坪山新区人民医院疟原虫的镜检技术课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,疟疾的,实验室,诊断,1.病原学诊断,：显微镜血涂片,查见疟原虫，这种镜检确诊最可靠。,2.免疫学诊断：金标法,3.,分子生物学技术：,PCR和DNA探针已应用于疟疾的诊断。,分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊,疟疾的“金标准”,仍然是血液显微镜检查。,疟原虫的镜检技术,1.血膜制作与染色。,2.厚、薄血膜中间日疟、恶性疟各期疟原虫的形态结构及其鉴别要点。,3.镜检示教。,血膜制作的适宜时 机,采血时间 应掌握适宜的取血时机。间日疟应在发作后10小时内采血,恶性疟应在发作20小时后采血.,疟疾典型的临床表现分五期:前驱期、发冷（寒战）期、发热期、出汗期和间歇期。,间日疟在,前驱期,相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性；,发冷（寒战）期,相当于红内期成熟裂殖体胀破红细胞期，镜检多见裂殖体和环状体。,发热期外周血中以环状体（小滋养体）为主；,出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性；发作后数小时（h），间歇期外周血中以大滋养体为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机；发作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次后，配子体出现较多。,薄血膜,涂片操作,薄血膜,取洁净的载玻片1张，左手持载玻片平置,右手持推片，推片一端边缘的中点刮取血液,2,3,微升，使血滴与平置的载玻片中线接触，待血液向两侧扩展后，压一压,以30,4,5,夹角均匀而迅速地向左推成舌状薄血膜.,厚度以薄血膜上的红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。,厚血膜的制作,厚血膜,用推片的一角刮取,45,微升血量，使血滴涂于载玻片的中央处，由里向外一个方向旋转,24,圈，涂成直径,0.81.0,cm的圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求（厚度以1个油镜视野内可见510个白细胞为宜）。,作,标准的疟疾厚薄血膜片,制作血膜的注意事项,1.,清洗玻片，且勿碰撞、磨损.,载玻片必须完全清洁无油渍或污垢。制片时，手指勿接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。,2.,刚涂制的血膜要平放,，厚血膜未干前勿使标本倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；保存血膜时应注意去掉香柏油,防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜；应及时装入标本盒并盖严。,3.血膜应自然干燥,切忌火烤，加快其干燥可采用风吹.干透后厚血膜才能溶血.,染液的种类,染液种类：疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是,瑞氏（Wright stain）和吉氏染液（Giemsa stain）。,这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂。吉氏染液，它具有方便、染色效果稳定、便于长期保存的优点。瑞氏染液染色时间短，但染色效果不如吉氏稳定。,染液的染色原理,红细胞和疟原虫的蛋白质均由氨基酸组成，每个氨基酸电离出一个带正电荷的-NH,3,+,和一个带负电荷的-COO,-,。,碱性染料美蓝,的有色基团带阳离子，可与细胞中带负电荷的-COO,-,部分结合，使之成为,蓝色,。,疟原虫,、淋巴细胞和大单核细胞,的胞浆,、嗜碱性粒细胞的颗粒等酸性蛋白质,，,被染成蓝色,。,酸性染料伊红,的有色基团带阴离子，可与细胞中带正电荷的-NH,3,+,部分结合，使之呈,红色,；,美蓝与伊红都不能使疟原虫和白细胞的核着色，,但美蓝氧化后产生的天青有媒染作用，,在媒染物与染料的共同作用下，,疟原虫和白细胞核被染成紫红色。,染液的PH值的影响,注意,：,蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求,染液的pH值6.8-7.2较好。,染液偏酸,时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使,红细胞和疟原虫的核染成鲜红色,，而,淋巴细胞和原虫的胞浆着色较差,；反之，当,染液偏碱,时，,红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色,，不易观察。,质量好的染色,:核呈红色,胞浆呈蓝色,。,如果血片,偏红，说明染液偏酸性。,如果血片,偏蓝,，说明染液偏碱性。,外观染色血片,影响染色效果的因素,。,影响染色效果的因素:（1）染剂、溶剂的质量（2）染液的新旧（3）染液稀释后使用时间（4）染液的稀释浓度 （5）染色时间,（,6,）染色用水,（,7,）冲洗方法,1.在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。,2.镜检疟原虫，首先学看薄血膜，在基本上掌握薄血膜中疟原虫形态后，再学习镜检厚血膜。,3.镜检疟原虫一般先查厚血膜，怀疑时查薄血膜确定。,4.检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下，自左至右（或由右至左），一行接一行，一个视野稍叠一个视野顺序地查完整个血膜。,5.一般情况下，,厚血膜四周（稍薄些）疟原虫数量较多，且形态较清楚。薄血膜尾部及体部两侧较多见.,血片的镜检,如何确定疟原虫血片为阴性,检查全部厚血膜未查见疟原虫。(最少20个视野),最少检查100个簿血膜油镜视野未查见,疟原虫。,镜检时间应不低于20分钟。,人体疟原虫的基本结构,疟原虫基本构造为,细胞质（胞浆）、核和疟色素,这,三要素。,1.,细胞浆,被染成,蔚蓝色或深蓝色,，,随着虫体发育长大，细胞浆逐渐增多。,2.,核,即细胞核或染色质粒。在正常情况下核呈,鲜红色。,3.,疟色素,颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异。,间日疟原虫,的色素颗粒呈短棒状，,黄褐色；,恶性疟原虫,的色素颗粒呈细砂状，,黑褐色。,薄血膜中间日疟、恶性疟,各期疟原虫的形态结构特点,薄血膜中常见的血液成分,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,血小板,单核细胞,淋巴细胞,红细胞,薄血膜疟原虫形态,间日疟,环状体,感染的红细胞：,胀大不明显，基本正常。,虫体大小：,较大，约为红细胞直径1/3。,胞浆：,环状，浅蓝色。,核：,红色，一个，偶有二个。,疟色素：,无。,约占寄生红细胞的1/3，很少见到一个红细胞寄生2个环状体和一个环状体有2个核。,间日疟环状体,薄血膜疟原虫形态,恶性疟,环状体,感染的红细胞：,大小正常,颜色较深。常见多个原虫同寄生于一红细胞的现象。,虫体大小：,较小，约为红细胞直径1/5-1/6。,胞浆：,蓝色，环状纤细,有时位于红细胞的边缘。,核：,红色一个,常有二个。,疟色素：,无。,恶性疟原虫环状体,环纤细,约为RBC直径的1/6，RBC不胀大,核1个，但2个常见，红细胞常含2个以上原虫,薄血膜中环状体形态特征.比较,间日疟原虫环状体,约为红细胞直径的13；环较粗大；核1个；2个核和一个红细胞寄生2个环状体很少见,恶性疟原虫环状体,约为红细胞的 1/6；环纤细；核12个；,一个红细胞寄生2个环状体的常见,薄血膜间日疟大滋养体形态,感染的红细胞：,胀大褪色，出现形状大小相等、分布均匀、数目较多、鲜红色的,薛氏小点,。,虫体大小：,较大。,胞浆：,不规则，,浅蓝色,，出现阿米巴伪足，有空泡。,核：,红色,，一个。,疟色素：,有，细小杆状，,黄褐色,，分布不均匀。,间 日 疟 大 滋 养 体,虫体不规则，较大；阿米巴样空泡明显；疟色素细小，黄褐色。,间日疟大滋养体,恶性疟大滋养体,受感染红细胞：,大小正常，颜色较深，可出现较粗、大小不一、分布不匀、数目较少红色茂氏小点。,虫体大小：,较小。,胞浆：,蓝色，圆形，坚实，体积小。,核：,一个，红色。,疟色素：,较细的黑褐色颗粒，常集成块。,恶性疟大滋养体,薄血膜中大滋养体形态特征.比较,间日疟原虫大滋养体,虫体较大，不规则；阿米巴样空泡明显；疟色素细小，黄褐色,恶性疟原虫大滋养体,体小，圆形；空泡小；早期疟色素细小，金黄色，晚期结成块状，黑褐色,红细胞：,胀大，褪色，可有薛氏小点。,胞浆：,较不规则，空泡小或消失，浅蓝色,。,核：,红色，分裂为二个以上。,色素：,黄褐色，分布不均匀。,间日疟,未成熟裂殖体,薄血膜疟原虫形态,间,日,疟,未,成,熟,裂,殖,体,恶性疟,未成熟裂殖体,红细胞：,大小正常，颜色较深，可有茂氏小点。,大小：,较小。,胞浆：,规则，圆形或卵圆形，蓝色。,核：,分裂为二个以上，红色,。,色素：,黄褐色颗粒，常集成黑褐色团块。,薄血膜中裂殖体前期形态特征.比较,间日疟原虫裂殖体前期,圆形或不规则；核分裂为2个以上，空泡消失；疟色素分布不匀,恶性疟原虫裂殖体前期,圆形，核分裂为2个以上；疟色素集成团快,间日疟,成熟裂殖体,红细胞,：胀大，褪色，可见薛氏,小点。,大小,：个体较大。,胞浆和核,：裂殖子1224个，通 常为1618个，排列不规则，核红色，胞浆浅蓝色。,疟色素,：黄褐色常集于疟原虫的一边。,间日疟裂殖体,恶性疟,成熟裂殖体,红细胞,：,大小正常，颜色,较深，可见茂氏小点。,大小,：,虫体较小。,胞浆和核,：,裂殖子832,个，通常为818个，排列不规则，核红色，胞浆蓝色。,色素,：,黑褐色，集中于中央或一侧。,恶性疟成熟裂殖体,裂殖子832个，通常818个，排列不规则,疟色素集中成团块状,虫体占红细胞体积的2/3至3/4,薄血膜中成熟裂殖体形态特征.比较,间日疟原虫裂殖体,大于正常红细胞；裂殖子1224个，通常1618个，排列不规则；疟色素常集于一侧，黄褐色,恶性疟原虫裂殖体,小于正常红细胞；裂殖子较小，832个，排列不规则；疟色素成团块状，黑褐色,薄血膜间日疟雌（大）配子体形态,形状大小,：,圆形或椭圆形，较大。,胞浆,：,深蓝色。,核,：,一个，较小，深红色，常偏于一边，核周可见明显不染色带。,疟色素,：,黄褐色，均匀散在，数目较多。,间日疟原虫雌配子体,间日疟雄（小）配子体,形态,形状大小,：,圆形，虫体较大。,胞浆,：,浅蓝色。,核,：,一个，较大，疏松，位于中央，浅红色，周围有明显不着色带。,疟色素,：,黄褐色，散在分布。,间日疟原虫雄配子体,间日疟原虫雌配子体,虫体较大，占满胀大的红细胞,胞质致密，色深蓝,核小致密，深红色，多位于虫体一侧,疟色素分散,间日疟原虫雄配子体,虫体较小，占满胀大的红细胞,胞质浅蓝,核大疏松，淡红色，多位于虫体的中央,。,疟色素分散,薄血膜恶性疟,雌（大）配子体,形态,形状,：,新月形，两端稍尖。,胞浆,：,深蓝色。,核,：,一个，较小，致密，深红色，位于中央，核周可见透明不染色带。,疟色素,：,黑褐色，密布于核的周围。,薄血膜,恶性疟雄（小）配子体,形态,形状：,腊肠形，两端钝圆。,胞浆：,浅蓝色或淡紫红色。,核：,一个，较大，疏松，位于中央，浅红色，核周可见不染色带。,疟色素：,黑褐色，松散分布于核周围。,未成熟雌配子体与成熟大滋养体,(核分裂前，刚要进入裂殖体前期),的形态鉴别,虫体大小,:几乎充满被寄生的红细胞,核:,一个，较大且致密，周围有一圈空白的不染色带,胞浆,:边缘清楚，不含空泡,疟色素,:颗粒较多较粗，均匀散在,虫体大小,:不超过被寄生红细胞的3/4,核:,一个，延长呈带状，周围无明显的不染色带,胞浆,:边缘不整齐，多有空泡,疟色素,:颗粒较少较细，分布不均匀,厚血膜中间日疟、恶性疟,各期疟原虫的形态结构特点,厚血膜中疟原虫的形态,厚血膜由于用血量较多，涂制的血膜小，红细胞重叠且干燥慢，致使虫体皱缩，空泡消失，胞浆变形，各期疟原虫的体积都略微缩小，其中只有大、小滋养体的形态有较大改变，而裂殖体和配子体的形态则无明显变化,。,厚血膜环状体体形态,环状体：,胞浆呈环状或向核的一侧或两侧收缩，使环的中间断裂，或围绕核。,间日疟原虫,的环较大，常呈分号“；”和感叹号“！”状；,恶性疟原虫,的环纤细，常呈冒号“：”、飞鸟“.”、V状和断环状。,间日疟小滋养体,恶性疟小滋养体,厚血膜间日疟大滋养体形态,间日疟大滋养体,呈阿米巴样运动，胞浆常断裂几块或缩成圆形，核和疟色素均被包在胞浆之中，着色深，只隐约可见红色的核和黄绿色的疟色素。胞浆可皱缩断裂成几个块状，大小不一，似互不连接。核位于胞浆之中或外边。疟色素分布不均匀。有些仅见胞浆和疟色素而核看不清楚。,大滋养体,厚血膜恶性疟大滋养体形态,恶性疟原虫大滋养体,与薄血膜形态相似，常呈圆形，体小结实，疟色素细小，金黄色，结成块状后，呈黑褐色。,大滋养体,厚血膜裂殖体形态,裂殖体 间日疟原虫、恶性疟原虫的裂殖体前期及成熟裂殖体，除虫体略微缩小着色较深外，均与薄血膜相似。,间日疟裂殖体,恶性疟裂殖体,厚血膜间日疟配子体形态,间日疟原虫的配子体,呈圆形或卵圆形，除虫体略缩小且着色深外，均与薄血膜相似。,雄配子体,核大，疏松，圆形或呈星状，胞浆较少，着色淡，疟色素颗粒大，数量较多，散在分布。,雌配子体,与圆形成熟的大滋养体相似，但配子体疟色素颗粒粗大，多而散在分布。,大配子体,小配子体,厚血膜恶性疟配子体 形态,配子体,呈新月形或腊肠形，如血膜干燥较慢，则可缩成圆形,，核居中，疟色素围在核周，外围一圈胞浆。此外，还可见配子体的胞浆部分或全部消失，只留下核和疟色素，或核和胞浆均消失，只留下一些疟色素。,大配子体,小配子体,小结：血片镜检中鉴定是否为疟原虫的五条原则,1、疟原虫要,有核有浆,（,红核,蓝浆,）。,2、疟原虫各期（除环状体外）,均含有,疟色素,。,3、疟原虫,自然形态要像,；疟原虫,呈半透明状态,，模糊一团不透明者不是。,4、体积,最大,的疟原虫也,不,能,超过中性粒细胞大。,5、数量极少，似是而非者判为可疑，应重新选择时机多次制片、多次检查，结合临床并交上级医生鉴定.及与主治医生沟通行药物试治。,常,红细胞通胀大,薛氏点明显,成熟环状体粗大,可见不同发育期的原虫,滋养体有阿米巴样伪足,间日疟（P.vivax）鉴定要点,环状体钎细,红细胞不涨大,一个红细胞内可有几个环状体,环状体内可有,2,个核,环状体可贴在红细胞边缘,血片中没有其他发育期滋养体,配子体呈新月形或腊肠形,可出现茂氏点,恶性疟（P.falciparum）鉴定要点,环状体可呈方形,带状形大滋养体是其特点,成熟裂殖体呈菊花状,内含,6,12,个裂殖子,红细胞不胀大，略缩小,有时有西门氏点,三日疟（P.malariae）鉴定要点,卵形疟（P.ovale）鉴定要点,红细胞略胀大或不变大,红细胞边缘呈车轮状,环状体有时呈现鱼眼状,薛氏点明显,成熟裂殖体呈菊花状,类似三日疟原虫,但更粗大,原虫呈卵圆形,镜检示教与读片练习,大量环状体,双核,红细胞大小正常,环状体,大滋养体,红细胞胀大,（卵形疟）,大滋养体,红细胞胀大,（三日疟）,带状大滋养体,红细胞不胀大,（虫种需观察薄血膜来定）厚血膜,大量环状体（箭头所指处）,中性粒细胞（作对照）,大滋养体,间日疟,雄配子体,间日疟,裂殖体,厚血膜,环状体,大滋养体,环状体,裂殖体,恶性疟,（环状体）,裂殖体,厚血膜,恶性疟,（环状体）,恶性疟,(雌配子体),间日疟,（大滋养体）,裂殖体,大滋养体,间日疟,雄配子体,恶性疟,雌配子体,恶性疟,雄配子体,