生基因的丢失,高等Euk.内尚未发现,b)基因的扩增(特定基因在特定阶段的选择性扩增),在没有发生细胞分裂情况下，细胞内某些特定基因的,拷贝数专一性大量增加的现象,细胞短期内为满足某种需要而产生足够的基因产物的,一种调控手段,两栖类和昆虫卵母细胞rDNA的扩增,例：非洲爪蟾 体细胞rDNA约 500copies,卵母细胞 200万copies（4000倍）,chromatin 状况与基因表达相关,证据1：,转录活化区/非转录活化区染色质的结构差异,活跃转录区对,Dnase,敏感,核小体结构不完整,没有连接的H1,常染色质,gene on,异染色质,gene off,2、转录区染色质结构的变化对基因表达的控制,量大，进化保守，与DNA 无专一性结合区,H,2A,H,2B,H,3,H,4,modified by,乙酰化、磷酸化,表达非常活跃的,rDNA,转录区无,nucleosome,结构,凡被,Trans-factor,结合的区域,均能阻止,nucleosome,形成,降低组蛋白的正电荷,组蛋白解聚,核小体松弛,活跃转录区的组蛋白确实被乙酰化、磷酸化,证据2；,体外重建染色质改变转录效率,Naked DNA DNA+,H,2A,H,2B,H,3,H,4,转录速度,转录速度,转录速度 转录速度,complete nucleosome,add H,1,3、m,5,C对基因表达的调控,a)m,5,C是真核生物 DNA中的主要修饰成分,多发生在CpG序列中,不同细胞间m,5,C 相差甚大,b)m,5,C对基因转录抑制的表现,m,5,C,在大沟内影响,DNA,与,T.F.,间氢键的形成,大沟内,m,5,C,导致空间的拥挤,破坏构象的平衡,使,B-DNA,Z-DNA,T.F.,结合空间的改变,降低转录因子与,DNA,的结合,4、Euk.的基因重排,啤酒酵母（,Saccharomyces cerevisiae,）接合型的决定,接合型,MATa,MAT,单倍体细胞,或a或,接合型互变需要HO基因,编码内切酶,1、单倍体接合型受,MATa MAT,控制,同宗不能接合，异宗能,接合,a,a,a,2、接合型互变的匣子模型,a、单倍体细胞中同时存在,MATa和MAT,的遗传信息,b、活跃匣子MATa或MAT,沉寂匣子HML,、HMRa,在同一条染色体上,c、接合型互变,HML,、HMRa能取代活,跃匣子而改变接合型,（不同型）,原HM位置仍保留一个拷,贝的沉寂匣子,3、沉寂匣子的表达,受阻遏蛋白亚基基因sir1、sir2、sir3、sir4的产物,Sir蛋白的反式作用控制,Sir(silent information regulator),结合在HML和HMR的启动子上游,而MAT上无结合位点,三、Euk.转录水平的调控,Euk.基因表达包括的5种不同的调节点:,基因结构的激活、,起始转录,、加工转录物、,运输到细胞质、mRNA的翻译,起始转录RNA聚合酶与启动子相互作用决定,若干Trans F+Cis F.的作用所决定,Euk.启动子的定义：包括所有那些位于转录起始位点,附近的序列，这些序列都是启动,转录所必需的（实用角度）,转录因子：转录所必需的蛋白质（决定性功能指标）,识别并结合在启动子序列上,并非严格定义,未包括增强子,a、,基本水平转录的,cis-factor,(promoter or basic factor),Core promoter,(Cap site,TATA box,必需因子,),UPE,(Upstream Promoter Element)(CAAT box,GC box),对于 housekeeping gene,(constitutive expression,),（1）启动子的组成,b、,特异诱导高效表达的,cis-factor,Enhancer,对于 luxury gene,(inducible expression),1、RNApol,的启动子和转录因子,（2）转录因子的分类,a、基本转录水平的转录因子(Trans-factor),基础因子Core promoter,上游因子UPE,所有基因表达所必须-,基础转录复合体,每个元件都有相,应的转录因子,元件名称,共有序列,结合,DNA,长度,因子,TATA box,TATAAAA,10bp,TBP,CAAT box,GGCCAATCT,22bp,CTF/NF1,GC box,GGGCGG,20bp,SP1,Octamer,ATTTGCAT,20bp,Oct-1,Octamer,ATTTGCAT,23bp,Oct-2,kB,GGGACTTTCC,10bp,NF,kB,ATF,GTGACGT,20bp,ATF,真核生物必须有与基本转录相关的trans-factor 在,启动子处的先期结合,RNApol才能启动转录,l,TF(I,II,III)转录因子,l,TAF(TBP 辅助因子),l,RAP(RNApol.结合蛋白),TIC(转录起始复合物)等等.,此外,b、诱导型因子,特定时间、条件、或特定组织中合成或被活化,调控基因在不同时间、条件或不同地点表达,应答元件-enhancer,（3）转录因子的DNA结合域和活化结构域是独立的,结合结构域和活化结构域之间的连接物是足够柔性的,l,多为变构蛋白,DNA-结合 domain,二聚化 domain,(在一些二聚体因子中),活化 domain,转录因子的结构域,a DNA结合:,HTH、锌指、碱性区域,b 蛋白质结合：,Leu拉链、HLH、,c 活化,一段包括酸性AA的保守序列,（4）Enhancer 的结构与功能,双方向性，组织特异性，位点非专一性,a、,由两个以上的,增强子成分(,Enhancer Element,),组成,b、Enhancer Element,必需由两个紧密相连,具有间距效应的,增强子元,(Enhanson,）,组成,c、,各个,Enhanson(cis-factor),与激活蛋白(,trans-factor),结合,增强特异性转录,促进转录的复合体,+,UPE+core promoter,基本转录复合体,Enhancer,特异的,transc.Factor(tran-factor),特异的,transc.Factor(tran-factor),.,+,+,增强子复合物的激活区,增强子复合物的激活区,.,Enhancer Element,Enhancer Element,.,(100bp),Enhanson(cis-factor),Enhanson(cis-factor),.,(5bp),e.g.SV40 Enhancer(-179-250),En.Elem.C En.Elem.,B,-250 -180,coreC TCII TCI sphII sphI,Ap3 Ap2 Ap1,远距离控制，无方向性,mRNA,+1,GC CAAT TATA,近启动子复合物