中药制剂分析2.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,(二)拖尾现象,1产生之原因及克服方法,(1)点样量太多，展开剂不能全部负载。,克服方法：寻出合适之点样量后，再进行层析.,(2)展开剂pH值偏高。如以中性展开剂层析酸性物质时，常形成斑点拖尾。,克服方法；在展开剂中加入酸，使解离受到抑制，即可防止斑点拖尾。,(3)展开剂的pH值偏低。如以中性展开剂层析生物碱和其它弱碱时，常观察到斑点拖尾。,克服方法：在层析K值在10,-3,10,-8,的碱性化合物时，展开剂应调至碱性(如加入吡啶、二乙胺等)。,(4)吸附剂pH的影响。由于化合物与薄层上的酸、碱成盐而产生拖尾现象。,克服方法：换用pH合适的吸附剂或调整展开剂的pH，如加入酸或碱等。,(5)吸附剂和展开剂中痕迹量的金属离子(如Ca,2+,、Mg,2+,等)，使层析后的斑点形成拖尾。特别是被展开的化合物具有-COOH及酚-OH等基团时。,克服方法：采用纯净的酸来洗涤和处理吸附剂。展开剂可用精制的方法来除去金属离子。,(三)斑点形成念珠状,1.产生之原因及克服方法,(1)单一的化合物在层析过程中分解成二个或更多的化合物。因为这些化合物是十分相似的，因此Rf值也极相似，以致彼此重叠。,克服方法：设法防止在层析过程中化合物的分解。如控制pH值，防止水解等。,(2)同系物或异构体也因为他们的结构相似而彼此Rf值相近，产生斑点重叠。,克服方法：找出合适的层析方法，如采用“传荷层析”(或称络合层析)，可以按照化合物的不饱和度，双键位置，几何异构等情况，有效地选择结合，从而提供了因其结构的差别在层析板上出现不同的比移值。,(3)络合物的形成。,克服方法：加入8-羟基氮萘或HCN或其它络合剂。,(2)层析时间不恒定。,克服方法：在同一块薄板上，同一层析槽内，展至恒定的时间，立即取出。,(3)吸附剂规格不统一。,克服方法：使用同产地的吸附剂，并最好使用同一批号之产品，必要时，将各瓶均匀混合后再使用。,(4)展开剂的规格批号不一致。,克服方法：如出现斑点比移值不稳定的情况，并怀疑与展开剂有关时，必需亲自考查处理，如进行试剂中的水份含量测定等。,(5)所用之展开剂往往为多组分的混合展开剂、如配制后立即使用，常因相平衡的时间较短；或某些化学反应(如醇化等)尚未彻底进行，以致混合展开剂之组成尚未稳定，而导致斑点比移值不稳定。,克服方法：展开剂在配制后，应在层析温度下放置三天后方可使用。,(6)展开槽之规格不一致。,克服方法：应使用同一规格的展开槽。,(7)展开剂过多次数的重复使用，也会影响斑点比移值的稳定。,克服方法；新鲜配制的展开剂，最好只使用一次。,(8)其它如展开槽未刷净，未能彻底干燥即加入展开剂，以及展开剂保存不当等原因所引起，均应加以注意。,(六)斑点异形,1产生的原因及克服方法,产生斑点异形的原因很复杂，主要由于吸附剂的细度、活度不均，薄层板铺陈的厚薄不均等原因，有时在层析进行过程中，挪动展开槽或薄层板。,克服方法：注意上述情况，可以克服斑点异形。一般情况下，硅胶、氧化铝的粒度在200目左右为宜，活度一般在1级。使用前吸附剂应充分混合。,第三节 高效液相色谱法,一、,基本概念,1色谱流出曲线和色谱峰,1）色谱流出曲线 样品被流动相冲洗，,通过色谱柱，流经检测器，得到的信号-洗,脱时间曲线称为色,谱流出曲线（,色谱图）。,2）基线 检测器中只有流动相通过或虽,有组分通过而不能为检测器所检出时，给,色谱流出曲线,出的流出曲线称为基线。,噪音；漂移,3）色谱峰 流出曲线上的突起部分称,为色谱峰。正常色谱峰为对称形正态分,布曲线。不对称色谱峰有两种：拖尾峰,和前延峰。,色谱峰的对称性用对称因子(f,s,)来衡,量，中国药典称对称因子为拖尾因,子。对称因子可按左图由下式计算：,f,s,=W,0.05h,/2A=（B+A）/2A,f,s,=0.95 1.05为正常峰，,对称因子计算示意图,f,s,1.05为拖尾峰。,2定性参数,1）保留时间,保留时间(t,R,),死时间(t,0,)：在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。,调整保留时间(t,R,)：t,R,t,R,-t,0,在实验条件一定时，调整保留时间只决定于组分的性质。,2）保留体积,保留体积(V,R,)：V,R,=t,R,F,c,，F,c,为流动相的流速,死体积(V,o,)：,调整保留体积(V,R,)：,V,R,V,R,-V,o,或 V,R,t,R,F,c,3柱效参数,1）区域宽度 在一定实验条件下，区域宽度越大(峰越胖)，柱效越低；反之，则越高。区域宽度有下述三种表示方法：,标准偏差()：正常峰的标准偏差为峰高,0.607倍(0.607h)处的峰宽之半。标准偏差,的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散,程度。小，分散程度小、极点浓度高、峰,形瘦、柱效高。反之，大，峰形胖、柱效,低。,色谱峰的区域宽度示意图,半峰宽(W,h/2,)：W,h/2,2.355,峰宽(W)：通过色谱峰两侧的拐点作切线在基线上所截的距离，称为峰宽或基线宽度。,W=4；或 W1.699W,h2,2）理论(塔)板数与理论塔板高度,理论塔板数取决于固定相的种类、性质(粒度、粒度分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。,理论塔板数(n)：,n(t,R,/),2,；,n=5.54（t,R,/W,h/2,）,2,=16（t,R,/W）,2,n,有效,=(t,R,/),2,=5.54（t,R,/W,h/2,）,2,=16（t,R,/W）,2,理论塔板高度(H)：理论塔板高度定义为每单位柱长的方差，即 H=,2,/L,实际计算时往往用柱长L和理论塔板数计算：,H=L/n 或 H,有效,=L/n,有效,4相平衡参数,1）分配系数(K)K=C,s,/C,m,分配系数与保留时间的关系：,t,R,t,0,1+K（V,s,/V,m,）或 t,R,/t,0,=K（V,s,/V,m,）,分配系数与保留体积的关系：V,R,V,o,1+K（V,s,/V,m,）,2）容量因子(,k,)容量因子的定义式是：,k,=K（V,s,/V,m,），,k,=（C,s,V,s,）/（C,m,V,m,）=W,s,/W,m,。,t,R,t,0,（1+,k,）；t,R,k,t,0,3）选择性因子()相邻两组分的分配系数之比或容量因子之比称为选择性因子：=K,2,/K,1,=,k,2,/,k,1,或=t,R,2,/t,R,1,要使两组分得到分离，必须使选择性因子不等于1。,5分离参数,1）分离度(R)相邻两峰分开的距离与平均峰宽的比值称为分离度。R=（t,R2,t,R1,）/（W,1,+W,2,）/2,分离度的数值与相邻两峰分离状况的关系：,R1，称为4分离，两峰基本分开，,裸露峰面积为95.4。,R1.5，称为6分离。分离后各峰露出,分离度计算示意图,的面积为99.7。R1.5称为完全分离。,2）基本分离方程式,分离度的影响因素很多，可用基本分离方程式概括：,R=（n,1/2,/4）（-1）/,k,2,/（1+,k,2,）,(a)(b)(c),a项取决于柱效，柱效高(n大)，则a项大。b项与c项相关联，都与色谱柱及流动相性质有关，但b项主要取决于固定相和流动相的种类(极性)，而c项在流动相种类(包括元数)选定后，主要取决于流动相的配比，基本分离方程可用于指导色谱条件的选择。,首先是提高柱效，即增加理论塔板数。方法之一是增加柱长L；更好的方法是降低理论塔板高度。,其次是增加选择性，一般说来可以采取下列措施来改变选择性：改变流动相的组成；改变柱温；改变固定相。,改变容量因子常常是提高分离度的最容易的方法。这可以通过调节流动相的组成来实现。一般应使,k,2,在110的范围内，最好为25，窄径柱可更小些。,二、定量分析方法,HPLC定量分析的参数是色谱峰高和峰面积，定量依据是样品中组分的量(或浓度)与峰高或峰面积成正比。常用的定量方法有外标法、内标法和内加法。,1峰高和峰面积,正常峰面积：A=1.065W,h/2,h,不对称峰的面积可用平均峰宽来计算：,A1/2(W,0.15h,+W,0.85h,)h,一般说来，当分离度小或流量波动,时，常用峰高定量。当峰形不正或色谱,柱超负荷时，用峰面积定量。,各种色谱峰峰高示意图,2外标法,用与待测组分同质的标准品作对照品，以对照品的量对比求算试样含量的方法称为外标法。外标法是HPLC常用定量分析方法之一。,(1)外标工作曲线法：用对照品配制系列浓度的对照品溶液，准确进样，测量峰面积(A)或峰高(h)，对浓度C绘制工作曲线，利用此曲线或它的回归方程式计算样品溶液的含量。,A a+bC 或h a+bC,式中b与a分别为直线的斜率和截距。,(2)外标一点法：只有在工作曲线通过原点，即截距为零时，才可用外标一点法进行定量分析。外标一点法的计算公式如下：,C,样品,C,对照,A,样品,A,对照,峰形为正常峰时，式中的峰面积A可用峰高h代替。,3内标法,选择适宜的物质作为内标物，以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法称为内标法。内标法的关键是选择合适的内标物。内标法可以分为工作曲线法、内标一点法、内标二点法及校正因子法等。,(1)工作曲线法：在各种浓度的对照品溶液中加入相同量的内标,物。分别测量i组分与内标物s的峰面积A(或峰高h)，以峰面积比A,i,A,s,与C,i,绘制工作曲线，或求出回归方程式：,A,i,A,s,a+bC,i,(2)内标一点法：只有线性关系好且截距a为零时才可用内标一点法定量。,(C,i,),样品,（A,i,/A,s,）,样品,/（A,i,/A,s,）,对照,（C,i,）,对照,(3)内标校正因子法：被测组分单位峰面积所相当物质的量与 内标物单位峰面积所相当物质的量的比值。这是相对重量校正因子，简称校正因子。常自行测定，其测定方法是配制含有内标物的对照品溶液，在完全相同的实验条件下，进样510次，分别测定峰面积，代入下式求各组分的相对重量校正因子。,f,i,=（m,i,/A,i,）/（m,s,/A,s,）,式中m,i,与m,s,分别为待测组分与内标物的量；A,i,与A,s,分别为它们的峰面积。,用内标校正因子法进行定量分析时，准确称取m,s,克的内标物，加入样品内混匀，进样，则i组分与内标物重量间有下述关系：,m,i,/m,s,=（A,i,f,i,）/（A,s,f,S,）,如果样品量为m克，则i组分在样品中的百分含量为：,C,i,（A,i,f,i,）/（A,s,f,S,）（m,s,/m）100,4内加法 将待测组分i的纯品加至待测样品溶液中，测定增加纯品后的溶液比原样品溶液中i组分的峰面积增量，求算i组分的含量。,内加法定量分析计算公式,如下：,m,i,=（A,i,/A,i,）m,i,式中m,i,是纯物质i的加入量，A,i,是相应增加的峰面积。,三、,化学键合相色谱法,1,化学键合相色谱法的固定相,化学键合相按键合官能团的极性可分为极性和非极性键合相两种类型。,极性键合相主要有-CN、-NH,2,和二醇基键合相，,常用作正相色谱，混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分的保留值较大。,非极性键合相主要有烷基键合相(如C,8,、C,18,等)和苯基键合相，其中以C,18,键合相(ODS)应用最为广泛；通常都用作反相色谱，极性弱的组分的保留值较大。,pH值，一般来说，硅胶键合相应在pH=2-8的介质中使用。,2,化学键合相色谱法的分离条件选择,1)固定相的选择,分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相。,氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性；,氨基键合相具有较强的氢键结合能力，对甾体、强心甙等有较好的分离能力，同时氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用，,故被广泛应用于糖类的分析,；,二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。,分离非极性和极性较弱的化合物可选择非极性键合相，利用特殊的反相色谱技术，非极性键合相也可用于分离离子型或可离子化的化合物。,短链烷基键合相能用于极性化合物的分离，而苯基键合相适用于分离芳香化合物。,2)流动相的选择,正相键合相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂，通过调节极性调整剂的浓度来改变溶剂强度，使样品组分的,k,值在110范围内。,反相键合相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。一般情况下，甲醇-水、乙腈-水系统已能满足多数样品的分离要求，是反相键合相色谱最常用的流动相。,在采用键合相色谱法分离含极性差别较大组分的样品时，为了使各组分均有合适的,k,值并具有良好的分离度，也需采用梯度洗脱技术。,3)其它条件的选择,一般应控制流动相的pH值在28范围内。,分析弱酸样品时，通常往流动相中加入少量弱酸，常用50mmolL磷酸盐缓冲液和1醋酸溶液（pH,pKa-1或pHpKa+1同时采用离子对色谱）,；,分析弱碱样品时，通常往流动相中加入少量弱碱，常用50 mmolL磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液（pH,pKa+1或,pH,pKa-1同时采用离子对色谱）,。,四、样品的预处理,1液-液萃取分离(LLE)有机溶剂直接萃取法与离子对萃取法。样品萃取后需将溶液相过滤，加无水硫酸钠干燥、蒸发、浓缩、定容后才可使用。,2液-固萃取分离(LSE),(1)方法简介：本法是用液相色谱的原理来处理样品的一种方法。在一小柱中装上固体萃取剂，将样品上柱后，药物在柱上保留，用选好的溶剂清洗除去杂质后，再将药物从柱上洗脱下来。,(2)亲脂性键合相硅胶：C,18,是最常用的固体萃取剂，适用于萃取、纯化水基质体液中亲脂性药物。,使用亲脂性键合相硅胶LSE柱的一般程序为：,柱的活化，用2ml甲醇冲洗以润湿键合相除去杂质，再用0.5ml水冲洗除去柱中的甲醇。,加样，使样品流过柱子，,清洗，用25ml水清洗以除去弱保留的亲水组分。,洗脱，用25ml甲醇或甲醇-水洗脱大分子的肽、甾体、较亲脂的药物等强保留的待测组分。,(3)大孔吸附树脂,(4)亲水型填料：硅藻土、硅胶、棉纤维为常用的亲水型填料,（5）离子交换树脂,五、液相色谱的新进展,1胶束色谱,（1）,表面活性剂与胶束：当溶液中的表面活性剂超过一定的浓度(该浓度被定义为临界胶束浓度，即CMC)时，则会发生自聚，形成胶束。水溶液中形成的胶束为正相胶束，可用于反相色谱；非极性溶剂中则形成反相胶束，可用于正相色谱。,常用的表面活性剂为十二烷基磺酸钠，十六烷基三甲基溴化铵；聚氧乙烯(23)十二烷醇；丁二酸二辛酯磺酸钠。,(2)胶束色谱的基本公式：,V,s,/（V,R,-V,m,）=r（K,MW,-1）/K,SW,C,m,+1/K,SW,式中，V,s,固定相体积；V,m,流动相体积，即死体积，V,R,洗脱体积即保留体积；r胶束中表面活性剂的定浓比容，单位mlg、C,m,构成胶束的表面活性剂浓度(C,m,=表面活性剂总浓度减去临界胶束浓度)，单位gml。对于一定的色谱条件，V,s,、V,m,、r、K,MW,、K,SW,均为定值。,(3)胶束色谱的柱效：正丙醇是目前最有效的修饰剂，使用含3%-10的正丙醇的胶束流动相可达到用水-有机溶剂流动相时所获得的柱效。,（4）胶束色谱的梯度洗脱：当固定相与高于CMC以上的表面活性剂平衡之后，进行梯度洗脱不会引起固定相溶剂化结构的变化。若再次进样，不需重新平衡，只需少量流动相冲洗一下混合器和预柱。胶束色谱的梯度洗脱不影响电化学检测器的使用。,2离子对色谱,1）基本原理,反相离子对色谱用疏水性键合相为固定相，被分离的A,+,与B,-,同时存在于强极性流动相中，生成的AB离子对复合物在两相间进行分配分离。其分配系数D,AB,与容量因子K”为：,D,AB,=AB,org,/A,+,aq,=,E,AB,*B,-,aq,K”=D,AB,V,S,/V,m,=E,AB,B,-,aq,V,S,/V,m,从上式看出K”随B,-,aq,与E,AB,的增加而增加，K”在1-10之间较好，因K”太大，则分析时间太长。,2）IPC的影响因素,IPC中的pH将决定离子型物质的解离程度。通常pH为2.07.4，最大不超过9.0。一般测酸性物质时，pH需调在7.07.5，测碱性物质时调至3.03.5。反相离子对色谱，其流动相的pH应控制在2080范围内，以防止硅胶基质的溶解。,通常在反相离子对色谱中平衡离子的非极性部分愈大，K也愈大；采用无机离子，K显著减小。,(三)三维色谱,高效液相色谱与多通道光谱检测器(MCPD)的联用技术，它能同时描绘某个化合物的三维模式图，图中用X轴表示被分离组分的保留时间，Y轴表示紫外吸收强度，Z轴表示紫外波长。,三维高效液相色谱技术在中药制剂的定性定量方面非常有价值，该技术的主要优点是：信息量大，能同时获得被分离组分的保留时间及其紫外吸收曲线。,第四节 气相色谱法,气相色谱法特点：,1.分离效能高 理论塔板数可达10,5,-10,6,2.分析速度快 几分钟至几十分钟,3.灵敏度高 检测限可达10,-12,g,4.可以多机联用 GC-IR、GC-MS等,气相色谱法的主要局限性,样品必须具有一定的,挥发性,和,热稳定性,，在做,定性鉴别时,需要,与,对照品比较,。,一、分离条件的选择,1载气的选择,1）载气与所用的检测器匹配。TCD，H,2,、He为载气效果最佳；FID，一般以N,2,或H,2,为载气；ECD，高纯氮(99.99)为载气。,2）载气流速，一般为20100mlmin。,3）高流速，选用H,2,、He；低流速，选用N,2,。,2柱温的选择,高沸点样品，采用低固定液配比，高柱温；,中等沸点样品，采用中等固定液配比，中等柱温；,低沸点样品，采用高固定液配比，低柱温；,宽沸程样品采用程序升温。,3固定液的选择,选择固定液时，根据,样品的组成,、,组分的结构,及,沸点范围,等，按“相似相溶”原则进行选择，即,极性溶质选用极性固定液，非极性溶质选用非极性固定液,。,麦克雷诺常数(Mc Reynolde Constant)表示及比较某一液相对两种不同类型化合物所显示的分离能力的常数。,I,RX,为极性变化值；,b为正链烷烃净保留时间的对数与碳原子数的函数曲线的斜率；,r为相邻正链烷烃净保留时间的比率。,不同类化合物，选I,RX,差值大的固定液；同系物选b、r高的固定液。,4其他条件的选择,1）采用低进样量，液体为0.1-2l。,2）气化室温度，等于样品沸点或稍高，不超过沸点50以上。,3）检测室温度，等于气化室温度或高于柱温30左右。,二样品的处理,1分解法,将高分子化合物分解为低分子化合物，借分析低分子化合物来对高分子化合物定性，定量。,2.衍生物法,酯化法：高级脂酸肪甲酯化是高级脂肪酸分析最常用的方法，甲酯化常用BF,3,-甲醇试剂。（余略）,三、应用举例,1.样品处理：葵酰乙醛（鱼腥草素）亚硫酸氢钠用吐温增溶-BaCl,2,溶液沉淀使葵酰乙醛游离，氯仿萃取葵酰乙醛。,2.分析方法：GC内标法定量。,3.系统适应性：SE-30熔融石英毛细管柱（25m,0.32mm,，df0.52um）；气化室250，检测室300，初温150，终温240，线性升温速度5/min；分流进样，分流比1,:50,；He（99.999%），31KPa；FID。,四、闪蒸气相色谱法,闪蒸气相色谱法是将样品直接放置在闪蒸器内，在一定的温度下，样品中的易挥发组分在短时间内蒸发出来，被载气带入气相色谱柱中进行分离分析。,关键是选择适当的闪蒸温度与闪蒸时间。通常在进行中药制剂中挥发性组分分析时，闪蒸温度多选在110300之间，时间为1020秒的范围内。,第五节 荧光分析法,特点,1.灵敏度高 10,-4,g/ml,2.选择性好,3.试样量少 几十,g或几十,l,4.信息多 激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光寿命。,一、基本原理,1荧光和磷光,荧光,处于单重基态S,0,的分子吸收了光子的能量后，跃迁到单重激发态，其寿命约10,-6,10,-9,秒，可以直接发射共振荧光，也可以通过去活化机理先回到能级较低的低振动态，然后再发射出剩下的能量而回至基态。,磷光,分子吸收光子后先激发到单重激发态，然后采取非辐射的形式(如转化为热能)跃迁到三重态，温度越低，这种几率愈大。剩下的能量再以辐射的形式 回到基态，这就是磷光。三重态回至单重基态的几率很小，是自旋禁阻跃迁，它的寿命可以长至10,-3,秒以上。,2激发光谱与荧光光谱,激发光谱和荧光光谱是荧光分析中定性与定量的依据和基本参数。,将激发光源用单色器分光，测定样品对每一波长的激发光所发射的荧光强度，以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，就可得到荧光物质的激发光谱。,通常，荧光物质的激发光谱与其吸收光谱相致。,用最大激发波长作光源，让物质发生的荧光通过单色器分光，测定每一个波长的荧光强度，以荧光强度对荧光波长作图，得荧光光谱。吸收光谱与荧光光谱成镜象对称的关系。,3荧光强度,根据Beer定律,F（I,0,-I,t,）I,t,=I,0,e,-CL,F（1-e,-CL,）I,0,当溶液很稀时（A0.05)，e,-CL,1-CL,FI,0,CL,4荧光和分子结构的关系,(1)刚性平面结构,：,凡具有强荧光的有机化合物分子，多数具有刚性平面结构。,分子的刚性平面结构也可用来解释某些,有机络合剂同金属离子络合后荧光增强,的现象。,(2)取代基,供电子基团如：-OH、-OR、-NH,2,、-OCH,3,等常使荧光加强；,吸电子基团如：-COOH、-NO,2,、-X等常使荧光减弱或淬灭。,含O、S、N原子的芳香杂环常有荧光。,取代基之间,若能,形成氢键,，增加分子的平面性，则,荧光加强,。,(3)不饱和稠环结构,不饱和稠环结构有利于荧光的发射，随着稠环的扩大，共平面性加大，分子的荧光效率也增大，荧光光谱向长波长移动。,苯和萘的荧光在紫外区，蒽的荧光呈蓝色，并四苯的荧光显绿色，并五苯则在红色区。,(4),分子所处环境：,如,pH,、温度、溶剂等都会影响分子的荧光，因为这些因素均会影响分子的结构与立体构象。,