第三章--细胞生物学研究方法1课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,显微镜,-,细胞学说,电子显微镜与分子生物学结合，细胞生物学才能有今天的发展。,结构与功能（动态特征）；,细胞的生命活动；,实验科学与实验技术,细胞真知源于实验室,第一节 细胞形态结构的观察方法,光学显微镜技术,（,light microscopy,）,电子显微镜技术,(Electro microscopy),扫描探针显微镜（,Scanning Probe Microscope,）,扫描遂道显微镜,(scanning tunneling microscope),一、光学显微镜技术（,light microscopy,),最早的光学显微镜是,1590,年,Janssen,和他的侄子共同研制的。其后，,Robert Hooke,和,Leeuwenhoek,对光学显微镜的分辨本领进行了极大的改进，由此发现了细胞。,20,世纪,30,年代发展起来的电子显微镜导致细胞结构和功能研究发生了一次革命，使生物学家得以从亚显微水平上重新认识细胞。,透射,焦距与角孔径,焦距,(focal length),是透镜的中心平面到焦点的距离，而,角孔径,(angular aperture),是光从样品进入显微镜的物镜半角,，因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜。,角孔径越大，透过透镜的信息越多,分辨率,:,透镜最重要的性质就是它的分辨率，分辨率,(R),可用以下公式计算,:R=0.61/n Sin,其中,:n=,聚光镜和物镜之间介质的折射率,.,空气为,1.,油为,1.5;=,样品对物镜角孔径的半角，,sin,的最大值为,1;=,照明光源的波长。,0.61,是一个恒定的参数，表示成像的点虽被重叠但仍能被区别的程度。,从上式可知，,角孔径越大，进入物镜的光越多,；,介质的折射率越大，则数值孔径越大，这些都可以使分辨率提高。,由于分辨率表示的是能够区别两个点间最近距离的能力，所以,R,值越小，分辨率越高。从分辨率的表达式来看，或者,波长越短，分辨率越高。,分辨极限,(limit resolution),与放大率,(magnification),对可见光来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是,0.2 m,，称之为分辨极限。,最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率,。总放大率,=,物镜放大率,目镜放大率，放大率同样受分辨极限的限制。,一般来说，光学显微镜的最大放大率只能是透镜的数值孔径的,1000,倍。由于透镜的数值孔径的范围是,1.0-1.4,，所以光学显微镜在用空气作介质时最大放大倍数为,1000,倍，用油镜则为,1400,倍。,增大角孔径或缩短波长可提高光学显微镜的分辨率。如果用波长比普通波长短得多的电子波代替光波，分辨率可大大提高，电子显微镜就是在这种需求下被发明的。,表 电子显微镜与光学显微镜的基本区别,分辨本领,光源,透镜,真空,光学显微镜,300 nm,可见光,玻璃透镜,不需真空,200 nm(油镜),可见光,玻璃透镜,不需真空,100 nm,紫外光,玻璃透镜,不需真空,电子显微镜,0.1 nm,电子束,电磁透镜,真空,1,、,常用的光学显微镜,光学显微镜,(light microscope),是光学显微技术的主要工具，自问世以来已有,400,多年历史。,光学显微镜是利用光线照明，使微小物体形成放大影像的仪器。现今使用的光学显微镜都是由几个透镜组合而成，所以又称为,复合显微镜。,普通双筒显微镜,比较高级的显微镜上都设有倾斜式的双目镜筒。在物镜转换器上方装有四个棱镜，使经过物镜的光线平分为两路到达目镜，故双筒显微镜的亮度要比单筒者为暗。,双筒显微镜的优点为同时用两眼观察，有较强的立体感。,基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统,石蜡切片技术,荧光显微镜技术,（,Fluorescence Microscopy,）,荧光显微镜的工作原理是利用紫外线发生装置,(,如弧光灯、水银灯等,),发出强烈的紫外线光源，,通过照明设备把显微固定的切片或活染的细胞透视出来。,荧光显微镜原理,相差显微镜,(phase contrast microscope),相差显微镜,在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统有很大的,不同，可用,于观察未染色的活,细胞。,相差显微镜,是能将物体本身的相位差转换为振幅差的显微镜。在普通光镜下观察标本时，是靠颜色（波长）和亮度（振幅）的差别而看到被检物体的结构，而活细胞近于无色透明，光波通过不吸收光，振幅变化不大，故人眼感觉不到，为解决这一难题，,30,年代（,19341935,）荷兰物理学家,Zernike,设计制造出相差显微镜，并用此而获,1953,年诺贝尔奖。,相差显微镜的光学部件及光线通路,相差显微镜观察的活细胞,暗视野显微镜,(dark field microscope),暗视野显微镜是利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以观察未经染色的活体或胶体粒子。,暗视野显微镜主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，,适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。,暗视野显微镜的光学,倒置显微镜,倒置显微镜的结构组成与普通显微镜一样，所不同的只是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来。,前者置于载物台之下，而后者在载物台的上方。集光器与载物台之间的工作距离提高。,可以放置培养皿、培养瓶等容器，直接对培养的细胞进行照明和观察。,光学显微镜的样品制备与观察,由于大多数细胞的成分不影响光线的穿透，无法形成反差，所以在一般光学显微镜下，几乎看不清未经处理的细胞。为了看清细胞内含物，就必须对细胞样品进行一些特殊的处理，为此建立和发展了样品的各种制备技术。,样品的固定,(fixation),目的,:,生物组织在染色前先进行固定的目的是杀死细胞，稳定细胞的化学成份，并且使样品硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏,做法,:,样品固定的最简单做法是将样品直接浸泡在固定液中。固定使得大分子交联而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象。,一般用具有缓冲作用的醛类固定液，用甲醛或戊二醛作固定剂，能够与蛋白质的游离氨基形成共价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。,包埋和切片,样品制备的第二步是将固定的组织制备成切片。,样品首先要被包埋在介质中，通常用液态的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块组织，然后将之硬化成固体的包埋块；,用专门的切片机切割包埋块，制备成薄切片。适用于光学显微镜观察的切片厚度为,l-10m,。,染色,(staining),大多数细胞总重量的,70%,是水，对可见光几乎是透明的，只有很少的内含物不透光。染色的目的就是给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。,19,世纪初，发现某些有机染料可染生物组织，并对细胞特殊部位的着色具有选择性。如,苏木精,对负电荷分子有亲和性，能显示出,细胞内核酸,的分布；酸性染料如,伊红可使细胞质染色,；,苏丹染料在脂肪,中的溶解度比在乙醇中大，所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。,但对许多染料的特异性染色机理尚不清楚。,激光共焦扫描显微镜技术（,Laser Scanning Confocal Microscopy,）,原理,应用：,排除焦平面以外光的干扰，增强,图像反差和提高分辨率,(1.4,1.7),，,可重构样品的三维结构。,2,、电子显微镜技术,自从第一台电子显微镜在德国诞生以来，取得飞跃发展并在生物学领域中得到广泛的应用。,利用电镜可以观察到各种病毒的形态结构以及细胞器的微细结构，还能观察到许多生物大分子。,目前的电镜已由单纯的形态描述进入了成分分析、定性和定量分析。,此外，将电镜与计算机连用，对图象进行信息处理也取得了很大进展。,总之，电镜已成为研究生物学的有力工具，必将发挥越来越大的作用。,1932,年德国学者,Max Knolls,和,Ernst Ruska,发明了第一台电子显微镜，开拓了超微世界，发现了许多光镜下看不到的结构，如细胞膜、线粒体、细胞核、高尔基体、中心粒等细胞器的细微结构。,将在光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构,(submicroscope structure),，或超微结构,(ultrastructure),。,在种类上，电镜可分为两大类,:,透射电子显微镜和扫描电子显微镜。,电镜与光镜的比较,显微镜,分辨本领,光源,透镜,真空,成像原理,LM,TEM,200nm,100nm,0.1nm,可见光（,400-700,）,紫外光,（约,200nm),电子束,（,0.01-0.9,）,玻璃透镜,玻璃透镜,电磁透镜,不要求真空,不要求真空,要求真空,1.33x10,-5,1.33x10,-3,Pa,利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化,利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差,光镜与电镜的主要区别,：,（,1,）光源不同：光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束,（,2,）透镜不同：光镜为玻璃；电镜为电磁透镜,（,3,）真空,（,4,）显示记录系统,透射电子显微镜,(TEM),透射电子显微镜主要是让电子束穿透样片而成像。电子显微镜基本结构由三大部分组成电子光学系统,(,镜筒,),、真空系统、电子学系统,(,供电系统,),。,电子光学系统由照明系统、样品室、成像系统、观察窗和记录用的照相机等组成。,由于电子显微镜必需在高度真空条件下进行工作，阴极与阳极之间会放电，灯丝也会因受到氧化或被阳离子轰击而缩短寿命，所以设计了真空系统。,电子学系统即供电系统，需要高压稳压。,电镜,(,透射电镜,),与光镜光路图比较,电子显微镜的基本构造,扫描式电子显微镜,1940,年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜。直到,1965,年，才有英国剑桥科学仪器有限公司生产出实用性强的商品扫描电镜。由于扫描电镜具有显著的优点，因此，几十年来，已广泛应用于生物学、医学、古生物学、地质学、化学、物理学、电子学以及勘察、冶金，机械与轻工业等领域，成为十分有用的研究工具。,电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。,CO,2,临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题。,主要电镜制样技术,超薄切片,负染色技术,冰冻蚀刻技术,电镜三维重构技术,超薄切片技术,取材,前,固定,(4%,戊二醛,)-PBS,洗残余的戊二醛后固定,(4C,锇酸,)-,脱水,(,乙醇或丙酮,包埋,(,环氧树脂,),修片,切片,(600,埃，银色,),染色,(,醋酸铀与铅盐,),观察,负染色,(negative stainning),一些生物大分子组成的结构，如病毒、线粒体基粒、核糖体和蛋白质组成的纤维等可以通过负染色电镜技术观察其精细结构，还可以从不同角度观察三维结构。,负染原理：,又称阴性反差染色，借助染色剂的衬托，增加背景对电子的散射，使样品相对地透过较多的电子，最后在荧光屏上形成暗背景下的,“,亮像,”,。,冰冻断裂复型,和,冰冻蚀刻,是专门观察样品外表面的投影复型术,一、显微镜的种类及原理,5.,透射电子显微镜；,6.,扫描电子显微镜,能否用扫描电镜来观察样品的内部结构，,而用透射电镜来观察样品的表面结构？,冰冻蚀刻技术,电镜三维重构技术,3,、扫描遂道显微镜,扫描隧道显微镜由,IBM,公司瑞士苏黎世研究所的两位学者,Binning G.,和,Rohrer H.,等在,1981,年发明的具有原子显像力的显微镜，是,根据量子力学中的隧道效应原理而制成的。,这种显微镜对生物、物理、化学等学科均有推动作用，可用于研究表面的原子结构和电子结构，故于,1986,年获得了诺贝尔物理学奖。,特点：,（,1,）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为,0.1-0.2nm,，纵分辨率可达,0.01nm,）；,（,2,）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；,（,3,）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。,（,4,）可连续成像，进行动态观察,用途：,纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。,扫描隧道显微镜,DNA,双螺旋结构的建立是根据,X,射线衍射结果推导出来的，至今还没有直接观察,DNA,结构的方法，所以对其中的微细结构还不够了解。用,STM,观察了,DNA,的双螺旋结构，见到,DNA,分子上的大沟和小沟，并且了解,DNA,的结构随染色体长度而异。,第二节 细胞组分的分析方法,离心分离技术,细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法,特异蛋白抗原的定位与定性,细胞内特异核酸的定位与定性,放射自显影技术,定量细胞化学分析技术,核酸分子杂交技术,一、离心分离技术,离心分离细胞组分是最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力的作用下沉降分离。,用途,：,于分离细胞器与生物大分子及其,复合物。,差速离心：,分离密度不同的细胞组分,。,密度梯度离心,：,精细组分或生物大分子的,分离。,差速离心,(differential centrifugation),主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。,差速离心,密度梯度离心,二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法,原理：,利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。,DNA,特异性的显示方法,Feulgen,反应：,利用酸水解去除细胞中的,RNA,，仅保留,DNA,，并且除去,DNA,嘌呤脱氧核糖核酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基与希夫试剂反应呈紫红色。,多糖的显示方法,PAS,（过碘酸希夫氏）反应,利用过碘酸的强氧化作用破坏糖分子的,C-C,键，使糖分子氧化产生双醛基，自由的醛基与希夫试剂作用形成紫红色产物。,脂类物质的显示方法,对脂类物质的染色应用的是物理的扩散原理。苏丹类染料是脂溶性染剂，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，它会脱离酒精而溶于脂类结构中从而显色。,细胞中各种酶的显示方法,由于酶易受外界条件影响而变性失活。,对酶的显示一般采取间接的方法进行，对可以与酶发生特异性结合的底物进行染色从而达到显示酶的目的。,在实验的过程中需在尽量保持酶的活性。,三、特异蛋白抗原的定位与定性,免疫荧光技术：,快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限,免疫电镜技术：,免疫胶体金技术,应用：,通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。,细胞内对于蛋白质分子的定位技术包括免疫荧光、免疫印迹以及免疫电镜等，这些技术都是基于免疫学中抗原抗体特异性反应的原理而设计的。将抗体分子上加上不同的可供识别的标记，从而显示出某种蛋白质在细胞内的分布和定位。,抗原,抗原抗体,特异性结合,免疫荧光标记,免疫酶标记,免疫荧光技术,免疫电镜技术,四、细胞内特异核酸的定位与定性,光镜水平的原位杂交技术,（同位素标记或荧光素标记的探针）,电镜水平的原位杂交技术,（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）,PCR,技术,五、放射自显影技术,原理及应用：,利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；,实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。,步骤：,前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）,放射自显影,放射自显影,六、定量细胞化学分析技术,细胞显微分光光度测定术,利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。,包括：,紫外光显微分光光度测定法；可见光显微分光光度测定法,流式细胞仪（,Flow Cytometry,）,主要应用：,用于定量测定细胞中的,DNA,、,RNA,或某一特异蛋白的含量,；测定细胞群体中,不同时相细胞,的数量；从细胞群体中分离某些,特异染色的细胞,；分离,DNA,含量不同的中期染色体,。,流式细胞仪,第三节,细胞培养、细胞工程与显微操作技术,一、细胞培养,细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。近年来细胞生物学一系列主要理沦研究的进展，如,细胞全能性的揭示，细胞周期及其调控。癌变机制与细胞衰老，基因表达与调控，细胞融合以及一些细胞工程技术的建立都是,与细胞培养技术分不开的。,1,、,动物细胞培养,类型：原代培养细胞；继代培养细胞,细胞株（,cell strain,）正常二倍体，接触抑制,细胞系（,cell line,）亚二倍体，接触抑制丧失,2,、,植物细胞,类型：原生质体培养（体细胞培养）,单倍体细胞培养（花药培养）,动物细胞培养,植物组织培养,二、细胞工程,细胞融合与细胞杂交技术,单克隆抗体（,monoclone antibody,）技术,细胞拆合,物理法结合显微操作技术,(,图,1,、,图,2,),化学法结合离心技术,制备核体（,karyoplast,）和胞质体（,cytoplast,）。,显微操作技术,细胞融合,单克隆抗体,1975,年英国科学家,Milstein,和,Kohler,发明了单克隆抗体技术，因此获得,1984,年诺贝尔医学奖。,乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机理，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物。,Caenorhabditis elegans,Drosophila melanogaster,Arabidopsis thaliana,拟南芥菜,酵母的基因组于,1996,年测序完成，其基因组含,1.210,8,个碱基对，约有,6200,个基因。,模式植物,拟南芥菜,植株小,-15 cm,种子多,-up to 10,000 seeds in a plant,周期短,-4 weeks for a cycle,基因组小,-5 chromosomes,拟南芥的基因组于,2000,年测序完成，是人类搞清的第一个植物物种的基因组，共有,1.25,10,9,个碱基对，约有,25000,个基因。,线虫的基因组于,1998,年测序完成，是人类得到的第一个动物物种的基因组,共有,10,9,个碱基对，约含,18400,个基因。,果蝇的基因组于,2000,年测序完成，共有,1.410,9,个碱基对，约含,13600,个基因。,小鼠的基因组测序工作预计到,2007,年完成，推测其基因组共有,3.3,10,10,个碱基对，约含,40000,个基因。,