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,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,手掌参醇提物对染矽尘大鼠肺组织型胶原合成的影响其抗氧化应激机制,本课题受国家自然科学基金项目资助,（编号：,30572464,）,研,究,生,XX,专,业,XXXX,XXXX 教授,XXXX 教授,指导老师,学,武,警,医,院,学,材料与方法,结果,讨论和结论,目 录,前 言,前言,材料与方法 结果 讨论和结论,矽肺是吸入二氧化硅粉尘颗粒所致的以肺间质纤维化为主的全身性疾病。在我国属于法定职业病。,目前，西医治疗肺纤维化主要有糖皮质激素、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、他汀类药物、抗氧化剂、大环内酯类抗生素等，疗效尚待确认，副作用大。中药研究主要集中于以下方面：,a、抗自由基损伤；b、抑制炎性因子的释放，发挥抗炎性损伤作用；c、影响胶原代谢过程，从而减少纤维蛋白的形成；d、影响机体免疫系统功能，降低应激反应的强度,等方面，疗效与西药相当，但副作用小，中药在防治肺纤维化中表现出巨大潜力。,前言,材料与方法 结果 讨论和结论,目前矽肺防治研究概况,手掌参的研究现状,前言,材料与方法 结果 讨论和结论,手掌参(Gymnadenia conop-sea R.Br)，属兰科多年生草本植物的块茎，味甘微苦，性平，入肺、脾经，有补益气血、生津止渴、收敛止血等多种功效。有资料显示：手掌参含有多糖、甙类、菲类和芪类等多种活性成分，具有抗炎、抗过敏和免,疫调节等多种药理作用。,材料与方法,结果,讨论和结论,目 录,前 言,前言,材料与方法,结果 讨论和结论,实验技术路线,造模后7、14、21、28、60天,后处死大鼠,矽肺组,手掌参治疗组,汉防己甲素治疗组,对照组,收集动物肺组织、肺灌洗液、血浆等生物标本。（-80保存待测）,Wistar大鼠,暴露法制造大鼠矽肺模型,(于术后24小时开始灌胃给药）,汉防己(50mgkg,-1,d,-3,),等容生理盐水,药液(8gkg,-1,d,-1,),手掌参生药,滤 液,60乙醇溶液回流提取,水浴蒸馏浓缩,前言,材料与方法,结果 讨论和结论,检测方法,肺组织,血浆,肺泡灌洗液,肺系数、HE染色、组织芯片的制作、天狼猩红染色、免疫组织化学染色、计算机图像分析。,用分光光度法检测血浆中MDA、SOD、GSH-PX的浓度变化,用分光光度法检测BALF中NO、NOS、iNOS活力的变化,用单因素方差分析对各时间点多组均数作显著性检验，用LSD法行各时间点样本均数之间的两两比较，检验水准=0.05。全部数据的统计学处理均采用SPSS 11.5 for windows统计分析软件。,前言,材料与方法,结果 讨论和结论,统计方法,材料与方法,结果,讨论和结论,目 录,前 言,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,组织芯片微阵列图,每张芯片放置约50个样本，两个相邻组织块之间的距离为1mm。每个样本直径0.6mm，切片厚度5m,。,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,大鼠肺组织标本肉眼观,7d时，双肺弥漫性出血、肿胀，以左下、右上肺较为严重，切面有泡沫样液体渗出。14d时，双肺海绵样改变，肺包膜紧张，体积增大，有片状出血。21d时，双肺有针头大小散在的灰白结节，分布较均匀，触之有砂粒感。28d时双肺可见较大的不规则形结节，肺组织硬度增加，灌洗时弹性减弱。60d时结节突出于肺表面，并有融合病灶，肺组织硬度进一步增加。手掌参治疗组和汉防己甲素治疗组，相应时间点肺组织的变化与矽尘组相似，但症状较,之有所减轻。,正常,正常,正常,早期,正常,中期,正常,晚期,cm 0 1,cm 0 1,cm 0 1,cm 0 1,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,大鼠不同时间点肺系数的变化,肺系数肺湿重体重100,图 大鼠不同时间点肺系数,p,0.05 vs 对照组,0,2,4,6,8,10,12,14,7d,14d,21d,28d,60d,p,0.05 vs 矽肺组,对照组,矽肺组,手掌参组,汉防己组,染矽尘组大鼠各时间点肺组织脏器系数均高于对照组，在各时间点均有显著性差异（P0.01）。与染矽尘组比较，手掌参治疗组肺组织脏器系数在7d、14d、21d、28d、60d时显著降低（P0.05），汉防己治疗组在7d、14 d、28d、60d时显,著降低（P0.05）,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,HE,染色结果,(100),对照组,矽肺组,手掌参组,汉防己组,7d,14d,21d,28d,28d,28d,28d,60d,60d,60d,60d,7d,14d,21d,7d,14d,21d,7d,14d,21d,大鼠肺组织标本肉眼观察,计算肺系数,HE染色结果观察,通过肺组织肉眼观察、大鼠肺脏器系数增加以及HE镜下观察的结果，说明,矽肺动物建模成功。手掌参及汉防己对矽肺纤维化均有抑制作用。,对照组,矽肺组,手掌参组,汉防己组,7d,14d,21d,28d,28d,28d,28d,60d,60d,60d,60d,7d,14d,21d,7d,14d,21d,7d,14d,21d,图 染矽尘大鼠不同时间点型胶原面积百分比,p,0.01 vs 矽肺组,p,0.01 vs 对照组,对照组,矽肺组,手掌参组,汉防己组,7d,14d,21d,28d,60d,p,0.01 vs 矽肺组,p,0.05 vs 对照组,对照组,矽肺组,手掌参组,汉防己组,7d,14d,21d,28d,60d,图 染矽尘大鼠不同时间点,型胶原面积百分比,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,天狼猩红,染色结果,(200),注：,型胶原：红色,型胶原：绿色,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,iNOS,免疫组化染色结果,(400),图 不同时间点大鼠肺组织iNOS 阳性细胞积分光密度,P0.05 vs对照组 P0.05 vs矽肺组,对照组,矽肺组,手掌参组,汉防己组,7d,14d,21d,28d,28d,28d,28d,60d,60d,60d,60d,7d,14d,21d,7d,14d,21d,7d,14d,21d,iNOS阳性细胞出现在肺泡腔内，主要是巨噬细胞和中性粒细胞，颗粒大多位于胞浆周边部，大小不一。与对照组比较，染矽尘组大鼠肺组织各时间点iNOS阳性细胞积分光密度均增加，1421d时达到高峰，此后开始下降，7d、14d、21d、28d时有显著性差异（,P,0.05）。手掌参组及汉防己组大鼠肺组织各时间点iNOS阳性细胞积分光密度均低于染矽尘组，在 14d、21d时有显著性差异（,P,0.05）。,注：,阳性细胞为棕染,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,不同时间点大鼠血浆SOD活力的变化,0,50,100,150,200,250,300,350,7d,14d,21d,28d,60d,汉防己组,对照组,矽肺组,手掌参组,图 不同时间点大鼠血浆SOD活力变化,p,0.05 vs 矽肺组,p,0.05 vs 对照组,与对照组比较，不同时间点染矽尘组大鼠血浆SOD活力除在7d时略高外，其余各个时间点均降低，在14d、21d、28d、60d显著降低（,P,0.05），其中14d时陡然下降到最低（,P,0.01）然后开始缓慢增加。与染矽尘组比较，手掌参组及汉防己组大鼠血浆SOD活力从14d开始均不同程度地增高，在14d、21d、28d时有显著性,差异（,P,0.05）。,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,不同时间点大鼠血浆GSH-PX活力的变化,0,500,1000,1500,2000,2500,3000,3500,7d,14d,21d,28d,60d,汉防己组,对照组,矽肺组,手掌参组,图 不同时间点大鼠血浆GSH-PX活力变化,p,0.05 vs 矽肺组,p,0.05vs 对照组,与对照组比较，不同时间点染矽尘组大鼠血浆GSHPX活力除在7d时略高外，其余各个时间点均降低，在14d、21d、28d显著降低（,P,0.05），其中14d时陡然下降到最低（,P,0.01）然后开始缓慢增加。与染矽尘组比较，手掌参组及汉防己组大鼠血浆GSH-PX活力从14d开始均不同程度地增高，在14d、21d、28d时有显著性差异（,P,0.05）。,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,不同时间点大鼠血浆MDA含量的变化,0,2,4,6,8,10,7d,14d,21d,28d,60d,汉防己组,对照组,矽肺组,手掌参组,图 不同时间点大鼠血浆MDA含量变化,p,0.05vs 矽肺组,p,0.01vs 对照组,与对照组比较，染矽尘组大鼠各时间点血浆MDA含量显著升高，其中7d、14d、21d、28d时P0.01，60d时P0.05。手掌参组及汉防己组大鼠各时间点血浆MDA含量均低于染矽尘组，其中7d、14d、21d、28d、60d时有显著性差异,（P0.05）。,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,不同时间点大鼠BALF中NO含量的变化,0,10,20,30,40,50,7d,14d,21d,28d,60d,汉防己组,对照组,矽肺组,手掌参组,图 不同时间点大鼠BALF中NO含量变化,p,0.05vs 矽肺组,p,0.05 vs 对照组,与对照组比较，染矽尘大鼠各时间点BALF中NO含量增加，其中7d、14d、21d时有显著性差异（,P,0.05）。手掌参组及汉防己组大鼠各时间点BALF中NO含量较染矽尘组均有所降低，其中7d、14d、21d时有显著性差异（,P,0.05）。,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,大鼠BALF中NOS、iNOS检测结果,图 染矽尘大鼠不同时间点BALF中iNOS活力变化,p,0.05 vs 矽肺组,p,0.01 vs 对照组,对照组,矽肺组,手掌参组,汉防己组,7d,14d,21d,28d,60d,p,0.05 vs 矽肺组,p,0.01 vs 对照组,对照组,矽肺组,手掌参组,汉防己组,7d,14d,21d,28d,60d,图 染矽尘大鼠不同时间点BAlF中NOS活力变化,染矽尘大鼠各时间BALF中总NOS活力均高于对照组，有显著性差异（,P,0.01）,其中14d时达到高峰。与染矽尘组比较，手掌参组及汉防己组大鼠各时间BALF中总NOS活力均降低，在14d、21d、28d时有显著性差异,（,P,0.05）。,与对照组比较，染矽尘大鼠各时间BALF中iNOS活力显著增加，在14d时增加达到高峰，于7d、14d、21d、28d时有显著性差异（,P,0.05）。与染矽尘组比较，手掌参组及汉防己组大鼠各时间点BALF中iNOS活力均降低，其中，手掌参组在7d、14d、21d、28d时有显著性差异（,P,0.05），汉防己组在14d、21d、28d时有显著性差异（,P,0.05）。,材料与方法,结果,讨论和结论,目 录,前 言,矽肺动物模型的建立通常有三种方法,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,大鼠矽肺纤维化模型的建立,本实验采用,气管暴露注入染尘法,建立矽肺动物模型，经过大体标本的肉眼观察，肺脏器系数的测定，以及HE染色镜下观察，,证明矽肺动物模型建立是成功的。,支气管注入染尘法,此方法剂量准确，容易准确的将矽尘混悬液注入肺中，建模成功率高,动式吸入染尘法,气管暴露注入染尘法,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,手掌参对染矽尘大鼠肺纤维化的影响,本研究结果显示：手掌参组各时间点肺脏器系数都低于染矽尘组，除7d外差异均有显著性（P0.05），其作用与汉防己组相当。,脏器系数,是某个器官的湿重与其体重的比值，反映动物某个器官及其整体的健康状况。,本研究结果显示：手掌参组和汉防己组相应时间点HE染色结果介于矽尘组与对照组之间，肺泡炎和纤维化均有不同程度的减轻。,表明矽尘能够增加大鼠肺组织型胶原的形成，手掌参和汉防己对矽尘诱导的型胶原的增加均具有抑制作用。,HE染色结果,天狼猩红染色结果,手掌参醇提物染矽尘大鼠肺纤维化有抑制作用,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,氧化应激反应与矽肺纤维化,氧化应激,是指机体对外界或内部的各种氧化作用非常刺激所产生的非特异性应答的总和。生物体的氧化应激（Oxidative Stress）状态常与自由基增加伴同存在，氧化应激引起的,氧化损伤反应常由自由基介导发生。,很多研究表明：不论在矽肺动物还是在矽肺患者中都存在着系统性的氧化应激，主要表现在：,（1）,机体氧消耗增加，氧代谢产物负荷蓄积；,（2）,机体抗氧化体系亢进，抗氧化物酶大量消耗继而导致机体氧化抗氧化平衡,失调。,氧化应激可能通过以下几种途径导致肺纤维化:,（1）,氧化剂直接导致肺组织细胞的炎性损伤，从而过度激活肺组织的修复机制而致纤维化。,（2）,氧化剂激活信号传导通路，增加炎性细胞因子表达（如：TNF-a、IL-1）和活化特异转录因子（如：NF-B），启动矽肺纤维化的细胞因子调控网。,（3）,启动凋亡以应对氧氮等自由基导致的线粒体功能紊乱，增加死亡受体及其基因表达。,Silica,AM、N,Signal transduction pathways,Transcription factors,Stress response,Cytokines/,growth factors,Apoptosis,PF,Collogen,ROS、RNS,Cell damage,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,手掌参拮抗染矽尘大鼠体内氧化应激反应,GSH-PX,本研究发现：,手掌参一方面能够抑制其肺组织中NOS蛋白表达的增加，特别是iNOS的表达从而减少NO等氧化剂的过量产生，同时手掌参还能够有效的提高染矽尘大鼠体内抗氧化物酶SOD、GSH-PX活力，增强机体抗氧化能力，从而拮抗矽尘导致机体的氧化应激，减轻LPO造成的肺损伤，延缓和治疗矽肺纤维化。,Oxidative,stress,PF,Silica,Rats,Lung,injury,RNS,ROS,SOD,NO,NOS上调，特别是iNOS上调,MDA,手掌参,汉防己,治疗作用,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,关于选择阳性对照药,汉防己,的探讨,汉防己甲素,（汉防己）是防己科植物粉防己（Stephania tetrandra,S.Moore）,的主要活性成分，化学结构属,双苄基异喹啉类化合物。,实验室研究和临床验证表明汉防己具有抑制矽肺纤维化进展的作用。其主要机制是,：,（1）抗氧化效应,（2）抑制胶原合成,在本实验中，通过对胶原变化的动态观察，,同样发现了汉防己能够显著抑制矽尘导致的胶原合成的增加。,综上所述，据于汉防己对矽肺纤维化具有,公认的防治作用,，且机制与手掌参可能具有类似性，所以本研究在设计时选用汉防己作为阳性对照药，以期更好地阐述手掌参对染矽尘大鼠肺组织型胶原合成的影响及其抗体内氧化应激反应的机制。,前言 材料与方法,结果,讨论和结论,结 论,矽尘可以引起大鼠肺组织炎症和纤维化病变，病变过程中大鼠体内存在氧化应激。,手掌参醇提物具有对抗矽尘导致机体的氧化应激作用，能够有效的提高和稳定染矽尘大鼠体内,SOD,、,GSH-PX,活力，抑制其肺组织中,NOS,的表达，减少,NO,的过量产生，减轻肺部的脂质过氧化水平，直接或间接地抑制肺组织,、,胶原型的合成，从而达到防治矽肺纤维化的作用。,汉防己甲素也能够提高矽尘大鼠体内,SOD,、,GSH-PX,活力，抑制其肺组织中,NOS,的表达，减少,NO,的过量产生，对抗矽尘导致机体的氧化应激，应证了其防治矽肺纤维化的作用和抗氧化应激的机制。,致 谢,本论文是在导师XXX教授、XXX教授的悉心关怀和指导下完成的。从论文的选题、实验方案的设计、实施，结果分析到论文的撰写与修改，都倾注了两位导师大量的心血与汗水。谨此对两位老师的教诲表示衷,心的感谢致以诚挚的敬意！,同时还要感谢XX老师XX的无私教诲，本课题组曾XX等各位同窗学友在实验及论文的,完成方面给与了无私的帮助。,在此，一并表示诚挚的谢意。,XX,谢谢！,