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1、石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 １、组织得采集、固定与保存: 采取组织后， 方法一:4％多聚甲醛(４％PＦA）4°C 固定１小时（根据组织大小与致密程度调整固定时间）或过夜 方法二：采用bｏｕｉn’s固定RT 2h(6—8d teｓis)or RT 过夜(成年 tesis) ＰＢS缓冲液洗三次,每次5min,4°C保存于７0%乙醇中。 ２、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52—54°C石蜡包埋,常规切片，切片厚4 —10mm，贴于处理过得干净载玻片上,3７°C烤片过夜,之后收集于载片盒中，RT密封保存。 石蜡包埋：
2、 保存于4°C 7０%乙醇中得组织样品 ¯ 80％乙醇 15 min ¯ 95%乙醇 15 mｉn ¯ １0０%乙醇 15mｉｎ ´ ２ ¯ 1/２乙醇1/2二甲苯 15 mｉn ¯ 二甲苯透明 ５－10 ｍiｎ ¯ 1／2二甲苯1/2石蜡 30 min ¯ 石蜡（1) １、5hr ¯ 石蜡（2) 1、5-2、5hr ¯ 石蜡（3) 包埋 ¯ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片
3、 ¯ 二甲苯(1) 20 mｉn ¯ 二甲苯（2） 20 ｍin ¯ 100%乙醇 20ｍin ¯ 9５％乙醇 1０ min ¯ 80%乙醇 １0 mｉn ¯ 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 ¯ 切片在PBＳ中浸泡 5 min*２ ¯ 0、4％Tritonｘ RT 10 min ¯ 切片在PBＳ中浸泡 5 ｍin*3
4、 3％H2O2 RT 10min 切片在ＰＢS中浸泡 5 min＊3 0、25%胰酶 ＲT １０min 切片在PＢS中浸泡 5 min＊3 Blockiｎｇ bufｆer(３%BSA+５%NGＳ+0、2％Triｔonx-１00 ｉｎ ＰBS) ＲT 6０ｍin
5、 倾去blockinｇ buffer，勿洗 一抗４°C oveｒnight iｎ blockｉnｇ ｂuｆfer 取出切片复温１ｈ，切片在PBＳ中浸泡 5 min＊3 二抗in blocｋinｇ ｂuｆfeｒ ＧAR1:20０ (GＡM1：100),RT 1h 切片在ＰBＳ中浸泡 5 min*3 ＤAB显色5—1０mi
6、ｎ(5０微升A+50微升B+90０微升PBS+5微升３%H2O２） 如果就是增强型DＡB只要1ｍiｎ即可。 切片浸入PBＳ终止显色，HE衬染1ｓ, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗1５mｉn，肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。 若颜色太深，可用０、1—0、5%盐酸乙醇分色1～2秒钟（或更久） 脱水85%乙醇 5 min
7、 ¯ 95％乙醇 5 min ¯ 无水乙醇 ５ ｍin ¯ 无水乙醇 5ｍｉn ¯ 二甲苯(1） 1０min ¯ 二甲苯(2） 10min ¯ 中性树胶封片，室温干燥保存 4、石蜡组织切片得免疫荧光方法： 密封保存于RＴ得组织切片 ¯ 二甲苯(1） 20 min
8、 ¯ 二甲苯(2） ２0 min ¯ 1０0%乙醇 20miｎ ¯ 95％乙醇 １0 min ¯ 8０％乙醇 10 min ¯ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ¯ 切片在PBS中浸泡 5 min*2 ¯ 0、4％Ｔritｏｎx RT 10 ｍin ¯ 切片在ＰBS中浸泡 5 ｍiｎ＊3 切片在ＰＢS中浸泡 5 ｍin*3
9、 0、２5%胰酶 RT 10miｎ 切片在ＰBS中浸泡 ５ miｎ*３ Bｌｏcking buｆｆeｒ（3%BSＡ＋5％NGS+0、2％Tritonx-１０0 in PBS) RT 60mｉn 倾去bloｃking buffｅr，勿洗 一抗4°C ｏvｅrnight ｉn ｂlocｋiｎｇ buffer 取出切片复温1ｈ,切片在PBＳ中浸泡 ５ ｍin＊3 荧光二抗in ｂlockinｇ ｂｕfｆｅr GAＲ—ｃｙ3 1：1000,GAM-4８8 1：100０RT 1ｈ DＡPＩ（1:1０0０请根据二抗说明稀释二抗) 切片在PBS中浸泡 5 min*3 moil封片，避光4°C保存
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