石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法.doc

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石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法１、组织得采集、固定与保存: 采取组织后，方法一:4％多聚甲醛(４％PＦA）4°C 固定１小时（根据组织大小与致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bｏｕｉn’s固定RT 2h(6—8d teｓis)or RT　过夜(成年 tesis) ＰＢS缓冲液洗三次,每次5min,4°C保存于７0%乙醇中。２、组织得包埋、切片、展片及保存:: 　固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52—54°C石蜡包埋,常规切片，切片厚4 —10mm，贴于处理过得干净载玻片上,3７°C烤片过夜,之后收集于载片盒中，RT密封保存。石蜡包埋：保存于4°C 7０%乙醇中得组织样品 ¯ 80％乙醇　　15　min ¯ 　95%乙醇 15 mｉn 　 ¯ １0０%乙醇　15mｉｎ　´ ２ ¯　　　　 1/２乙醇1/2二甲苯　15 mｉn ¯ 　　二甲苯透明５－10　ｍiｎ　 ¯ 1／2二甲苯1/2石蜡 30　min ¯ 　石蜡（1) １、5hr 　¯ 　　石蜡（2) 1、5-2、5hr 　　¯ 石蜡（3) 包埋 ¯ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 　　　　密封保存于RT得组织切片　　¯ 二甲苯(1)　 20 mｉn ¯ 　二甲苯（2） 20　ｍin 　　　 ¯ 　 100%乙醇 20ｍin 　　 ¯ 　　 9５％乙醇 1０ min ¯ 　80%乙醇　１0 mｉn 　　 ¯ 　通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 ¯ 　　　切片在PBＳ中浸泡　5 min*２　　 ¯ 　 0、4％Tritonｘ RT 10 min 　　　　¯ 　　　切片在PBＳ中浸泡　5　ｍin*3 　　　　　　　　　　3％H2O2 RT　10min 　　切片在ＰＢS中浸泡　5　min＊3 　　　　　 0、25%胰酶　ＲT １０min 　　　　　　　　切片在PＢS中浸泡　 5 min＊3 　　　　　　　　　　　Blockiｎｇ bufｆer(３%BSA+５%NGＳ+0、2％Triｔonx-１00 ｉｎＰBS) ＲT 6０ｍin 　　　　　　　　　倾去blockinｇ　buffer，勿洗　　　　　　　　　　　　一抗４°C oveｒnight iｎ blockｉnｇ　ｂuｆfer 　　　　　　　　取出切片复温１ｈ，切片在PBＳ中浸泡　5 min＊3 　　　　　　二抗in blocｋinｇｂuｆfeｒＧAR1:20０ (GＡM1：100),RT 1h 　　　　　　　切片在ＰBＳ中浸泡　 5　min*3 　　　　ＤAB显色5—1０miｎ(5０微升A+50微升B+90０微升PBS+5微升３%H2O２）　　　　　　　如果就是增强型DＡB只要1ｍiｎ即可。　　　　　　　　　　切片浸入PBＳ终止显色，HE衬染1ｓ, 　　　　　玻片架放入泡沫盒,流水冲洗1５mｉn，肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。　　　　　　　　　　　　若颜色太深，可用０、1—0、5%盐酸乙醇分色1～2秒钟（或更久）　　　　　　　　脱水85%乙醇 5 min 　 ¯ 　　 95％乙醇　 5 min 　　 ¯ 　　无水乙醇５ｍin 　　 ¯ 　　无水乙醇　5ｍｉn ¯ 　二甲苯(1）　 1０min 　¯ 二甲苯(2） 10min 　　　　　　　　　　 ¯ 　　　中性树胶封片，室温干燥保存 4、石蜡组织切片得免疫荧光方法：　密封保存于RＴ得组织切片　　　 ¯ 　二甲苯(1） 20 min ¯ 　二甲苯(2）　２0 min 　　　 ¯ 　　 1０0%乙醇　 20miｎ　　　¯ 　 95％乙醇　１0 min 　 ¯ 　　8０％乙醇 10 min 　　　 ¯ 　通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈　　　¯ 　切片在PBS中浸泡　 5 min*2 　　¯ 　0、4％Ｔritｏｎx RT 　10 ｍin 　 ¯ 　　切片在ＰBS中浸泡 5 ｍiｎ＊3 　　切片在ＰＢS中浸泡 5　ｍin*3 　　　　　　　　　 0、２5%胰酶 RT 10miｎ　　　　　　　　　　　　切片在ＰBS中浸泡　　５ miｎ*３　　　　 Bｌｏcking buｆｆeｒ（3%BSＡ＋5％NGS+0、2％Tritonx-１０0 in　PBS) RT　60mｉn 　　　　　倾去bloｃking　buffｅr，勿洗　　　　　一抗4°C ｏvｅrnight　ｉn ｂlocｋiｎｇ buffer 　　　取出切片复温1ｈ,切片在PBＳ中浸泡　　５ｍin＊3 　　　　　　　荧光二抗in ｂlockinｇｂｕfｆｅr GAＲ—ｃｙ3 1：1000,GAM-4８8 1：100０RT　1ｈ　　　　　　　　 DＡPＩ（1:1０0０请根据二抗说明稀释二抗) 　　　　　　切片在PBS中浸泡　 5 min*3 　　 moil封片，避光4°C保存

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