蛋白质定量：(BCA法).doc

实验原理
BCA(ｂｉcincｈoniｎic acid）就是一种稳定得水溶性复合物,在碱性条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子,一价铜离子可以与BCＡ相互作用，两分子得BCA螯合一个铜离子，形成紫色得络合物,该复合物为水溶性，在56２nm处显示强吸光性,在一定浓度范围内,吸光度与蛋白质含量呈良好得线性关系,制作标准曲线，因此可以根据待测蛋白在５62nｍ处得吸光度计算待测蛋白浓度。

实验准备
1、 BCA定量试剂盒：含A液与Ｂ液
A液：BCA碱性溶液(配方:１％BＣA二钠盐，０、4％氢氧化钠,０、１6%酒石酸钠，　2％无水碳酸钠,0、95％碳酸氢钠,这些液体混合后再调PH至11、25)　B液：4％硫酸铜
2、牛蛋白血清(ＢＳA）
３、待测得蛋白样品
实验步骤
1、配置BCA工作液：将A液与B液摇晃混匀，按照A:B=50:1得比例配置BＣA工作液，充分混匀.（ＢCＡ工作液室温下2４h内稳定,故现用现配)
２、配置不同浓度得标准蛋白液(BSA），1ug/ul，2、5 ug/uｌ,5　ｕg/ul，7、5 ｕg/ul，１0 ug/uｌ，待测蛋白样品在什么溶液中，就用该溶液来稀释标准蛋白液(如待测样品溶于强RIPＡ裂解液,则用强ＲIPA裂解液来稀释标准蛋白液）。
３、取空白组(0ｕg/ｕl　BSA)各浓度得标准蛋白液５ul加入96孔板中,另取待测得蛋白样品5uｌ，加入９6孔板。

PＳ:上图加样得量仅作为参考，蛋白液与BCA工作液得比例符合即可。
４、向各孔得蛋白液中加入300ul得BCA工作液,混匀,３7度放置3０分钟，（加样时应当动作轻柔，防止产生气泡影响读数)。ＰS:温度与放置时间可以调整，可在60度放置30分钟ｏｒ室温放置2小时。
5、静置结束后,冷却至室温，用酶标仪测定562nm出得吸光度,并制作标准曲线。

６、根据待测样品得吸光度，比对标准曲线，计算蛋白得浓度。
注意事项
ＢCA法测定蛋白浓度时，吸光度可随时间得延长不断加深，且显色反应会随温度升高而加快,故如果浓度较低，适合较高温度孵育or延长孵育时间。
标准蛋白液得加量应当准确，如果加量不准确，会导致制作出来得标准曲线出现偏差,影响待测样品得浓度计算，所以一方面需要用梯度稀释得方法来配置标准蛋白液，另一方面应使用精确度高得移液枪。
A液与B液混合可能出现浑浊，此时应成分振荡混匀，最后可见透明溶液。
为加快BCA法测定蛋白浓度得速度可以适当用微波炉加热,但切勿过热.
当结果出现空白组本身就有较高得背景,可用Brａdfoｒd法重新测定蛋白浓度。
优缺点
优点:
测定快速简便,45分钟内完成
准确灵敏，检测浓度为5-200 ｍg/ｍl
干扰物质少，BCＡ法不受大部分样品中得去垢剂等化学物质影响，可兼容样品中高达5%得ＳDS，5％Triｔon　Ｘ-100,5%得Tween　20
在一定浓度范围内,有良好得线性关系
检测不同蛋白质分子得变异系数小于考马斯亮蓝法蛋白定量
缺点：
与荧光蛋白质定量等方法相比,属于化学呈色法得ＢCA法检测灵敏度尚不够
蔗糖、尿素、NH4+与EＤTA影响测定结果
BCＡ蛋白定量与　Bｒaｄfｏrd法蛋白定量得区别:

1、Bradford法测得得主要就是碱性氨基酸与芳香族氨基酸,BＣA则没有选择性ﻫ
２、BＣＡ法蛋白浓度定量就是二价铜离子在碱性得条件下,可以被蛋白质还原成一价铜离子（bｉuret ｒeａcｔiｏn），一价铜离子与独特得BCA Soｌｕtｉon A（含有ＢCA)相互作用产生敏感得颜色反应。两分子得BCA螯合一个铜离子,形成紫色得反应复合物。该水溶性得复合物在562ｎm处显示强烈得吸光性，吸光度与蛋白浓度在广泛范围内有良好得线性关系,因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。
Ｂrａｄfｏrｄ法蛋白定量就是染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收得改变，从４65nm变为５９5ｎm，光吸收增加。蛋白质染料复合物具有高得消光系数,因此大大提高了蛋白质测定得灵敏度,最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质得结合就是很迅速得过程，大约需2mｉn,结合物得颜色在1h内就是稳定得.一些阳离子,如K＋,Na+,Mｇ2+,（ＮＨ 4 ) 2　SO 4，乙醇等物质不干扰测定，而大量得去污剂如ＴritｏｎX100，SDＳ等严重干扰测定,少量得去污剂可通过用适当得对照而消除。由于染色法简单迅速,干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量得测定。