植物生理学实验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,植物生理学实验室规则,1,、认真预习实验。明确目的，掌握原理，列出步骤，提出问题。,2,、认真操作，仔细观察，从实记录。,3,、正确操作仪器，不乱开仪器。,4,、注意安全和清洁卫生（包括值日）。,5,、正确处理废物。,上 饶 师 范 学 院,生命科学系生物实验示范中心,实验报告要求,实验原理：简明扼要；,材料：用什么？,方法：实际操作过程；,数据计算：原始数据，计算公式，结果。,讨论和分析：针对自己的结果进行。,实验报告在下一次实验时上交，但实验原始数据须经指导老师审核后才可离开。,上 饶 师 范 学 院,生命科学系生物科学实验教学中心,植物生理学实验评分标准,课上：,1,、预习报告,2,、认真实验，操作规范，实验结果符合要求,3,、不迟到，不早退，积极参与卫生清扫,上 饶 师 范 学 院,生命科学系生物科学实验教学中心,课下：实验报告评分标准,1,、卷面清洁，字迹工整,10,分,2,、语句通畅，简明扼要，逻辑性强，表达准确无概念错误,20,分,3,、预习报告、实验原始记录、实验报告齐全,15,分,4,、实验报告格式规范，重点突出,15,分,5,、实验原始记录要如实认真记录实际操作、察及测定结果,20,分,6,、对实验结果的讨论要充分有据，论点要正确，与该实验无关的内容不要写入报告中,20,分,7,、抄袭别人报告者,0,分,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,本学期实验内容与安排,1,、,质壁分离法测定植物组织的渗透势,2,、,植物体内硝态氮含量的测定,3,、,叶绿素,a,、,b,含量的测定,4,、,赤霉素对水稻,-,淀粉酶的诱导形成,5,、植物呼吸强度的测定,6,、,种子活力的快速测定,氯化三苯基四氮唑,(TTC),法 及红墨水法,7,、丙二醛含量的测定,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,实验一 质壁分离法测定植物组织的渗透势,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,一、实验目的、原理,实验目的,观察植物组织在不同浓度溶液中细胞质壁分离的产生过程及其用于测定植物组织渗透势的测定,实验原理,原生质层（细胞膜、原生质、液泡膜）具有选择透过性，近似于半透膜，一个成熟的植物细胞就是一个完整的渗透装置：当外界溶液浓度大于细胞液浓度时,(,高渗溶液），细胞失水，发生质壁分离；当外界溶液浓度小于细胞液浓度时（低渗溶液），细胞吸水；当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，当外界溶液浓度等于细胞液浓度时（等渗溶液），植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。细胞水势等于细胞液的渗透势等于外界溶液渗透势。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,质壁分离及质壁分离复原,将植物组织置于对其无毒害的一系列不同浓度的溶液里处理一定时间，然后镜检发生质壁分离的情况，细胞的等渗浓度将界于刚刚引起初始质壁分离的浓度和不能引起质壁分离的浓度之间。代入公式即可计算渗透势。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,二、,材料、器材与试剂,1,实验材料 洋葱表皮,2,实验仪器 显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，刀片，培养皿，记号笔，滴管。,3,实验试剂 分别配制,0.50,、,0.45,、,0.4,、,0.35,、,0.30,、,0.25,、,0.20,、,0.15,、,0.10mol/L,的蔗糖溶液，贮,9,个试剂瓶中。称,34.23g,蔗糖用蒸馏水配成,100ml,，其浓度为,1mol/L(,母液,),。再配制成下列各种浓度：,0.50mol/L,：吸母液,25ml+,水,25ml,0.45mol/L,：吸母液,22.5ml+,水,27.5ml,0.40mol/L,：吸母液,20.0ml+,水,30.0ml,0.35mol/L,：吸母液,17.5ml+,水,32.5ml,0.30mol/L,：吸母液,15.0ml+,水,35.0ml,0.25mol/L,：吸母液,12.5ml+,水,37.5ml,0.20mol/L,：吸母液,10.0ml+,水,40.0ml,0.15mol/L,：吸母液,7.5ml+,水,42.5ml,0.10mol/L,：吸母液,5.0ml+,水,45.0ml,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,三、实 验 步 骤,1.,取,6,套干净清洁的小培养皿，用记号笔编号，将配制好的不同浓度的蔗糖溶液按顺序倒入各个培养皿中使成一薄层，盖好皿盖。,2.,选用有色素的洋葱鳞片的外表皮迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，每个培养皿中放材料,3,个左右，使其完全浸没，浸泡,20,分钟左右。,3.,到时后，取出表皮，放在载玻片上，滴一滴相同浓度的蔗糖，盖上盖玻片，在显微镜下观察质壁分离的细胞数如果所有的细胞都产生质壁分离现象，则取低浓度溶液中的制片做同样的观察，并记录质壁分离的相对程度。,上 饶 师 范 学 院,生命科学系生物科学实验教学中心,4.,在实验中确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁角隅上分离的最低浓度，和不引起质壁分离的最高浓度。,5.,在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直到有把握为止。在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,6,计算,求得,C1,按下式计算渗透势,按,=-iRTC1,计算水势值。,C,等渗溶液的质量摩尔浓度，单位是,mol/kg,；,R,气体常数（,0.008314MPa/L/mol/K,）,T,绝对温度,i,解离系数（蔗糖,1,，,CaCl,2,2.60,）,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,【,思考题,】,用质壁分离法测定植物细胞渗透势与用小液流法测定植物组织水势都是以外液的浓度算出的溶质势为根据，他们之间的区别何在。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,实验二,植物体内硝态氮含量的测定,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,一、实验目的、原理,实验目的,硝态氮是植物最主要的氮源。植物体内硝态氮含量往往能反映土壤中硝态氮供应情况，因此可作为土壤肥氮肥的指标。测定植物体内的硝态氮含量，不仅能够反映出植物的氮素营养情况，而且对鉴定蔬菜和植物为原料的加工制品的品质也有重要的意义。,实验原理,在浓酸条件下，,NO,3,-,与水杨酸反应，生成硝基水杨酸，硝基水杨酸在碱性条件下（,PH12,）呈黄色，在一定范围内，其颜色深浅与含量成正比，可直接比色测定。,上 饶 师 范 学 院,生命科学系生物科学实验教学中心,二、材料、设备仪器及试剂,（一）材料,白菜叶片,（二）仪器设备及试剂,1,实验仪器,722,型分光光度计、电子天平。,2,实验试剂 （,1,）,500ppmNO,3,-,标准溶液精确称取烘至恒重的,KNO3 0.7221,克溶于无离水中，定容至,200ml,。,（,2,）,5%,水杨酸一硫酸溶液 称取,5,克水杨酸溶于,100ml,，浓硫酸中（密度为,1.84,），搅拌溶解后，贮于棕色瓶中。置冰箱保存一周有效。,（,3,）,8%,氢氧化纳溶液 称取,10,克氢氧化纳溶于,1,升无离子水中即可。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,三、实验步骤,1.,标准曲线的制作,（,1,）吸取,500ppmNO3-,标准溶液,1ml.2ml.3ml.4ml.6ml.8ml.10ml.12ml,分别放入,501ml,容量瓶中，用无离子定至刻度，使之成,10,、,20,、,30,、,40,、,60,、,80,、,100,、,120ppm,的系列标准溶液。,（,2,）吸收上述系列标准溶液,0.11ml,，分别放入刻度试管中，以,0.11ml,无离子水代替标准溶液作空白，再分别加入,0.4ml,水杨酸一硫酸溶液，摇匀，在室温下放置,20,分钟后再加入,8%NaOH,溶液,9.51ml,摇匀冷却至室温，显色液总体积为,101ml,。,（,3,）以空白作参比，在,410nm,波长下测定吸光度。以,NO3-N,浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。,上 饶 师 范 学 院,生命科学系生物科学实验教学中心,三、实验步骤,2.,样品中硝酸盐的测定,（,1,）样品液的制备，取一定量的植物材料剪碎混匀后，精确称取,2-3,克分别放入三支刻度试管中，加入,10ml,无离子水，用玻璃塞封口，置入沸水浴中提取,30,分钟，到时间后取出，用自来水冷却，将是取液过滤到,25ml,容量瓶中，并反复冲洗残渣，最的定容至刻度。,（,2,）样口液的测定 吸取样品,0.1 ml,分别于三支刻度试管中，然后加入,5%,水杨酸一硫酸溶液,0.4 ml,，混匀后置室温下,20,分钟，再慢慢加入,9.5 ml 8%NaOH,溶液，待冷却至室温后，以空白作参比，在,410nm,波长下测期吸光度。在标准曲线上查得或用回归方程计算出,NO,3,-,-N,浓度，再用下公式计算其含量。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,四、结果计算,四氮唑还原强度：,根重（,g,）,时间,(h),mg/g(,根鲜重,)/h=,四氮唑还原量（,mg,）,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,实验三,叶绿素,a,、,b,含量的测定,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,一、实验目的、原理,实验目的,在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素,a,和,b,的方法及其计算。,实验原理,如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据朗伯,-,比尔（,Lambert-Beer,）定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。,根据叶绿素,a,和,b,的吸收光谱曲线，叶绿素,a,的最大吸收峰在,663nm,，叶绿素,b,的最大吸收峰在,645nm,吸收曲线彼此又有重叠。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,根据朗伯,-,比尔定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度,C,与光密度,OD,之间有如下关系：,OD1=Ca,ka1+Cb,kb1 (1),OD2=Ca,ka2+Cb,kb2 (2),式中，,ka1,、,ka2,、,kb1,、,kb2,分别为组分,a,、,b,在浓度,1g/L,时，对应波长为,1,、,2,时的光密度,OD,值，即比吸收系数。,波长,/nm,叶绿素,a,叶绿素,b,66382.049.2764516.7545.60,将表中数值代入（,1,）、（,2,）式，并解方程可得：,Ca=0.00127OD663-0.00269OD645 (3),Cb=0.0229OD645-0.00468OD663 (4),将单位改为,mg/L,，于是总叶绿素浓度为,CT=Ca+Cb=8.02 OD663+20.21 OD645 (5),生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,1,实验仪器 高级型分光光度计，离心机，天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管等。,2,实验试剂 丙酮，碳酸钙，石英砂。,3,实验材料 大叶黄杨叶片。,二、实验材料、仪器与设备,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,称取新鲜叶片,0.5g,加纯丙酮,5ml,研磨成匀浆,再加,80%,丙酮,5ml,，并转入离心管,充分洗涤研钵,离心,定容至,20 ml,取上述提取液,1ml,，加,80%,丙酮,4ml,稀释后转入比色杯中，以,80%,丙酮为对照，测定光密度,计算各种浓度（,Ca,、,Cb,）。,三、实验步骤,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,四、实验结果计算,将测定得到的吸光值代入下面的式子：,Ca=13.95A,665,6.88A,649,Cb=24.96A,649,7.32A,665,Cr=18.08 A,649,+6.63 A,665,（,Ca,、,Cb,：,mg/L,）,叶绿素的含量（,mg/g,）,=,叶绿素的浓度,提取液体积,稀释倍数,/,样品鲜重,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,1,由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似,80%,。,2,由于叶绿素,a,、叶绿素,b,的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差。,五、注意事项,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,六、实验作业,1,、为什么提取色素时先用纯丙酮提取，再用,80%,丙酮提取？,2,、根据你的实验结果计算出该种植物的叶绿素,a,、,b,的比值。,3,、根据你的实验结果，计算出该植物每克鲜重叶片中叶绿素的含量（单位用,mg,g,-1,FW,表示）,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,实验四赤霉素对水稻,-,淀粉酶的诱导形成,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,一、实验目的、原理,实验目的,1,通过实验深入了解赤霉素在种子萌发过程中的调控作用。,2,掌握测定,-,淀粉酶活的一种简便方法,实验原理,淀粉性种子在萌动过程中，胚释放出来的赤霉素能诱导糊粉层细胞中,-,淀粉酶基因的表达，引起,-,淀粉酶生物合成，并分泌到胚乳中催化淀粉水解为糖。外源赤霉素能代替胚的分泌作用，诱导,-,淀粉酶的形成。,-,淀粉酶也能将淀粉水解成还原糖，但,-,淀粉酶不耐热，在高温下易钝化。将酶液在高温下维持一段时间，钝化,-,淀粉酶，可准确测定,-,淀粉酶的活性。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,二、实验,材料,、仪器、试剂,1,实验材料：水稻种子,2,实验仪器设备：分光光度计、恒温箱、,水浴锅、,移液管、,烧杯、,试管、青霉素小瓶、镊子、刀片。,3,实验试剂：,2mol/LNaOH,溶液、,1%,淀粉溶液、,20mg/L,赤霉素溶液、,0.1mol/L(PH5.6),柠檬酸缓冲液、,2,，,3,，,5-,二硝基水杨酸（,DNS,）试剂,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,三、实验步骤,1.,水稻种子的选择和预处理,选取大小一致、健康的水稻种子，一份放入盛有适量的,20mg/LGA,溶液中，另一份放入盛有适量清水的培养皿中处理,24h,取出后用清水冲洗，置于培养箱中再陪养,1d,，处理与培养温度均为,30,。,2.,酶的提取,取对照和,GA3,处理培养的种子,2g,磨成匀浆到入,50ml,容量瓶中用蒸馏水定容至刻度混匀放置,15-20min,（每,2min,震荡一次）离心（,4000r/min,15min,）,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,3.-,淀粉酶活性的测定,取试管,4,只编号（清水试验；清水调零；,GA3,试验；,GA3,调零）每管中各加入酶液,1ml70,恒温水浴加热,12min,各加入,1ml,柠檬酸缓冲液,将试验管置于,40,恒温水浴,15min,再迅速加入预热的淀粉溶液,2ml40,恒温水浴,5min,加入,NaOH,溶液,0.5ml,终止反应；调零管中加入,2mol/LNaOH,溶液,0.5ml,混匀加入预热的淀粉溶液,2ml.,4.,样品的测定,取以上各管中的溶液,1ml,于,15ml,刻度试管中加入,DNS,试剂,1ml,混匀沸水煮沸,5min,迅速冷却定容至,12ml520nm,波长测定,OD,值。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,四、结果计算,-,淀粉酶活性,=,（,OD520,稀释倍数）,/,样品鲜重,/,反应时间,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,实验五,植物呼吸强度的测定,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,一、原理,利用,NaOH,溶液滴定呼吸过程中释放的,CO,2,，实验结束后，用草酸溶液滴定残留的,NaOH,，从空白和样品两者消耗草酸溶液之差，即可计算出呼吸过程中释放的,CO,2,的量。,C,6,H,12,O,6,+6O,2,6CO,2,+6H,2,O,2NaOH+CO,2,Na,2,CO,3,+H,2,O,2NaOH+C,2,H,2,O,4,(,草酸,)Na,2,C,2,O,4,(,草酸钠,)+2H,2,O,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,二、材料、仪器设备及试剂,1.,实验仪器锥形瓶，秒表，酸式滴定管，移液管，尼龙网袋,2,个。,2.,实验试剂,1/44mol/L,草酸溶液，,0.2M NaOH,溶液，,1%,酚酞。,3.,实验材料萌发的水稻种子（,48h,）。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,三、实验步骤,1.,称取萌发的水稻种子,10g,，装入尼龙小袋内，把小袋系到锥形瓶塞的小钩上。,2.,用移液管吸取,20ml NaOH,加入锥形瓶中，塞紧瓶塞并立即计时。,3.,实验进行,30,分钟，其间每隔数分钟轻轻摇瓶内的碱液数次。,4.,打开锥形瓶塞，滴入酚酞,2,滴，立即用草酸滴定，滴定至红色突然消失，记下滴定样品消耗草酸,的用量。,5.,另称取萌发的水稻种子,10g,，用沸水煮,5-10,分钟，作同样测定，以此为对照。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,四、实验结果,用对照煮过的种子消耗草酸的量,v0 ml,减去萌发样品消耗草酸的量,v1 ml,，按每秒消耗,1ml,草酸相当于,1mgCO,2,来计算种子在呼吸时放出的,CO,2,mg,数。,呼吸强度（,mgCO,2,g,-1,FW,s,-1,）,=1 mgCO,2,(v0-v1),W,-1,t,-1,式中，,W,为样品的质量（克），,t,为呼吸持续的时间（秒）,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,五、实验作业,1.,影响呼吸强度的因素有哪些？,2.,为什么用草酸滴定而不用盐酸或硫酸滴定？,3.,根据你的实验结果，计算出水稻种子的呼吸强度（单位用,mgCO,2,g,-1,FW,h,-1,表示）,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,实验六,种子活力的快速测定,氯化三苯基四氮唑,(TTC),法及红墨水法,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,一、实验目的、原理,实验目的,熟悉氯化三苯基四氮唑,(TTC),法及红墨水法测定种子活力的方法及其计算,。,【,实验原理,】,凡有生活力的种胚在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生活力的种胚则无此反应。当,TTC,溶液渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶,(NADH2,或,NADPH2),还原时，可产生红色的三苯基甲,(TT,),，胚便染成红色。当种胚生活力下降时，呼吸作用明显减弱，脱氢酶的活性亦大大下降，胚的颜色变化不明显，故可由染色的程度推知种子的生活力强弱。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,二、材料、仪器设备及试剂,1,仪器 培养皿,2,套；镊子,1,把；单面刀片,1,片；垫板,(,切种子用,)1,块；烧杯,1,个；棕色试剂瓶；解剖针,1,把；搪瓷盘,1,个；,PH,试纸。,2,试剂,TTC,溶液的配制：取,3g TTC,溶于,1L,蒸馏水或冷开水中，配制成,0.1,的,TTC,溶液。药液,PH,应在,6.5,7.5,，以,PH,试纸试之,(,如不易溶解，可先加少量酒精，使其溶解后再加水,),。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,三、实验步骤,1,将水稻新种子、陈种子或死种子，用温水,(30),浸泡,2,6H,，使种子充分吸胀。,2,随机取种子,2,份，每份,200,粒，沿种胚中央准确切开，取每粒种子的一半备用。,3,把切好的种子分别放在培养皿中，加,TTC,溶液，以浸没种子为度。,4,放入,30,35,的恒温箱内保温,30Min,。也可在,20,左右的室温下放置,40,60Min,。,5,保温后，倾出药液，用自来水冲洗,2,3,次，立即观察种胚着色情况，判断种子有无生活力。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,四、注意事项,1,TTC,溶液最好现用现配，如需贮藏则应贮于棕色瓶中，放在阴凉黑暗处，如溶液变红则不可再用。,2,染色温度一般以,25,35,为宜。,3,判断有生活力的种子应具备的特征：胚发育良好、完整、整个胚染成鲜红色；子叶允许有小部分坏死，但其部位不是胚中轴和子叶连接处；胚根尖虽有小部分坏死，但其他部位完好。,4,判断无生活力的种子应具备的特征：胚全部或大部分不染色；胚根不染色部分不限于根尖；子叶不染色或丧失机能的组织超过,1,2,；胚染成很淡的紫红色或淡灰红色；子叶与胚中轴的连接处或在胚根上有坏死的部分；胚根受伤以及发育不良的未成熟的种子。,5,对于不同作物种子生活力的测定，所需试剂浓度、浸泡时间、染色时间不同。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,红墨水染色法,【,实验原理,】,有生活力的种子其胚细胞的原生质具有半透性，具有选择吸收外界物质的能力，某些染料如红墨水中的酸性大红,G,不能进入细胞内，胚部不染色。而丧失活力的种子其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收的能力，染料进入细胞内使胚部染色，所以可根据种子胚部是否染色来判断种子的生活力。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,仪器与试剂,仪器,与,TTC,法相同,试剂,红墨水溶液的配制：取市售红墨水稀释,20,倍,(1,份红墨水加,19,份自来水,),作为染色剂。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,实验步骤,1.,先将待测种子用水浸泡,3,4H,，待充分吸胀后取出一部分种子，在沸水中煮沸,3,5Min,，作为死种子。,2.,取浸好的新种子、陈种子和死种子各,50,粒，如为小麦和玉米，则用单面刀片沿胚部中线纵切成两半，其中一半用于测定。,3.,将准备好的种子分别放在培养皿内，加入红墨水溶液，以浸没种子为度。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,4.,染色,10,20Min,后倾出溶液，用自来水反复冲洗种子，直到所染颜色不再洗出为止。,5.,对比观察冲洗后的新种子、陈种子和死种子胚部着色情况。凡胚部不着色或略带浅红色者，即具有生活力的种子，若胚部染成与胚乳相同的红色，则为死种子。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,思考题,TTC,法和红墨水测定种子生活力有何不同？,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,实验七,丙二醛含量的测定,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,一、实验目的、原理,实验目的,熟悉叶片中丙二醛（,MDA,）的测定方法及其计算。,实验原理,植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（,MDA,）是膜脂过氧化作用的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。丙二醛在酸性和高温条件，可以与硫代巴比妥酸（,TBA,）反应生成红棕色的三甲川（,3,5,5,三甲基恶唑,2,4-,二酮），在,532nm,处有最大光吸收，在,600nm,处有最小光吸收，该复合物的吸光系数为,155,，可按公式：,A532,A600=155000CL,算出,MDA,浓度,C,（,mol/L,），进一步算出单位重量鲜组织中,MDA,含量（,mol/g,）。式中，,A 532,和,A 600,分别表示,532 nm,和,600 nm,处的吸光度值。,L,为比色杯厚度（,cm,）。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,需要指出的是，植物组织中糖类物质对,MDA-TBA,反应有干扰作用。为消除这种干扰，经试验，可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。,C,（,mol/L,）,=6.45,（,A532,A600,）,0.56 A450,式中：,A 450,、,A 532,和,A 600,分别表示,450 nm,、,532 nm,和,600 nm,处的吸光度值。算出植物样品提取液中,MDA,的浓度后，可进一步算出其在植物组织中的含量。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,二、材料、仪器设备及试剂,1,实验材料 植物的根或叶片,2,实验试剂,5%,三氯乙酸（,TCA,）,0.6%,硫代巴比妥酸（,TBA,）溶液：称取硫代巴比妥酸,0.6g,溶于,5,TCA,溶解并用其定容至,l00mL,。,3,实验仪器,研钵，恒温水浴锅，分光光度计，离心机，天平，刻度试管，移液管,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,三、实验步骤,1.MDA,的提取 称取植物材料,1 g,，剪碎，加入,2 mL 5%TCA,和少量石英砂，研磨至匀浆，再加,8 mL TCA,进一步研磨，匀浆在,4000 r/min,离心,10 min,，上清液为样品提取液。,2.,显色反应和测定 吸取离心的上清液,2 mL,（对照加,2 mL,蒸馏水），加入,2 mL 0.6%TBA,溶液，摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸,10min,（自试管内溶液中出现小气泡开始计时），取出试管并冷却，,3000 r/min,离心,15 min,，取上清液并量其体积。以,0.6,TBA,溶液为空白测定,532nm,、,600nm,和,450nm,处的吸光度值。,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,实验作业,1,、计算：,MDA,含量,(mol/g)=(MDA,浓度（,umol/L,）,提取液体积（,ml,）,)/,样品鲜重（,g,）,/,1000,2,、比较衰老叶片与细嫩叶片,MDA,含量有什么不同并说明原因？,生命科学系生物科学实验教学中心,上 饶 师 范 学 院,