中药制剂分析1、2.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第一节 概 述,一、含量测定的定义和意义,中药制剂的含量测定是指用适当的化学方法或仪器分析方法对制剂中某种（些）有效成分或有效部位进行的定量分析。并以其测定结果是否符合药品标准的规定来判断药品的优劣，是控制和评价药品质量的重要方法。,二、含量测定特点,1、与化学药制剂含量测定的差别,中药制剂 成分复杂,西药制剂 成分单一,2、定量方法以仪器分析方法为主,药材及饮片551个品种中，有281个建立了含量测定，其中采用HPLC等仪器分析方法的为217个，占总数的77%,植物油脂和提取物31个品种中，有22个建立了含量测定，采用HPLC等仪器分析方法的为17个，亦占总数的77%,成方制剂及单味制剂564个品种中，有438个建立了含量测定，采用HPLC等仪器分析方法的为412个，占总数的94%。,收载对照品,282,个，其中新增对照品,90,个,收载对照药材,218,个，其中新增对照药材,69,个,收载对照提取物,11,个，其中新增对照提取物,6,个,强调中医药理论的整体观念，突破单一,成分控制质量的模式，采用多成分或特,征色谱峰群综合控制质量的方法。,四、指标成分的选择,有效成分,苦参HPLC测定氧化苦参碱和苦参碱的总量，更具合理性。,护肝片，其处方中主要保肝降酶药为北五味子，测北五味子特征性有效成分五味子醇甲，专属性和有效性均得以提高。,特征性成分,山茱萸2000年版以前采用TLCS测定熊果酸含量，原含测指标专属性不强。,用HPLC测定山茱萸的特有成分马钱苷。,第二节 含量测定方法,一、浸出物测定,（一）定义,浸出物测定法系根据制剂中化学成分的,溶解性，选择适当的溶剂浸提(提取)样品，并,测定浸出物（提取物）的含量，以此来控制药,品的质量。,（二）意义及方法,意义,这是一种较为粗略的定量分析方法。但对于有效成分不明确或无法建立确切的定量分析方法的中药材及其制剂，尚具有一定的意义。,方法,中国药典附录收载了三种测定方法：水溶性浸出物测定法、醇溶性浸出物测定法和挥发性醚浸出物测定法。,类别,品名,溶剂,方法,限度（%）,醇溶性浸出物测 定,七厘散,乙醇,热浸法,60.0,刺五加浸膏,甲醇,热浸法,60.0,刺五加片,甲醇,热浸法,80mg/片,儿康宁糖浆,正丁醇,3.0,独一味胶囊,正丁醇,8.0,鼻窦炎口服液,正丁醇,1.2,挥发性醚浸出物测定,午时茶颗粒,乙醚,0.35,沉香化气丸,乙醚,0.40,乙醚,0.10,九味羌活丸,乙醚,0.30,龟龄集,乙醚,0.25,水浸出物测 定,暑症片,冷浸法,25.0,乙酸乙脂浸出物测定,挥发性醚浸出物测定法,测定法,取供试品（过四号筛）2-5g，置五氧化二磷干燥器中，干燥12小时，精密称定重量（m,s,）,置索氏提取器中，加乙醚适量，除另有规定外，加热回流提取8小时，取乙醚液，置干燥至恒重的蒸发皿中，放置，挥去乙醚，残渣置五氧化二磷干燥器中，干燥18小时，精密称定（m,1,），缓缓加热至105，并于105干燥至恒重（m,2,）。其减失重量即为挥发性醚浸出物的重量（m,1,-m,2,）。计算，即得。,含量（W/W%）=,100%,实例,九味羌活丸的挥发性醚浸出物测定,本品由羌活、防风、苍术、细辛、川芎、白芷、黄芩、甘草、地黄等九味中药组成，其主要有效成分为挥发油，故测定其中挥发性醚浸出物的含量。,二、化学分析法,重量分析法,滴定分析法,三、可见紫外分光光度法,1、单波长光度法,（1）吸收系数法,原理,方法,确定吸收波长,确定吸收系数,用不同型号的紫外-可见分光光度计测定同一条件配制的同一浓度对照品溶液的A值，计算相应的E值,在测定条件下，在浓度线性范围内配制35个不同浓度的对照品溶液测定各自的A值，计算E值。,（2）对照法,在同样条件下配制标准溶液和样品溶液，在选定波长处，分别测量吸光度：,酸性染料比色法测定痹痛消膏中乌头生物碱的含量,试剂 乌头碱对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号110720200410)。,03 molL硫酸溶液、25 浓氨水、无水醋酸、醋酸,钠、,溴甲酚绿、三氯甲烷、,乙醚、无水乙醇等均为分析,纯。蒸馏水(自制),pH 30醋酸盐缓冲液：称取无水醋酸钠015 g，加水使,溶解，加冰醋酸56 mL，用水稀释至500 mL，摇,匀，并在pH计上校正；,01 溴甲酚绿溶液：取溴甲酚绿02 g，加005 mol,L氢氧化钠溶液32 mL使溶解，用水稀释200mL，,摇匀。,对照品溶液的制备精密称取经105干燥至恒重的乌头碱对照品119 mg，置100 mL量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL中含乌头碱0119 mg)。,标准曲线制作,精密吸取对照品溶液0，100，200，,300，400，500，600 mL，分别置分液漏斗,中，依次加入三氯甲烷至100 mL，再加入pH 30,醋酸盐缓冲液100mL和01溴甲酚绿溶液20mL，,强力振摇5 min，静置10 min，分取三氯甲烷层，水层再用,三氯甲烷提取2次，每次5 mL，用干燥滤纸过滤，滤液用分,光光度计，分别在415 nm的波长测定吸光度。以吸光度为,纵坐标，乌头碱含量为横坐标，绘制标准曲线。直线回归得,回归方程Y=10463 X一0004 8，r=0999 3。乌头,碱量在01190714 mg范围内线性关系良好。,供试品溶液制备 取本品约25 g，精密称定，加入125 g,无水硫酸钠破乳，加入三氯甲烷100 mL和浓氨水1 mL，超,声提取20 min，过滤,减压蒸馏至干，放冷；用03 mol,L硫酸溶液提取4次，每次10mL，分取硫酸液，过滤，合并,滤液，置另一分液漏斗中，加浓氨水约10mL，摇匀，用三,氯甲烷提取4次，每次10 mL，分取三氯甲烷液，过滤，合,并滤液，回收溶剂至干，残渣于105加热1 h，取出，放,冷，加三氯甲烷分次溶解，转入分液漏斗中，照标准曲线制,备项下的方法，自“加入pH30醋酸盐缓冲液100 mL”,起，依法制备，即得。,pH是本实验测定结果准确与否的重要因素。,在样品溶液制备过程(超声提取和萃取)，pH值,影响样品中乌头碱的游离及有机层溶解度,在酸性染料显色时，缓冲溶液维持此过程中pH,值的稳定性起到重要的作用，使没有与乌头碱结合,的溴甲酚绿能够稳定地溶解在水层中，确保结果的,稳定，因此，实验所使用的缓冲溶液配制必须严,格、准确,2、计算分光光度法,（1）双波长法,两组分吸收光谱完全重叠混合样品测定,解线性方程组法,等吸收双波长消去法,数倍率法,在多组分样品中，各组分的吸收峰位置、强度等紫外光谱特征不同，使得在测定某一组分可能相互干扰。,A,2,1,A,2,1,A,2,1,等吸收双波长法,2,1,基本原理：,b,a,双波长法,等波长选择的基本条件：,干扰组分在这两个波长应具有相同的吸光度；,待测组分在这两个波长处的吸光度差值应足够大,A,1,干扰物,待测物,A,2,等吸收双波长分光光度法同时测定芦荟中芦荟大黄素和芦荟甙,芦荟大黄素,在255 nm处有一特征吸收峰，在芦,荟甙谱图上可得该波长等吸收点为376 nm，此波,长芦荟大黄素吸收值很小，满足,A较大的要求；,芦荟甙,在355 nm处有吸收峰，芦荟大黄素等吸收,波长为475 nm。,故选定芦荟大黄素的测定波长为255 nm，参比波,长为376 nm；芦荟甙的测定波长为355 nm，参,比波长为475 nm。,实验方法在1O mL容量瓶中依次加入50 10,-2,molL 三乙醇胺010 mL，01 molLK,2,HPO,4,一,KH,2,PO,4,缓冲液2.00 mL，1 Tween一80溶液1.00 mL，,芦荟大黄素操作液适量，以水稀释至刻度，摇匀，用1 cm,石英比色皿于255，376 nm波长处以试剂空白为参比测定,光密度(D)，令,D,1,=D,255nm,一D,376nm,。芦荟甙方法同,上，但测定波长是355，475nm，,D,2=,D,355nm,D,475nm,。,（2）三波长法,原理 当干扰吸收曲线上有三点成线时可用三波长法消除干扰。,三波长法,A,1,max,2,m,n,A,Q,B,D,C,E,F,G,H,A,三个波长的选择,三个波长的选择 首先应满足待测,A值最大，应选待测最大吸收峰处的波长。,选择方法 以待测组分的最大吸收波长为测定波长,2，选择组合波长,1、3，使三者在干扰组分曲线上呈一直线，或使干扰组分的,A为零。,三波长分光光度法测定清热解毒合剂中黄芩苷含量,清热解毒合剂由黄芩、金银花、蝉衣等数味中药组成，具有清热解毒的功效，主要用于治疗流感、腮腺炎、上呼吸道感染及各种发热疾病,测定波长选择,按作图法及计算法任选干扰组分(阴性对照品溶液),的最大吸收波长258.0nm为,1,，对照品溶液的,最大吸收波长278.3 nm为,2,，求得粗略波长为,3,302 nm，,按,A=A,2,-(,3,-,2,)A,1,+(,2,-,1,)A3/,(,3,-,2,)+(,2,-,1,),计算，求得使干扰组分,A值,为0的A,3,对应波长,3,为303.0nm。,标准曲线制备,精密量取浓度为0.496 mgml的对照品溶,液0.4，0.5,0.8，1.0，2.0，4.0，5.0,ml，分别置50 ml量瓶中，加50 乙醇至,刻度，摇匀。以50 乙醇为空白，分别在,258.0，278.3，303.0 nm波长处测定吸收,度，以,A值和浓度c进行回归计算，得回归,方程,三波长分光光度法测定芹菜叶中黄酮的含量,用作图法确定出三个测定波长分别为,1=460nm、,2=420nm、3=380nm，在测定波长处，分别测,定用l的三氯化铝溶液定容过的黄酮溶液的吸光度值，给出A值并计算出相应的浓度值。,3、差示光谱法,原理：利用同样浓度与配制方法的供试液，用不同的方法处理两份供试液（如一份加碱或不加，另一份加酸）使两者吸光度发生差异，以消除其它成分的干扰。,差示比色法测定润肠胶囊中游离羟基蒽醌的含量,测定波长的选择,精密量取大黄酸对照品甲醇溶(01mg/mL)1mL,2份，供试品溶液10mL 2份，空白制剂溶液(不含,何首乌、芦荟，与供试品同法处理)10 mL 2份，分,为2组，于水浴蒸干后一组精密加入1%醋酸镁甲,醇溶液10 mI，另一组精密加入甲醇10 mL；以,1%醋酸镁甲醇溶液为空白，于400-600 nm波长,范围扫描，得UV光谱图。,对照品、供试品1醋酸镁甲醇溶液在(5162)nm波长处均有最大吸收；供试品甲醇溶液、空白制剂的甲醇溶液及其1%醋酸镁甲醇溶液在(5162)nln波长处仅有微弱吸收，其吸收光谱在此处重叠，对照品甲醇溶液在此处无吸收。故以1%醋酸镁甲醇溶液为显色剂516 nm为测定波长,含量测定,取3批样品内容物各4 g，精密称定，处理得供试品,溶液备测；精密量取供试品溶液10 mL 2份，于水,浴蒸干，一份精密加入1%醋酸镁甲醇溶液10mL，,另一份精密加入甲醇1O mL，以1%醋酸镁甲醇溶,液为空白，于516 nm波长处分别测定吸收度，将,两者吸收度差A代入标准曲线方程，计算游离羟,基蒽醌含量(按大黄酸计)。,4、导数光谱法,原理 物质的吸收光谱具有加和性，样品的吸收光谱可看成是被测物质与干扰物组成的一元多次方程组,A=f(,n,),=a1,n,+a2,n-1,+an,通过进行微分计算，可消除方程中的常数项，以达到消除干扰的目的。,导数光谱法,A=,CL,零阶,一阶,二阶,三阶,四阶,计算方法,切线法,峰谷法,峰零法,操作步骤,（1）分别测定绘制待测组分与干扰组分的吸收曲线，根据干扰组合分在待测组分吸收峰附近所呈现的曲线形状确定微分光谱的阶数。,（2）绘制待测组分及干扰组分的导数光谱，确定计算方式及测定波长。,（3）绘制标准曲线,（4）测定样品,一阶导数光谱法测定导电凝胶中苯酚的含量,吸收光谱的绘制,精称苯酚09959g，加水使溶解，并定量稀释成,浓度为298770ug/ml 的溶液。另按处方比例配,制其他成分的水溶液，以水为空白，于200,400nm波长范围内对上述4种溶液分别进行扫描。,并绘制一阶导数光谱图。从图中可见，苯酚在,279nm波长处有峰零振幅值，一阶导数光谱法能消,除其他成分对其含量测定的扰。,样品测定,精密吸取样品液1ml，置于100 ml量瓶中，,加水稀释至刻度后摇匀。以水为空白，于,279 nm波长处，用一阶导数光谱法测定D,值，代人回归方程，即可计算出浓度,二阶导数紫外光谱法测定双黄连口服液中总绿原酸的含量,紫外扫描光谱及波长的选择,分别称取绿原酸对照品、量取双黄连口服液及阴性,对照液适量，用蒸馏水溶解和稀释成适宜浓度，制,成双黄连对照液(a液)，绿原酸对照液为(b液)，双,黄连阴性对照液(e液)在200400 nm范围内扫,描。由图可见，e液对a液的干扰很大，无法直接,通过紫外分光光度法测定总绿原酸的含量。,二阶导数光谱,由图2可见双黄连阴性对照液在35003805,nm波长之间的振幅与零线基本重合，而双黄连口服,液(a液)的二阶导数图谱，于3579 nm波长处有,最大振幅，与绿原酸对照液为(b液)相一致因此，因,此可选择357 9 nm为测定波长，利用双黄连口服,液在3579 nm处的(峰一零)振幅值D对总绿原酸,进行定量测定(以绿原酸计)。,三阶导数光谱法测定紫杉肽中紫杉醇的含量,紫杉醇、紫杉肽及聚二肽的紫外光谱,将紫杉肽、紫杉醇及聚二肽用甲醇水(1:1)溶解并稀释,成适当浓度后，在200400 nm扫描(图1)。由图1可知，,230 nm处紫杉醇有最大吸收，紫杉肽有肩峰吸收，聚二肽,有微量吸收。如果直接在230 nm处测定紫杉肽的含量，则,因 为聚二肽的干扰，导致含量测定结果偏高。如果以聚二肽,为空白，虽可消除影响，但不同批号产品中聚二肽与紫杉肽,中结合率有一定差异。因此，不能采用以聚二肽为空白直接,用uv法测定紫杉肽中紫杉醇的含量。,紫杉醇、紫杉肽及聚二肽的三阶导数光谱,以甲醇一水(1:1)为溶剂，分别测定紫杉肽、紫杉,醇及聚二肽的三阶导数光谱(图2)。由图2可知，在,三阶导数光谱中，聚二肽242nm的峰值为110,-4,，256 nm的峰值为0。因此，可利用三阶导数光,谱法消除聚二肽干扰，用峰一零法测定紫杉醇的含,量。,三、薄层扫描法,1、基本原理,薄层扫描法是指用一束一定波长、一定强度的紫外或可见光对薄层板进行扫描，测定薄层板上的样品斑点对光的吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度，所得到图谱及积分数据可用于药品的鉴别、检查及含量测定。Kubelka-Munk方程是薄层扫描法定量的依据。,一强度为I的光照射薄层时，被照射的一面为“近表面”，另一面为“远表面”。,近表面,远表面,光（,I,）,镜反射或表面反射I,s,(表面平滑),漫反射,(表面粗糙),入射强度I,0,出射强度(I,T,),I,T,/I,0,为薄层透射率A,T,返回光强(I,R,),I,R,/I,0,为介 质的漫反射率A,R,I,0,-（I,R,+,I,T,）=差为被介质吸收并转换为热的光强,在采用反射式吸收法测定时，入射光照射到薄层板上，一部分光透射过薄层板，一部分光发生反射，此外还有大量的散射光。因此，薄层扫描定量不遵从于Lambert-Beer定律，其样品量与反射光强度符合Kubelka-Munk方程：,(1-R)2/R=2.303C/S,其中R为反射光强，为样品吸收系数,C为样品浓度，S为薄层板散射系数,吸光度,1.0,0,物质量,经变换后的直线,理论曲线,直线化方法示意图,校正过度,校正适当,校正不足,未校正,试样量,积分值,校正情况判断,在岛津CS系列薄层扫描仪上，有线性补偿器（Linarizer），它可依据Kubelka-Munk方程用电路系统将的曲线校正为直线后用于定量。,CAMAG等薄层扫描仪则可使用二次方程曲线表达样品量与反射光强度之间的关系，进行定量测定。,2、分类,按照扫描方式的不同，薄层扫描法可分为吸收法与荧光法。,薄层定量方法可分为,直接法测定照射光照射色谱后，因被测物斑点的存在引起的,透射光,和,反射光,的变化。并通过随行标准比较待测斑点的量。,间接法将部分照射光的能量转换成较长波长的荧光，即,荧光,测量。,薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量斑点和薄层空白处光学响应信号的差值,光学系统,薄层色谱扫描仪光学系统有三种,单光束单波长受光源稳定性和薄层质量影响严重。,单光束双波长对背景不均匀引起的干扰有补偿作用，选择的两个波长应接近些。,双光束单波长可补偿光源不稳引起的误差，但对板层不均匀无作用。,光,单色器,检测器,光,波长1,波长2,检测器,斩波器,光,单色器,分,光,镜,检测器,检测器,透射光法,测定组分对应的斑点对特定波长光的吸收度来确定含量。将薄层板从左至右移动，对斑点扫描，单色光透过薄层板后被记录下来，将测得的吸收度对Rf值绘制扫描曲线，得薄层色谱图,光源,单色器,反射光法,一定波长的光照射薄层，穿进薄层内的光部分被薄层吸收，部分经过漫反射又折回表面成为反射光。当对薄层进行扫描时，测量其反射吸收度，可得到反射光谱。反射吸收度与物质含量有确定关系，可进行定量。,光源,单色器,扫描方式,直线式扫描照射在薄层板上的光束与薄层板作直线相对运动。光束固定，扫描板台运动。光束落在薄层上的截面为一长方形带。,锯齿式扫描照射在薄层板上的光束与薄层板的相对运动轨迹呈锯齿形或矩形。,直线扫描,锯齿扫描,轮廓曲线,积分曲线,线性扫描时一般采用一束比待测斑点略宽的狭窄光带沿展开方向做单向等速扫描，它适于形状较规则斑点的扫描。,锯齿扫描使用的微小正方形光束在沿展开方向运动的同时，在垂直于展开方向也进行往复扫描，扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿形或矩形，它对于形状不规则或浓度分布不均匀的斑点扫描重复性较好，但扫描速度较慢。,斑点,斑点,A,B,C,A,B,C,C,A,B,对于不规则斑点，两种扫描结果不一样。同一斑点从A、B、C三个不同方向扫描，锯齿扫描所得积分值变动小，而直线扫描所得积分值变动大。,3、测量方式,吸光度测量测定的是,漫反射光,。适合于本身有颜色或有紫外吸收的物质。,I,0,I,R,检 测 器,荧光测量灵敏度较吸光度测量高，板层不吸收发射光，测量噪音小，基线稳定。为消除激发光的影响，在板层和检测器之间必须加一块滤光片，以截去反射激发光，只让发射的荧光抵达检测器。,滤光片,荧光,检 测 器,荧光淬灭测量吸附剂有荧光，样品斑点无荧光，在紫外光照射下，被测物在荧光背景上显示出暗灰斑点。本法适合于本身无颜色，又无特征紫外吸收或荧光的物质。该测量技术有三种形式：,测荧光,测紫外光,测紫外和荧光,4、定量分析方法,步骤：制作工作曲线,检查所选择的散射参数是否适宜,考察工作曲线是否过原点,确定点样量的线性范围,定量方法,（1）外标法,要求：点样量准确,有随行标准,。,外标一点法 工作曲线通过原点时使用,C=F,1,*A,外标二点法 工作曲线不通过原点时只能用此法。使用两不同浓度的标准溶液,C=F,1,A+F,2,含量测定时供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上，供试品点样不得少于4个，对照品每一浓度不得少于2个,薄层扫描法测定亮舒片中齐墩果酸的含量,测定波长的选择,取齐墩果酸对照品溶液(0.5mgml)以及样品液各0.5ul，,分别点于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干；浸于10,硫酸乙醇溶液中，取出，晾干，在100,。,C加热至斑点清,晰，取出，照薄层色谱法于波长530nm处进行扫描；选定,样品色谱中与对照品相对应的斑点，分别进行光谱扫描，结,果二者在530nm处均有最大吸收，在70Onm处吸收最小。,因此确定扫描波长为：,S,=530nm，,R,=700nm。,线性范围的考察,精密吸取齐墩果酸对照品溶液(0.5mgm1)0.5、,1、2、5、6 ul点于同一薄层板上，层析，显色，,扫描。记录色谱图，测定其吸光度积分值，并以吸,光度积分值(A)对点样量(ug)进行回归，得标准线,方程为：Y=21757x十20773r=09970。,以吸光度积分值(A)对点样量(g)作图，得一直线,样品含量测定,取三批中试样品(批号1、2、3)，照拟定的,方法，制备样品供试液。精密吸取供试品液,0.5ul，对照品液1ul 和3ul，交叉点于同,一硅胶G薄层板上，层析、显色、扫描，测得,吸光度积分值，计算含量，,（2）内标法,对内标物要求,：,a内标物须为原样品中不含组分,b内标物与待测物保留时间应接近且R1.5,c内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质,四、高效液相色谱法,（一）基本原理,（二）方法的建立,选定色谱柱的类型,确定流动相的配比,确定检测器的种类,确定洗脱方式,样品的处理方法,（三）常用方法,化学键合相色谱法（BPC）,化学键合相,反相键合相色谱,正相键合相色谱,离子对色谱和离子抑制色谱,1、化学键合相,利用化学反应将固定液的官能团键合在载,体表面,分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）,特点：,1）不易流失,2）热稳定性好,3）化学性能好,4）载样量大,5）适于梯度洗脱,反相键合相色谱,1分离机制：疏溶剂理论,正相流动相与溶质排斥力强，作用时间,k，组分t,R,反相流动相与溶质排斥力弱，作用时间，,k，组分t,R,2固定相：极性小的烷基键合相,C,8,柱，C,18,柱（ODS柱HPLC约80%问题）,3流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水,流动相极性 固定相极性,底剂+有机调节剂（极性调节剂）,例：水 +甲醇，乙腈，THF,4流动相极性与k的关系：,流动相极性，洗脱能力，k，组分t,R,5出柱顺序：极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱,6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）,正相键合相色谱,1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、,诱导力、或氢键作用力,2固定相：极性大的氰基或氨基键合相,3流动相：极性小（同LSC）,底剂 +有机极性调节剂,例：正己烷 +氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,4流动相极性与k的关系：,流动相极性，洗脱能力，组分t,R,，k,5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱,6适用：,氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）,分离物质也相似,氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性,分析极性大物质、糖类等,离子对色谱和离子抑制色谱,1反相离子对色谱法（IPC或PIC）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试,剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离,子对，增加k和t,R,，以改善分离,1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱,四丁基季胺盐分析酸,2）影响k的因素,a与m的极性有关（同反相色谱）,b与R的链长有关：R长，极性小，t,R,，k,3）适用：较强的有机酸、碱,2反相离子抑制色谱,在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动,相pH值，抑制组分解离，增加其k和t,R,，以,达到改善分离的目的,1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质,pH一定的缓冲溶液,2）k的影响因素,：,与流动相极性有关，还与pH值有关,选择流动相：应同时考虑极性及pH值,酸性物质加入酸HAc t,R,，k,碱性物质加入碱NH,3,H,2,O t,R,，k,调节pH范围：3.08.0,pH8.0 破坏键合相与载体的结合,pH3.0 腐蚀柱子,3）适用：极弱酸碱物质,pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物,实验过程,一：色谱条件的摸索,二：提取条件的摸索(供试品溶液制备条件),三：阴性干扰实验,四：方法学考察,五：稳定性考察,1:检测波长的选择,检测波长可以参考文献资料,也可以在DAD检,测器上找出.方法是进一针对照品溶液,得到,其色谱图和光谱图.,阿魏酸色谱图,阿魏酸光谱图,2:流动相条件的摸索:甲醇水(酸水),乙腈-水(酸水)，至少比较三种流动相条件,使用最好的那种.,酸水可以是磷酸,醋酸,甲酸等,碱水可以是三乙胺,二乙胺等,流动相的pH在 3 8 就比较保险,必要时用酸度计测定流动相酸度.,加酸碱如果不能解决问题可以换用盐体系,比如磷酸二氢钾等磷酸盐(盐体系对仪器和色谱柱的危害比较大,最好不用),好的流动相条件以所需色谱峰保留时间在10 到16分钟为好,色谱峰必须和前后的缝分离完全(B-B),3:,色谱柱和液相仪器的比较,如果流动相条件的摸索不能使色谱峰达到良,好分离,则需要比较不同的色谱柱,色谱柱对,分离的影响是非常大的,占到了分离影响因素,的50%以上.仪器也可能会有影响.,二：供试品溶液制备条件的摸索,1:比较超声,回流和索氏提取,比较的标准是看所,需色谱峰的面积是否有显著性差异,选取面积最大的,提取方法,2:如果色谱峰分离不好.必要时要用到过层析柱的,方法.以减少样品中杂质的量,但是必须考虑到做加,样回收时的回收率.,3:在选定了提取方法的基础上,比较提取溶,剂.可以参考文献资料比较几种溶剂或是混合,溶剂的比例.选取提取效率最高的溶剂作为提,取溶剂,超声提取,回流提取,供试品溶液制备条件的摸索实例,甲醇提取,乙醇提取,醋酸乙酯提取,氯仿提取,三：阴性干扰实验,中药制剂中要做阴性干扰实验,以排除其它药材或是辅料对,测定的影响,反相高 效液相色谱法测定伤湿气雾剂中丹皮酚含量,仪器与试剂,岛津LC-10A高效液相色谱仪；SPD-10A紫,外一可见分光光度检测器；SII，10A 自动,进样器；LC-10AD双泵；岛津一1601紫外,分光光度仪；N-2000双通道色谱工作站。,水为三次蒸馏水,样品预处理,吸取伤湿气雾剂1 mI 于tO0 mL容量瓶中，,加甲醇稀释至刻度，摇匀，用045 m微孔,滤膜过滤，再取适量样品溶液于样品瓶中，,备用。,色谱条件,检测波长为274 nm，Polaris C18色谱柱,(150 mmX46 mm id，5 um)，柱,温为3O；流动相为甲醇：水=45：55，流,速为10 ml/min。；进样量为10ul。,检测波长的选择,对丹皮酚对照品溶液，在200400 nm波长,之间进行线性扫描，结果显示，在274和,312 nm波长处有最大吸收，其中274 nm波,长处空白无干扰，选择检测波长为274nm。,流动相的选择,试验甲醇一水二元体系中甲醇含量与保留时间及样品分离情,况。试验结果：流动相中甲醇浓度在45 1OO 96(体积,分数，下同)时，随着甲醇浓度的减小，保留时间逐渐增,加；曲线通过模拟，得到方程t=2001 75+8808,76e一(n 45)1。128 3式中：t为保留时间；z为流动,相中甲醇浓度。当甲醇浓度大于5O 时，丹皮酚与样品中其,他组分的分离度均较小；甲醇浓度为45，丹皮酚与样品中,其他组分完全分开，分离度为32，理论塔板数为7 977，,保留时间为10815 min。,试验确定甲醇：水=45：55作为流动相的配比。,标准曲线的绘制,称取丹皮酚对照品21 mg，用甲醇溶解成,0021 gL 丹皮酚对照品溶液，分别吸取1，5，,10，15，20ul 于液相色谱仪中。以峰面积积分值,A对进样量X(g)进行回归，回归方程,A=一8 43068+2758 47l0,6,(r=0999 4)，进样量在0021ug-0420 ug之间呈线,性关系。,第三节 含量测定方法的考察,一、准确度,准确度系指用该方法测定的结果与真实值或,平均值接近的程度，一般用回收率（%）表,示。准确度应在规定的范围测试。用于定,量测定的分析方法均需做准确度验证。,1、测定方法的准确度,方法：取已知纯度的样品对照品，精密加于已知被,测成分含量的供试品中，经样品处理过程后，依法,测定含量。,C-A,回收率%=100%,B,C为实测值 A为供试品中被测物含量 B为加入对照,品量,注意 加样回收率试验中加入对照品量与供试品量之和应在标准曲线范围之内。加入量小，引起较大相对误差，过大，干扰成分相对减少，真实性差。,2、加样方式,（1）加入一种浓度对照品 取6份样品加入相同量对照品进行测定，对测定值进行计算。,（2）加入三种浓度对照品 分别取9份样品，每3份一组，每组加入高、中、低三个不同量的对照品，处理后进行分别测定。,一般中间浓度加入量与所用供试品中被测成分量相同，即1：1的比例。,二、精密度,系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试,品，经过多次取样测定所得结果之间的接近,程度。,精密度一般用偏差、标准偏差、相对标准偏差表示。,精密度包含重复性、中间精密度和重现性,重复性 在规定的范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果，或3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价。,中间精密度 考察由于不同时间、环境、人员等因素引起的误差。,重现性 指一个方法确定或被采用后，要对其进行多个实验室间的相同条件下的复核检验，结果应能重现。,三、专属性,专属性系指在其他成分可能存在下，采用方法能正确测定出被测成分的准确量，鉴别试验、限量检查、储量测定等方法均应考察其专属性,对含量测定方法和限量检查方法进行专属,性实验时可用阴性对照供试品进行检测。,四、检测限,是指供试品中被测物能被检测出的最低量，,信噪比法 适用于能显示基线噪声的分析方,法。即把已知低浓度供试品测出的信号与空,白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠,测出的最低浓度或量，一般以信噪比为3：1,或2：1时相应浓度或量确定检测限。,五、定量限,定量限是指供试品中被测万分能被宣测定的,最低量，其测定结果应具一定准确度和精密,度，用于限量检查的定量测定方法应确定量,限。,常用信噪比法法确定定量限。一般以信噪比,为10：1时相应浓度或注入仪器和量进行确,定,六、线性,是指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物浓度呈正比关系的程度。,七、范围,范围是指能达到一定精密度、准确度和线,性，测试方法适用的高低限浓度或量的区,间。,范围应根据分析方法的具体应用和线性、准,确度、精密度结果及要求确定。对有毒的具,特殊功效或药理作用的成分其范围应大于被限储量,的区间，溶出度或释放度中的溶出量测定，范围应,为限度的20%,八、耐用性,是指在测定条件有小的变动时，测定结果不,受影响的承受程度。,常见变动因素包括被测溶液的稳定性，样品,的提取次数、时间等。试剂的变化等。,在薄层层析中的温度、湿度等条件的影响等,薄层扫描法测定亮舒片中齐墩果酸的含量,1 层析相关条件的选择,薄层板的确定选择硅胶G板，并比较了手铺,板、市售青岛海洋板与德国Merk板，结果以,Merk板效果最好但价格昂贵，而手铺板不能,达到分离度的要求，因此选用市售硅胶G薄层,板。,展开条件的确定 比较了四种不同的展开系统，以待测斑点与相邻斑点的分离度作评价指标，选定环己烷一丙酮一乙酸乙酯(5：2：1)为展开剂，并以预吸附15min后再展开为佳。,温度与相对湿度的确定 比较了10以下与2O的展开环境温度，结果表明展开应在10,。,C以下；还比较了不同的展开相对湿度(RH)32、58、65、88，以相对湿度58 左右为佳。,显色剂及显色方式的确定 经实验表明，25 磷钼酸乙醇溶液显色背景较深，而5与10 的硫酸乙醇液显色效果相差不大，因此参考中国药典女贞子药材中测定齐墩果酸的方法，选取10硫酸乙醇液为显色剂；而采用喷雾显色可能造成显色不均匀，因此采取浸板的方式；显色温度在90、IO0C、105 时差别不大，但显色时间有所不同，故选取10&C烘至斑点显色清晰。,测定波长的选择,样品干扰性试验,线性范围的考察,提取方法的考察,回流提取法,超声提取法,提取次数的确定,取本品细粉约3g，共3份，精密称定，加乙醇,50ml，加热回流30min，分别提取1、2、3次，放,冷，滤过，依次合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇,微热使溶解，分别转移至10ml量瓶中，并加乙醇至,刻度，摇匀，以045um微孔滤膜滤过，取续滤液,作为供试品溶液。结果表明，取2次和3次，齐墩果,酸斑点大小和颜色相差不大，而均强于提取1次,的，故确定本品提取2次,提取时间的确定,取样品粉末3份，每份约3g，精密称定，加乙醇,50ml，加热回流，依次分别提取1O、20、30min，放冷，,滤过，药渣加乙醇同上，重复回流一次，合并滤液，蒸干，,残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至10ml量瓶中，并加乙,醇至刻度，摇匀，以045,ttm微孔滤膜滤过，取续滤液作,为供试品溶液。试验结果表明，提取1O、20、30min，齐,墩果酸斑点大小和颜色相差不大，从成分被提取完全和节约,能源综合考虑，确定提取时间为20min。,精密度试验,1、重复性实验,精密吸取同一供试品溶液05ul，平行点6,份于同一薄层板上，层析，显色，扫描，结,果齐墩果酸吸光度积分值分别为25489、,2768O、26586-,26588、26098,和26893，相对标准差(RSD)5，表,明方法重复性良好。,2、异板精密度实验精密吸取同一供试品溶,液05 ul，平行点6份于同一薄层板上，层,析，显色，扫描；用另一薄层板重复操作，,结果测得齐墩果酸吸光度积分值(n=12)的相,对标准差(RSD)5，表明方法精密度良,好,3、稳定性试验,精密吸取同一供试品溶液05ta，平行点6份于同,一薄层板上，薄层层析，显色后，同样大小的玻璃,板覆盖，周围用胶布固定，遮光保存，并分别于,O、05、1、2、3、4h扫描，测得样品中齐墩果,酸吸光度积分平均值分别为239460、2382、,24、259726、261928、26oo86、,261814，相对标准差(RSD)5，表明样品,供试液层析显色后，遮光保存在4h内稳定。,4、加样回收率试验,已知含量的样品粉末9份，精密称定，加入齐墩果,酸对照品，加乙醇50ml，加热回流20min，放,冷，滤过，药渣加乙醇同上，重复回流1次，合并,滤液，蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，转移至,2ml量瓶中，并加乙醇至刻度，摇匀，以O45um,微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密吸,取供试品溶液05u l及对照品溶液05ta和3 l，点,于同一薄层板上，按下式计算回收率,