第三章-酶的生物合成法生产课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章,酶的生物合成与发酵生产,1,酶的生产方法,提取分离法,(Extraction),生物合成,(Biosynthesis),化学合成,(chemicalsynthesis),SOD-blood,Papain-Papaya,Chymotrypsin-Pancrea,organ/tissue/cell,Amylase from Bacillus,Protease from Bacillus,Phosphatase from Bacillus,Glucoamylase from Aspergillus,Plant cell culture,Animal cell culture,Few example,核糖核酸酶,2,本章内容,第一节 酶生物合成及调节,第二节 酶发酵动力学,第三节 微生物发酵产酶,第四节 动、植物细胞培养产酶,3,Reverse,transcription,第一节 酶生物合成及调节,一、酶的生物合成,遗传信息传递的中心法则,4,Replication 复制：,亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。,Transcription 转录：,以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。,Translation 翻译：,以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。,Reverse translation 逆转录：,以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,5,（一）RNA的生物合成-转录,(transcription),.,1.细胞内RNA的生物功能,(1)在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。,(2)在蛋白质的生物合成过程中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。,6,转录过程的特点,（1）转录的不对称性：,在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。,反义链 antisense strand（无意义链，负链）：,在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。,有义链 coding strand（编码链，正链）：,在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。,9,（2）转录所需酶：,依赖DNA的RNA聚合酶,又称为转录酶，是以DNA为模板的一类RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由,1种,RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有,3种,，分别为RNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA聚合酶，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为410个，亚基种类有46种。,10,T C G A G T A C,A G C T C A T G,C G A G U A C,G C A U,RNA,聚合酶,有意义链,反意义链,RNA,PPi,5,5,3,GTP,UTP,CTP,ATP,UTP,RNA,在,DNA,模板上的生物合成,3,3,5,11,原核生物的,RNA聚合酶(DDRP),E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（,2,）,起始因子,12,RNA合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,5,3,RNA,启动子（promotor),终止子(terminator),5,RNA,聚合酶,5,3,5,3,5,5,3,离开,13,RNA链的延伸图解,3,5,RNA-DNA杂交螺旋,聚合酶的移动方向,新生RNA,复链,解链,有义链,模板链（反义链）,延长部位,14,翻译,:以RNA中mRNA为模板,按照其,核苷酸顺序所组成的密码指,导蛋白质的合成的过程.,mRNA,蛋白质,翻译,各种信息 各种蛋白质,（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）,（二）蛋白质的生物合成-翻译,(translation),15,蛋白质的合成过程,（大肠杆菌）,氨基酸的活化,肽链合成的起始,肽链的延伸,肽链合成的终止与释放,蛋白质前体的加工,16,氨基酸的活化与转运,反应式：,AA +tRNA +ATP,氨酰-tRNA合成酶,氨酰-tRNA,+AMP+PPi,对于,E.coli,而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。,17,在核糖体上合成多肽（三阶段）,1、起始阶段,2、延伸阶段,3、终止阶段,18,原核生物肽链合成的起始阶段是在GTP和起始因子（Initiation Factor）的参与下，核糖体30 S亚基，fMet-tRNAF ，mRNA和50 S 亚基结合，组成起始复合物的过程。主要包括,5,个步骤：,（1）30 S亚基与起始因子IF3 结合；,（2）30 S亚基与mRNA结合，形成30 S-IF3-mRNA复合物；,（3）fMet-tRNAF 与起始因子IF2以及GTP结合，生成fMet-tRNAF -IF2-GTP；,肽链合成的起始阶段,19,（4）在起始因子IF1的参与下，fMet-tRNAF-IF2-GTP与30 S-IF3-mRNA结合生成30 S起始复合物。在此30 S起始复合物中，fMet-tRNAF上的反密码子正好与mRNA上的起始密码子AUG结合；,（5）50 S亚基与上述30 S起始复合物结合，形成完整的70 S核糖体。同时放出IF1，IF2，IF3，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70 S核糖体形成时，fMet-tRNAF 位于70 S核糖体的“P”位（肽酰基位），而它的“A”位（氨酰基位）是空位。,20,AUG ACA,5,3,AUG ACA,5,3,UAC,UAC,AUG ACA,5,3,小亚基,mRNA,蛋氨酰,tRNA,+GTP+IF,2,大亚基,GDP+Pi,受位,给位,蛋,蛋,肽链合成的起始阶段,IF,3,IF,3,IF,1,21,肽链合成的延伸阶段,1.,进位,:,氨基酰-tRNA进入受位;,2.,转肽,:,形成肽键,在转肽酶作用下,给位与,受位结合;,3.,移位,:,核蛋白体向3端移动一个密码子的,位置,空出受位,不断地进位、转肽、,移位,使肽链延长。,22,AUG ACA,5,3,UAC,蛋,苏,UGU,AUG ACA,5,UAC,蛋,苏,UGU,GUU,AUG ACA,5,UAC,蛋,苏,UGU,GUU,AUG ACA,5,蛋,苏,UGU,GUU,3,3,3,GTP GDP+Pi,GDP+Pi,GTP,起始复合体,进位,转肽,移位,Mg,+,K,+,23,肽链合成的终止阶段,1.出现终止密码并与终止因子结合;,2.肽键水解,多肽释放;,3.,tRNA,mRNA,大小亚基解离.,24,AUG,UAA,5,UAC,AUG,UAA,5,UAC,3,3,终,终,AUG,UAA,5,UAC,3,终,5,3,UAC,终,肽链,25,26,蛋白质前体的加工,N,端,fMet,或,Met,的切除,二硫键的形成,特定氨基酸的修饰,切除新生肽链中的非功能片段,肽链的折叠,亚基的聚合,27,二、酶生物合成的调节,定义：,通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。,意义：,通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。,28,操纵子基因表达的协同单位,操纵子,结构基因,（编码蛋白质,structural gene,S,）,控制部位,操纵基因（operator gene,O）,启动子（promotor gene,P）,（一）基因调控理论,Jacob and Monod的,操纵子学说,（operon theory）,29,基因操纵子调节系统示意图,调节基因,启动基因 操纵基因 结构基因,DNA,转录,（,-,）,RNA,聚合酶,（+）,转录,翻译,mRNA,翻译,阻遏蛋白,蛋白质,诱导剂,控制区 信息区,操纵子,30,调节基因,(regulator gene)：,可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein)（一种变构蛋白），通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。,调节基因常位于调控区的上游。,31,cAMP-CRP,复合物的作用示意图,启动基因（promotor gene）（启动子）：,有两个位点：,（1）RNA聚合酶的结合位点,（2）cAMP-CAP的结合位点。,CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。,只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。,32,操纵基因（Operater gene）:,位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。,结构基因（Structural gene）:,决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。,33,(二)酶合成调节的类型,1.,诱导,(induction),组成酶：细胞固有的酶类。,诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似,物而临时合成的一类酶。,2.,阻遏,(repression),分解代谢物阻遏(catabolite repression),反馈阻遏(feedback repression),34,（三）酶合成的调节机制,1.酶合成的诱导,加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。,酶合成诱导的现象：,已知分解利用乳糖的酶有：,-,半乳糖苷酶；,-,半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶,。,35,实验：,（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；,（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；,（3）表明菌体生物合成的经济原则：,需要时才合成,。,36,调节基因,操纵基因,乳糖结构基因,P,LacZ,LacY,Laca,mRNA,阻遏蛋白（有活性）,基 因 关 闭,启动子,O,R,P,LacZ,LacY,Laca,调节基因,操纵基因,乳糖结构基因,启动子,O,R,mRNAZ,mRNAY,mRNAa,阻遏蛋白（无活性）,基 因 表达,mRNA,A、乳糖操纵子的结构,B、乳糖酶的诱导,乳糖,阻遏蛋白（有活性）,诱导作用,37,2.产物阻遏（反馈阻遏）,由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏,。,酶合成阻遏的现象：,实验：,（,1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:,不需要就不合成,。,38,色氨酸操纵子酶的阻遏,调节基因,操纵基因,结构基因,mRNA,酶蛋白,阻遏蛋白不能与操纵基因结合，,结构基因表达,调节基因,操纵基因,结构基因,辅阻遏物,代谢产物与阻遏蛋白结,合，使之构象发生变化,与操纵基因结合，结构基,因不能表达,39,酶的诱导和阻遏操纵子模型,B.有活性阻遏蛋白加诱导剂,A.有活性阻遏蛋白,C.无活性阻遏蛋白,D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂,操纵基因,启动基因,调节基因,结构基因,阻遏蛋白(有活性),阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达,诱导物,诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达,酶蛋白,mRNA,阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达,阻遏蛋白(无活性),酶蛋白,mRNA,代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达,代谢产物,40,调控方式,阻遏蛋白,添加物,与操纵基因结合,阻遏效应,举例,酶的诱导,有活性,不转录，,继而不翻译,诱导物,转录，,继而翻译,乳糖操纵子,酶的阻遏,无活性,阻遏物,不转录，,继而不翻译,色氨酸操纵子,酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比,41,3.分解代谢物阻遏,指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。,分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。,42,分解代谢物阻遏现象：,实验：,细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。,这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白(CAP)。,43,分解代谢物阻遏,R,LacZ,LacY,Laca,mRNA,mRNAZ,mRNAY,mRNAa,基 因 表达,CAP基因,结构基因,T,CAP,O,CAP结合部位,RNA聚合酶,T,cAMP,-CAP,P,葡萄糖,分解代谢产物,腺苷酸环化酶,磷酸二酯酶,ATP,cAMP,5-AMP,抑制,激活,葡萄糖降解物与cAMP的关系,cAMP,CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）,降低,cAMP,浓度,使,CAP,呈失活状态,44,第二节 酶发酵动力学,一、细胞生长动力学,在分批培养(batch culture)过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期5个阶段。,45,细胞生长曲线,O-A,延迟期,A-B,指数生长期,B-C,减速期,C-D,静止期,D-E,衰亡期,46,营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型,:,比生长速率（1/h）（specific growth rate）,max,：,最大比生长速率（1/h）,S：营养物浓度（生长限制基质浓度）克/L,Ks：,莫诺德常数或,饱和常数或营养物利用常数 克/L，或 mol/L,47,1 前提：假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，比生长速率为这种限制性基质浓度的函数。,2 当SKs时，=,max。,3,Ks为,莫诺德常数，是指比生长速率达到最大生长速率一般时的限制性基质浓度。即，当,=0.5,max,时，,S=Ks。,Monod模型,48,49,二、产酶动力学,（一）酶生物合成的模式,根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即：,同步合成型,生长偶联型,中期合成型,部分生长偶联型延续合成型,非生长偶联型 滞后合成型,50,1.生长偶联型（又称同步合成型）,酶的生物合成与细胞生长同步。,特点：,酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。,当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。,51,生长偶联型中的特殊形式中期合成型,酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。,特点：,酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所对应的mRNA是不稳定的。,枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线,52,2.部分生长偶联型（又称延续合成型）,酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。,特点：,可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。,所对应的mRNA相当稳定。,黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线,53,3.非生长偶联型（又称滞后合成型）,只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。,特点,：,受分解代谢物的阻遏作用。,所对应的mRNA稳定性高。,黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线,54,总结：影响酶生物合成模式的主要因素,1）mRNA的稳定性,高：可在细胞停止生长后继续合成酶,差：随着细胞停止生长而终止酶的合成,2）培养基中阻遏物的存在,不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。,受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶,才开始合成。,55,酶生产中最理想的合成模式：,延续合成型：,发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。,对于：,同步合成型：,提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵,温度。,滞后合成型：,尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使,酶的合成提早开始。,中期合成型：,要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方,面努力,。,56,(二)产酶动力学,一般产酶动力学方程可表达为：,式中 X细胞浓度(g/L),细胞比生长速率,(h,-1,),生长偶联的比产酶系数,(IU/g),非生长偶联的比产酶速率,(IU/(g,h),E酶浓度(IU/L),t时间(h),57,生长偶联型,部分生长偶联型,非生长偶联型,58,第三节 微生物发酵产酶,一、产酶微生物的分离和选育,1.优良产酶菌种应具备的条件,（1）酶产量高,（2）易培养（生长速率高、营养要求低）,（3）遗传性能稳定，不易退化,（4）易分离提纯,（5）安全可靠（不是致病菌）,59,2.,常用的产酶微生物,Escherichia coli,Pseudomonas,(假单胞菌,),Bacillus subtilis,（,枯草杆菌）,Micrococcus,Streptococcus,(链锁状球菌,),Streptomyces,(链霉菌,),Aspergillus niger,（黑曲霉）,Aspergillus oryzae,(米曲霉,),Monascus,(红曲霉,),Penicillium(青霉,),Trichoderma(木霉,),Rhizopus(根霉,),Mucor(毛霉,),Absidia,(,犁头霉,),Saccharomyces cerevisiae,Candida,(假丝酵母,),60,(1)大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。,形态：短杆或长杆状，0.51.01.03.0 um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。,大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。,大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。,61,应用：,大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖,大肠杆菌也是最早用作,基因工程的宿主菌,工业上生产,谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶,和制备,天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸,等,62,(2)醋酸杆菌,（,Acetobacter,）,菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。,应用：有机酸(食醋等）,葡萄糖异构酶(高果糖浆),山梨糖(维C中间体）,63,(3),枯草,芽孢杆菌,（,Bacillus subtilis,）,直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，,革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生。,枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。,64,(4)根霉(,Rhizopus,),分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。,根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。,分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。,代表种：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。,65,应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸,66,(5)曲霉(,Aspergillus,),分类：,多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。,分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。,代表种：,黑曲霉Asp.Niger黄曲霉Asp.flavus,67,应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。,68,3.产酶微生物的分离和筛选,1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品,2)富集培养:投其所好，取其所抗,3)分离获得微生物的纯培养（pure culture）。,4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。,5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。,69,-淀粉酶的筛选,70,蛋白酶产生菌的获得方法,应用含酪蛋白的培养基,71,4.产酶微生物优良菌种的选育,诱变育种,原生质体融合育种,基因工程育种,72,二.微生物发酵产酶方法,1.固体培养:特别适合于霉菌培养,2.液体培养:目前酶发酵生产的主要方式,3.固定化细胞:需要特殊的固定化细胞反应器,73,三.微生物酶的类型,1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。,2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。,74,四、酶发酵生产的一般工艺流程,75,五、酶的发酵工艺条件与控制,1、培养基,2、发酵条件及控制,3、提高产酶的措施,76,1、培养基,各种生物对营养的需求,77,1、选择适宜的营养物质,2、营养物的浓度及配比合适,3、物理、化学条件适宜,4、经济节约,5、精心设计、试验比较,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。,培养基的设计原则,任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素：,碳源、氮源、无机盐、生长因子、水。,78,实验室的常用培养基：,细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；,放线菌：高氏1号合成培养基培养；,酵母菌：麦芽汁培养基；,霉菌：查氏合成培养基；,例如枯草芽孢杆菌：,一般培养：肉汤培养基或LB培养基；,自然转化：基础培养基；,观察芽孢：生孢子培养基；,产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基。,79,2、发酵条件及控制,培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。,通常培养条件：,细菌与放线菌：pH77.5,酵母菌和霉菌：pH4.56范围内生长,（1）pH值的控制,80,细胞发酵,产酶的最适,pH,值,与,生长最适,pH,值,往往有所不同。细胞生产某种酶的最适,pH,值通常接近于该酶催化,反应的最适,pH,值,。,有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的,pH,值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。,81,枯草杆菌碱性磷酸酶,酶作用最适PH9.5,产酶最适PH7.4,黑曲霉,PH偏中性，淀粉酶产量增加，糖化酶减少,PH偏酸性，淀粉酶产量减少，糖化酶增加,米曲霉,PH偏碱性，生产碱性蛋白酶,PH偏中性或酸性，生产中性或酸性蛋白酶,82,通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。,（2）温度的控制,有些细胞发酵,产酶的最适温度,与细胞生长最适温度有所不同，而且往往,低于生长最适温度,。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。,枯草杆菌的最适生长温度为3437,黑曲霉的最适生长温度为2832,83,酱油曲霉生产蛋白酶,，28下发酵，其蛋白酶的产量比在40下提高2-4倍，在20下更高。,但并,不是温度越低越好,，若温度过低，生化反应速度很慢，反而降低了酶产量，延长发酵周期。,因此必须进行试验，以确定最佳的产酶温度。,84,发酵,初期合成吸热,保温,旺盛期分解放热,降温,排管、蛇管、夹套、喷淋装置,85,（3）溶解氧的控制,在酶的发酵生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。,培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。,86,调节通气量,调节氧的分压,调节气液接触时间,调节气液接触面积,改变培养液的性质,控制溶解氧方法,一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。,培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。,增加液层高度，增加挡板,空气分配管、搅拌,87,3、提高酶产量的措施,（1）添加诱导物,对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。,诱导物一般可以分为3类,酶的作用底物,酶的催化反应产物,作用底物的类似物,88,（2）控制阻遏物的浓度,阻遏作用根据机理不同，可分为：,产物阻遏和分解代谢物阻遏两种,。,1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。,2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。,控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。,89,为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。,采用其他较难利用的碳源，如淀粉等,采用补料、分次流加碳源,添加一定量的环腺苷酸（cAMP）,对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，,可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。,90,（3）添加表面活性剂,表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。,将适量的,非离子型表面活性剂,，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。,由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。,91,（4）添加产酶促进剂,产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。,例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高120倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。,产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。,92,第四节 动、植物细胞培养产酶,与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。,93,植物、动物、微生物细胞的特性比较,细胞种类,植物细胞,微生物细胞,动物细胞,细胞大小/um,200,300,1,10,10,100,倍增时间/h,12,0.3-6,15,营养要求,简单,简单,复杂,光照要求,大多数要求,不要求,不要求,对剪切力,敏感,大多数不敏感,非常敏感,主要产物,色素、药物、香精、酶等,醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等,疫苗、激素、单克隆抗体、酶等,94,三者之间的差异主要有：,植物细胞,动物细胞,微生物细胞。,动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。,植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。,植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。,植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。,植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。,95,一、植物细胞培养产酶,1.植物细胞培养的培养基特点,应用最广的是MS培养基和LS培养基,MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。LS培养基是在其基础上演变而来的。,96,MS培养基组成:,配制1升（1000毫升）培养基时，加硝酸铵1.65克、硝酸钾1.9克、氯化钙0.44克、硫酸镁0.37克、磷酸二氢钾0.17克、碘化钾0.83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸镁22.3毫克、硫酸锌3.6毫克、钼酸钠0.25毫克、硫酸铜0.025毫克、氯化钴0.025毫克、硫酸铁27.8毫克、,蔗糖,30克和琼脂7克。,需要大量无机盐、多种维生素和植物生长激素、无机氮源、蔗糖碳源,2.培养方法：,悬浮细胞培养,细胞株的建立；,外植体与愈伤组织,扩大培养；,大罐培养；,97,外植体的选择：,从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。,从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。,98,但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异，培养的难易程度不同。为保证植物组织培养获得成功，选择合适的外植体是非常重要的。,外植体首先选择,无病虫害、生长力旺盛、生长有规则,的植株，如果植物细胞用于生产次级代谢产物，则需要从产生该次级代谢产物的组织部位中切取一部分组织，经过清洗，除去表面的灰尘污物。,99,愈伤组织：,将上述外植体植入诱导培养基中，于25左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。,100,水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织,外植体,愈伤组织,101,3.培养条件的影响与控制,（1）温度,对大多数植物组织2028即可满足生长所需，其中2627最适合,（2）pH,一般植物组织生长的最适宜pH为56。在培养过程中pH可发生变化，加进磷酸氢盐或二氢盐，可起稳定作用。,（3）通气与搅拌,悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时巨常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。,102,（4）光照的控制,组织培养通常在散射光线下进行。光的影响可导致不同的结果。有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须要有一定时间的光照才能形成芽和根。有些次生物质的形成，光是决定因素。,（5）前体的添加（饲喂）,前体是指处于目的代谢产物途径上游的物质。为了提高植物细胞培养生产次级代谢物的产量，在培养过程中添加目的代谢物的前体是一种有效的措施。例如，在辣椒培养细胞培养生产辣椒胺的过程中添加苯丙氨酸作为前体，可以全部转变为辣椒胺。,103,（6）诱导子（elicitors）的应用,诱导子可以促使植物细胞中的物质代谢朝着生成某些次级代谢物的方向进行，从而强化次级代谢物的生物合成，提高某些次级代谢物的产率。,104,二、动物细胞培养产酶,1.动物细胞培养的特点,细胞生长速度慢。（需添加抗生素）,细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。,反应过程成本高，产品价格贵。,细胞具有锚地依赖性,(,细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂,),。,原代细胞一般繁殖,50,代。,105,2.培养基,天然培养基 合成培养基 无血清培养基,氨基酸-必需氨基酸等，谷氨酰胺作为碳源和能源,维生素-血清提供B族维生素，维生素C,无机盐-血清提供，调节渗透压,葡萄糖-作为碳源和能源,激素-胰岛素、生长激素、氢化可的松,生长因子-表皮、神经、成纤维细胞生长因子,106,3.培养方法,(,1)悬浮培养(suspension culture),(2)贴壁培养(anchorage-dependent culture),(3)微载体培养(microcarrier culture),包埋(entrapment)和微囊(microencapsulation)培养,结团培养(aggregate culture),107,108,经48小时培养后，细胞已长成致密单层,致密单层细胞在细胞瓶上呈雾状，使瓶壁呈半透明,109,4.培养条件的影响与控制,（1）温度：一般控制在36.5.,（2）pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。,（3）渗透压:应与细胞内渗透压相同。,（4）溶解氧：根据情况随时调节。,110,第一节 酶生物合成及调节,第二节 酶发酵动力学,合成过程：复制,转录翻译,调节：,操纵子学说,调节种类：,诱导阻遏,同步合成型,中期合成型,延续合成型,滞后合成型,细胞生长动力学,产酶动力学,总 结,111,第三节 微生物发酵产酶,第四节 动、植物细胞培养产酶,产酶微生物的分离和选育的方法,微生物发酵产酶方法,酶发酵生产的一般工艺流程,发酵条件与控制,提高酶产量的方法,植物、动物、微生物细胞的特性比较,动物细胞培养的特点,动、植物细胞培养条件的影响与控制,112,