微生物-八遗传(2).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为,基因重组,（,gene recombination,）,或,遗传重组,（,genetic recombination,）,。,基因重组,杂交,（,hybridization,）,遗传物质,分子水平,上的杂交,遗传物质,细胞水平,上的杂交,细胞水平的杂交包含分子水平上的重组。,在微生物中各种形式基因重组的比较,特点：,片段性，仅一小段,DNA,序列参与重组；,单向性，作单方向转移；,供体菌,受体菌,供体基因组 受体基因组,转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。,原核生物,4,种主要遗传重组形式：,转化,（,transformation）,转导,（,transduction）,接合,（,conjugation，mating）,原生质体融合,（,protoplast fusion）,（一）转化,（,transformation）,供体菌,DNA,受体菌,直接被吸收,受体菌,（,recipient cell，receptor）,直接吸收,供体菌,（,donor cell）,的游离,DNA,片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。,通过转化方式而形成的杂种后代，称,转化子,（,transformant）。,自然遗传转化,（,natural genetic transformation）,人工转化,（,artificial transformation）,1.,转化的条件,原核生物,Streptococcus pneumoniae,（,肺炎链球菌）、,Haemophilus,（,嗜血杆菌属）、,Bacillus,（,芽孢杆菌属）、,Neisseria,（,奈瑟氏球菌属）、,Rhizobium,（,根瘤菌属）、,Staphylococcus,（,葡萄球菌属）、,Pseudomonas,（,假单胞菌属）、,Xanthomonas,（,黄单胞菌属）等。,转化微生物的种类,真核微生物,Saccharomyces cerevisae,（,酿酒酵母）、,Neurospora crassa,（,粗糙脉孢菌）、,Aspergillus niger,（,黑曲霉）等。,感受态,（,competence,）,感受态,是指受体细胞最易接受外源,DNA,片段并能实现转化的一种生理状态。,能发生转化的受体细胞都处于感受态。,感受态细胞,（,competent cell）,是具有摄取外源,DNA,能力的细胞。,自然感受态,是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；,人工感受态,则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取,DNA,的能力，或人为地将,DNA,导入细胞内。,（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）,感受态受遗传控制，但也存在个体差异。,感受态出现的时间不同；,感受态细胞所占比例和维持时间不同；,外界环境因子如腺苷酸（,cAMP）,及,Ca,2,等对感受态也有重要影响。,调节感受态的一类特异蛋白称,感受态因子,。,膜相关,DNA,结合蛋白,（,membrane-associated DNA binding protein,）,细胞壁自溶素,（,autolysin,）,几种核酸酶,转化因子,（,transforming principle,）,转化因子,的本质是离体的,DNA,片段。一般只有15,kb,左右或更小。,在不同的微生物中，转化因子的形式不同。,有,dsDNA,、,ssDNA,和,质粒,DNA,。,质粒,DNA,通常不能与核染色体组发生重组。,转化的频率通常为0.11.0，最高为20。,能发生转化的最低,DNA,浓度极低，110,5,g/mL（,即110,11,g/mL,）。化学方法无法测出这么低的浓度。,2.,转化过程,（1）自然遗传转化（简称自然转化）,1928年，,Griffith,发现肺炎链球菌,（,Streptococcus pneumoniae,）,的转化现象，转化过程研究得较深入的就是这种,G,细菌。,目前已知有,20,多个种的细菌具有自然转化的能力,进行自然转化，需要两方面必要的条件：,建立了感受态的受体细胞,外源游离,DNA,分子,str,r,存在抗链霉素的基因标记,str,s,有链霉素敏感型基因标记,自然转化过程的特点：,a）,对核酸酶敏感；,c）,转化率的高低主要取决于转化（,DNA）,供体菌和受体菌之间的亲缘关系；,d）,通常情况下质粒的自然转化效率要低得多。,b）,不需要活的,DNA,供体细胞；,（2）人工转化,用,CaCl,2,处理细胞、电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制。,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源,DNA,的“人工感受态”。,质粒的转化效率高。,指用提纯的病毒核酸（,DNA,或,RNA）,去感染其宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。,转染,（,transfection,）,病毒核酸,（,DNA,或,RNA,）,宿主细胞,直接感染,噬菌体,DNA,被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒,现在把,DNA,转移至动物细胞的过程也称转染,提纯的噬菌体,DNA,以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,特点：,（二）转导,（,transduction）,通过,缺陷噬菌体,（,defective phage,）,的媒介，把供体细胞的小片段,DNA,携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为,转导,。获得新遗传性状的受体细胞，就称,转导子,（,transductant,）,。,供体细胞,DNA,受体细胞,缺陷噬菌体为媒介,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：,一个细胞的,DNA,通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中,能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒,DNA,带到另一个细菌的噬菌体称为,转导噬菌体。,细菌转导的两种类型：,普遍转导,局限转导,流产普遍转导,完全普遍转导,低频转导,高频转导,1.,普遍转导,（,generalized transduction,）,通过极少数,完全缺陷噬菌体,对,供体菌,任何小片段,DNA,进行“误包”，而将其遗传性状传递给,受体菌,的现象，称为,普遍转导,。,一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。,错误包装,（1）,完全普遍转导,（,complete transduction,）,经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌,DNA,片段的受体菌，外源,DNA,在其内进行,交换、整合和复制,，,使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作,普遍转导子,，这种现象就称普遍转导。,受体菌,10,-,8,10,-,6,供体菌,受体菌,误包,转导颗粒,转导子,双交换,同源配对,S.typhimurium,的,P22,噬菌体,、,E.coli,的,P1,噬菌体,、,Bacillus subtilis,的,PBS1,和,SP10,等噬菌体,都能进行,完全普遍转导,。,供体菌,转导媒介噬菌体,受体菌,（2）,流产普遍转导,（,abortive transduction,）,经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌,DNA,片段的受体菌，外源,DNA,在其内既,不进行交换、整合和复制,，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。,受体菌,外源,DNA,获得外源,DNA,获得少量酶,不断稀释,外源基因经转录、翻译而形成的少量酶,细胞分裂,特点：,在选择培养基平板上形成微小菌落,供体,DNA,不能复制，因此群体中仅一个细胞含有供体,DNA，,而其他细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。,普遍转导的三种后果：,形成稳定的,转导子,流产转导,外源,DNA,被降解，转导失败,2.,局限转导,（,specialized transduction，restricted transduction,）,指通过,部分缺陷的温和噬菌体,把,供体菌,的少数,特定基因,携带到,受体菌,中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。,最初于1954年在,E.coli,K12,中发现。,特点：,只局限于传递供体菌核染色体上的,个别特定基因,，,一般为噬菌体整合位点两侧的基因；,该特定基因由,部分缺陷的温和噬菌体,携带；,缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率（10,-5,）,“误切”,（不正常切离，,abnormal excesion,）,或由于双重溶源菌的,裂解,而形成；局限转导噬菌体要通过,UV,等因素对溶源菌的,诱导,并引起裂解后才产生。,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上,宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体,DNA,上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,缺陷噬菌体在宿主细胞内能够像正常的,DNA,分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成,转导颗粒,。,但没有正常噬菌体的,溶源性和增殖能力,，感染受体细胞后，通过,DNA,整合进宿主染色体而形成稳定的,转导子,。,E.coli,的,噬菌体,和,80,噬菌体,具有局限转导的能力。,局限转导,低频转导,高频转导,根据转导子出现频率的高低分类,3.,溶源转变,（,lysogenic conversion）,正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生,溶源化,时，因噬菌体的基因整合到宿主核基因组上，而使宿主获得了除免疫性外的,新遗传性状,的现象，称溶源转变。,一个与转导相似又不同的现象,溶源转变与转导的不同,a）,这是一种不携带任何外源基因的正常噬菌体；,b）,是噬菌体的基因而不是供体菌的基因使宿主获得新性状；,c）,新性状是宿主细胞溶源化时的表型，而不是经遗传重组形成的稳定转导子；,d）,获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失。,（三）接合,（,conjugation，mating,）,供体菌,（“雄性,”）,通过,性菌毛,与,受体菌,（“雌性”）直接接触，把,F,质粒,或其携带的不同长度的,核基因组片段,传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为,接合,。,通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是,接合子,（,conjugant,）,。,1946,年，,Joshua Lederberg,和,Edward L.Taturm,细菌的多重营养缺陷型杂交实验,通过细胞与细胞的直接,接触而产生的,遗传信息的转移和重组过程,接合,两株菌之间发生了基因重组,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间直接接触，发生了遗传物质的交换和重组所致！,大肠杆菌的接合机制,接合作用是由一种被称为,F,因子的质粒介导,F,因子的相对分子质量通常为510,7,，上面有编码细菌产生性菌毛（,sex pili）,及控制接合过程进行的20多个基因。,含有,F,因子的细胞：“雄性”菌株（,F,+,），,其细胞表面有性菌毛,不含,F,因子的细胞：“雌性”菌株（,F,-,），,细胞表面没有性菌毛,F,因子为附加体质粒,可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上,F,质粒,插入（整合）,F,因子的,4,种细胞形式,a）,F,-,菌株,，不含,F,因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收,F,因子而变成雄性菌株（,F,+,）；,b）,F,+,菌株,，,F,因子独立存在，细胞表面有性菌毛。,c,）,Hfr,菌株,，,F,因子插入到染色体,DNA,上，细胞表面有性菌毛。,d）F,菌株,，,Hfr,菌株内的,F,因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的,F,因子，特称为,F,因子。细胞表面同样有性菌毛。,1,）,F,+,F,-,杂交,Hfr,菌株的,F,因子插入到染色体,DNA,上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给,F,-,细胞并发生重组，由此而得名为,高频重组菌株,。,2）,Hfr F,-,杂交,3,）,FF,-,杂交,接合（,conjugation，mating）,转化（,transformation）,转导（,transduction）,（四,）,原生质体融合,（,protoplast fusion）,通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子的过程，称为,原生质体融合,由此法获得的重组子，成为,融合子,（,fusant,）,。,选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本,细菌或放线菌可用,溶菌酶,、,青霉素,处理，,真菌可用,蜗牛酶,或其他相应的,脱壁酶,等,各种选择性培养基,原生质体融合的主要步骤：,（,1,）原生质体融合的,重组频率可大于,10,-1,；,诱变育种一般仅为10,-6,；,（,2,）实现同种不同,菌株间,或,种间,原生质体融合，,属间科间,甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合，以期达到生产性状更为优良的新物种,。,原生质体融合的优势：,二、真核微生物的基因重组,有性杂交,准性杂交,原生质体融合,遗传转化,（一）有性杂交,（,sexual hybridization）,杂交,是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。,有性杂交,，一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。,（二）准性杂交,（,parasexual hybridization）,准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为,原始,的一种两性生殖方式。,这是一种在同种不同菌株的体细胞间发生的融合，它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。,（1）菌丝联结,（,anastomosis,）,（2）形成异核体,（,heterocaryon,）,（3）核融合,（,nuclear fusion,）,核配,（,caryogamy,）,（4）体细胞交换,（,somatic crossing-over,）,和单倍体化,准性生殖过程：,准性生殖和有性生殖的比较,准性杂交育种,（,breeding by parasexuality,）,：,选择亲本：选择来自不同菌株的合适的营养缺陷型作为准性杂交的亲本。,强制异合：用人为的方法强制两菌株形成异核体。,移单菌落：将培养皿上长出的这种单菌落移种到基本培养基的斜面上。,验稳定性：检验新菌株究竟是不稳定的异核体，还是稳定的杂合二倍体。,促进变异：用诱变剂。,在上述工作的基础上，再经过一系列生产性状的测定，就有可能筛选到比较理想的准性杂交种。,