实验小鼠骨髓染色体制备与观察.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,你们好,实验三、小鼠骨髓染色体标本的制备及观察,一、实验目的,初步掌握（小鼠）骨髓细胞染色体标本的制备原理和方法,巩固显微镜的操作技术,了解小鼠的染色体形态特征,二、实验原理,染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。染色体异常也称染色体发育不全。目前已确认染色体病综合征,100,余种，智力低下和生长发育迟滞是染色体病的共同特征。,21,三体综合征；,18,三体综合征、猫叫综合征,18,三体综合征,二、实验原理,染色体标本的观察广泛应用于一些疾病的临床诊断中。例如白血病、恶性血液病等的诊断。,染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。,细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。,骨髓细胞 数量多且分裂旺盛，可直接进行染色体标本的制备。取材方便，操作简单和无需无菌培养，是研究小型哺乳动物等染色体的常用方法。,人骨髓染色体抽取,怎样才能制备一个好的染色体标本？,获得大量处于有丝分裂中期的细胞。,使细胞膜破裂，且染色体能够完整并较分散的释放出来。,秋水仙素处理：秋水仙素溶液可抑制纺锤体的形成，使正在分裂的骨髓细胞停止在细胞分裂中期，积累大量中期分裂相细胞。,低渗作用,:,使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。,预固定：终止低渗作用，使细胞离心时不易破裂，固定维持细胞形态结构。,高距离滴片：使细胞膜易于破裂，获得中期染色体标本，在显微镜下观察染色体的结构和数量。,三、实验器材和试剂,1.,器材 蜡盘、手术剪、小镊子、平皿、注射器、,10ml,离心管、吸管、量筒、预冷载玻片、试管架、离心机、恒温水浴锅、显微镜、乙醚酒精、擦镜纸,2,、试剂,100ug,秋水仙素液、,0.075 mol/L KCl,低渗液、,Giemsa,染液,1.,秋水仙素处理：选择体重,20g,左右的小白鼠，按,24ug/g(,小鼠,),秋水仙素，与处死前,4h,，对其进行腹腔注射,100ug/mL,秋水仙素液。,四、实验步骤,注意：剪去少量骨质，避免骨髓细胞丢失；擦净血迹和肌肉细胞以免影响观察；用,0.075 mol/L KCl,收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。,2.,取材：颈椎脱臼法处死 取两后肢股骨 纱布擦净肌肉 剪去股骨两头，暴露骨髓腔,低渗液,(5ml),冲洗至离心管内 收集骨髓细胞,颈椎脱臼法处死小鼠,3.,低渗：用吸管吹打骨髓细胞使其分散，加入预温,37,的低渗液至,8ml,将离心管至,37,水浴锅中，保温至少,30 min,后取出，使细胞充分吸水膨胀。,低渗不足，则细胞膨胀不够，滴片时细胞不破裂。,低渗过度，则细胞提前破裂，染色体观察不全。,空气吹打法：用吸管橡胶头内的空气混匀液体。,4.,预固定：加,1ml,新配制固定液 混匀,1500r/min,，,5min,弃上清液。,固定液（甲醇：冰乙酸,=3:1,）需现配；离心需要配平。,作用：终止低渗；维持细胞的膨胀状态；防止离心破裂,5.,固定、制细胞悬液：加固定液,5ml,吹打混匀,固定,15min,离心,1500r/min,，,5min,弃上清，加固定液,0.20.4ml,吹打成细胞悬液，准备制片使用。,制备细胞悬液时，根据具体情况加固定液，以悬液呈现乳白色为宜。,6.,滴片：冰片倾斜,30,细胞悬液距离玻片,30cm,高，在不重叠位置滴,1,2,滴，用口吹散细胞，过火焰干燥。,注意：载玻片预冷、高度、吹散、不可使载玻片烫手。,7.,染色：在玻片上滴几滴,Giemsa,染液并铺匀，,8,10min,，倒去染液，晾干。（染色盘中进行）,8.,小鼠染色体观察：低倍镜、高倍镜下寻找染色体分散的中期分裂相,.,小鼠骨髓染色体,10,10,小鼠骨髓染色体,10,40,数目观察：小鼠,2,倍体细胞染色体，数目,2n=40,条。其中,19,对为常染色体，一对为性染色体，染色体的核型分为,4,组。雄性,XY,雌性,XX,Y,染色体最小。,形态特征观察：端着丝粒染色体,“,U,”,“,V,”,。,五、注意事项,1,掌握好秋水仙素的浓度和处理时间；,2,离心前需要配平；,3.,小鼠骨髓要冲洗干净，以收集足够的骨髓细胞；,3,低渗处理是实验成败的关键，注意低渗时间；,4,固定液要现配现用，固定要充分；,5,载玻片要洁净并预冷，滴片要有一定的高度；,6.,细胞悬液不能太稀，要呈乳白色；,7.,烤片时温度不能太高。,8.,冲洗染液时水流要缓慢，以免细胞流失过多。,六、作 业,1.,简述小鼠染色体制备的流程。,2,、绘制显微镜下观察到的小鼠染色体图像。,3,、如看不到染色体，请分析失败原因。,