常用临床生物化学检验技术.pdf

第四章常用临床生物化学检验技术 常用临床生物化学检验技术光谱分析技术：最基本和最常用 电化学分析技术电泳分析技术层析和离心分析技术 自动化分析技术教学目的和要求掌握：分光光度技术的基本原理及定性和定量方法1动生化分析仪的工作原理及参数设置熟悉：分光光度计的的基本结构操作方法光源检查和波长校正离心机相对离心力公式了解：离心机、自动生化分析仪的类型原子分光光度计的类型其他光谱分析技术的基本原理及应用第一节光谱分析技术光谱分析技术指利用物质具有,吸收光谱特点 发射I散射对物质进行稣分析方法。定量定义：利用各种化学物质所具有的发射、吸收 或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构 或含量的技术，称为光谱分析技术。光谱分析分类发射光谱:吸收光谱:散射光谱:火焰光度法原子发射光谱法 荧光光谱法；紫外分光光度法 可见光分光光度法 原子吸收分光光度法 红外光谱法；比浊法光波于两个波峰或波谷之间的距离称为波 长，其单位用纳米(nm)来表示。1nm=109monm波长11000m 射频区波长。.1100cm 微波波长760lOOOnm 远红外射线波长400760nm 可见光波长200400nm 紫外光波长10200nm 远紫外光波长10-310nm x射线波长5X10-3o i4nm 丫射线红外线 可见光紫夕卜线 X射线 A A A M、波长与颜色不同波长光线的颜色光的波长(nm)彦页色光的波长(nm)颜色620760 红色480 500 青色590620 橙 色430480 蓝色560590 黄500560 绿色色400430 紫色:、互补色把任意两种能 合成白光的单 色光，称为互 光（或互补色）。图3-1互补色示意图旭物质颜色与光的关系 溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点选择 性地吸收某种颜色的光所引起的。某溶液对各种颜色的透过程度相同，无色透明；如对各种波长的光完全吸收，呈现黑色 如对各种波长光完全反射,呈灰色 若只让一部分波长的光透过，即溶液呈现是与它 吸收的光完全互补的颜色。硫酸铜溶液因吸收黄色，而呈蓝色；高锦酸钾溶 液因吸收绿色，而呈紫色。Chlorophyll aP0qo s q es.ff-o+unoEqChlorophyll bWavelength of light(nm)表32物质的颜色和吸收光的颜色的关系物质的颜色吸收光颜色波长(nm)黄绿紫400450黄蓝450480橙青紫480490红青490500紫红绿500560紫黄绿560580蓝黄580600青蓝橙600650青红650750紫外可见分光光度计紫外分光光度计的波长范围：190nm400nm可见分光光度计的波长范围：400nm800nm紫外-可见分光光度计的波长范围：200nml000nm紫外光区可见光区屿字冈40800(nrn)黎外，可见光区电磁波滞任何一种溶液，对不同波长的光的吸收程 度是不相等的。图3-2吸收光谱示意图1.吸收峰2.波谷3.肩峰4.末端吸收Lambert-Beer 定律当液层厚度不变时，溶液吸光度与溶液 浓度成正比，称为Beer定律。利用溶液颜色的深浅来测定溶液中物质 含量的方法，称比色法。A=KCL1 r.三三迫度维三3hA为吸光度；K吸光系数；L为 溶液层厚度，称为光径；C为 溶液浓度。V-.-.一 *回工1r4 htJA/nmKMnO4溶液的吸收光 谱浓度：1234光谱分析仪器的 基本构 造紫外可见分光光度计X IO“nm 10 nm 102nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cmX射线 丫射线红外光 紫外光微波无线电波可见光光源单色器 吸收池 检测器显示系统721分光光度计3 2|图5-6 721型分光光度计540-=-586-50010二A m i o”图4-3 721型分光光度计结构示意图1.光源;2.聚光透镜;3.色散棱镜;4.准直镜;5.保护玻璃;6.狭缝;7.反射镜;8.光栏;9.聚光透镜；10.吸收池；11.光门；12.保护玻璃；13.光电倍增管/漆 T)E/T/表盘上透光率的读数为：TV63HX1/5W3.2T=63.2%A=-logT=0.199第三节计算方法（一）计算公式在标准溶液中：As=KsCsLs 在待测溶液中；Au=KuCuLu将两式相除可得：As_ KsGLAu KuCuLu摩尔吸光系数根据LamberbBeer定律，当液层厚度 为cm,浓度单位为mol/L时，吸光系数 K称为摩尔吸光系数，是特定波长下的 吸光度值。E的意义是：E是物质的特征性常数。在 固定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质的E不变，这是分光光度法对 物质进行定性的基础。摩尔消光系数E方法A L-C值与入射光波长、溶液的性质等因素有关如NADH在260nm时，为 15000在340nm 时，e 为 62202.比较法（对比法）每次随同测定管制备一个标准管，用已 知浓度的标准液与待测液经相同条件 处理，分别测定“标准管（S）”和“待测管（U）”的吸光度As和A”，按下式计算待测物浓度：As_ WLAu KuCuLuAu x Cs x Ls A(j x Cs x VsCu=-=-As x LuAs x VuA d=X C X V X-T7As s%VuX Q(mml/L)=X G(丽。山)X标准液用量(ml)X标本辐(曲)Cu(mdD=*c()X 标准液用量(ml)X 标本=)Cu(mg/dl)=yxCs(mg/ml)XAsVu(ml)100 xVs(ml)标本用量(ml)Cu(mg/dD=yxCs(m必ml)XAsVu(ml)x 100Vs(ml)标本用量(ml)使用标准比较法必须遵守的条件必须严格遵守朗伯-比尔定律 即吸光度与浓度成正比每次测定时需要作标准管，二者同时操作所 处环境的变化完全相同，误差就可以相互抵消。标准与测定的浓度愈接近，误差就愈小。缺点每次需要作标准管，繁琐，浪费试剂。结果需要计算，手续麻烦。标准管与测定管浓度不能相差太大。邻甲苯胺法测血糖，操作方法见下表加入物(ml)测定管(U)标准管(S)空白管(B)血清OJG标准液0.1(5mmol/LA蒸镭水0.1邻甲苯胺5.05.05.0混匀，置沸水中，加热煮沸12min,取出冷却,630nm“0”,测吸光度A03020计算:Cu(mmol/L)=XAs就(mmol/ml)X0.1(ml)XX UUU J 1.n 3Cu(mmo 1/L)=X 5=7.5(mmol/L)0.2Cu Wdl)=lOOmg/lOOmlX 0.1(ml)x n!Q1X As 0.1(ml)n aCu(mg/dl)=-X100=150(mg/dl)2.标准曲线法根据LamberbBeer定律，液体的浓度 在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应 包含高、中、低浓度范围），按标本处 理方法作相同处理，在特定波长下测定 吸光度，以标准液浓度为横座标适用反应结果比较恒定标准溶液不易保存的情况下方法 一般至少选5个等间距浓度。浓度范围在样品待测物浓度的1/22倍之间，吸光度范围在0051.0之间较为合适。按规定条件与样品作同样处理，在特定波长（一般选择入max）下测定它们的吸光度。横坐标表示标准液浓度，纵坐标表示吸光度,若符合Beer定律，则各对应点可连成一直线 并通过原点。如此绘出的曲线称为标准曲线在测得待测样品的吸光度后即可在标准 曲线上查出待测物浓度。图3-6 LDH标准曲线图注意事项 标准曲线不宜长期应用 试剂纯度应足够高，溶液浓度应配制准 确；应重复测定35次，每次设置平行管，以保证良好的重复性；坐标比例应适当选择，使绘出的直线与 横坐标的夹角在45。左右。标准曲线分类 标准曲线的拟合法可分为 目测法和计算法两种。标准曲线制备 比例的选择 最好是方块的即长与宽相等或纵：横=2:3o 一般是25X25cm2或用纵:横=2:3,如 20X30cm2比例坐标纸，浓度全距占多少格，A的全距也应占多 少格 空白A等于0,则绘出的曲线通过原点，成45。角的直线，若曲线大于或小于45。都不能准确样品浓度的选择一般包括待测样品的可能变异的最高值与最 低值。例如血LDH比色法测定，正常波动范 围在190437金氏单位，疾病时可能低至190 金氏单位，高至750金氏单位，所以标准曲线 浓度应从1251000金氏单位 一般原则是5种不同浓度，要求较高的一般选 择67种。浓度差距一般是等距或浓度差距相似，但应 同时考虑样品浓度较集中的一段，差距可以 小一些，如 LDH可选择 125、250、500、750、1000金氏单位。选点例如金氏法测血LDH试管 B 1金氏单位 0 125吸光度（A）0 0.12 3250 5000.2 0.34 5750 10000.4 0.5首先，确定浓度位置，因浓度一般是成倍增加，或者等级 增加，容易确定。假设横轴（x）有效长度采用250格（25 小格）则其位置为：金氏单位 0 125 250 500 750 1000横坐标位置0 50格 100格 150格 200格 250格那么纵坐标的有效长度也应取250格，可以先把最高吸光度（A：定出位置。A 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0纵坐标位置（格）250 200 150 100 50 0也可由以下两种方法确定：一种是求出1格相当于多少A,去除以 欲确定的A0.5/250=0.002 1 格/目当于0002A0.4/0.002=200格 另一种是求出0.01A相当多少格，去乘以欲确 定位置的A,0,5:250=0.01:x 即0.01相当于5格。(0.3/0.01)X5=150格0.3A相当于 150格 浓度位置向右延伸,A位置向上延长，交点即 为此座标点 若不能连成一条直线，有两个处理原则：通过原点，尽可能使直线通过更多的点，若有两点不在一条直线上，则使直线从两 点中间通过，不应使两点位于线段的一边图3-7标准曲线示意图图3-8曲线点连接方法示第光度分析工作曲线(6)标准曲线分类分为目测法和计算法两种。直视法计算法 标准曲线为直线时，直线回归方程式表直线回归分析是找出描述两个变量间关系的直 线方程，以确定一条最接近于各点的直线，使 各点与该直线纵向距离平方和为最小。这种方 程式为直线回归方程，这条直线为回归直线。Y=a-PbxX为溶液中物质单位；Y为推算吸光度估计值，是个变量；a是截距；b是回归系数，即斜率。当x变动一个单位时，平均变动b个 单 位，所以工作曲线的灵敏度由b决定。直线回归分析的任务是找出描述两个变量 间关系的直线方程，以确定一条最接近于 各点的直线，使各点与该直线纵向距离平 方和为最小。这种方程式为直线回归方程,这条直线为回归直线。回归方程所代表的直线在坐标平面上画出 来，只须知道两点坐标就行。这两点不宜离得太近，一般取一最小值和 最大值的两点，将这两点连接成一直线，其余各点均散布在两旁 标准曲线适用的范围应只限于X值的实测范 围以内，当测得待测样品的吸光度后，便 可很快从此曲线查出其浓度值（图36）。公式及计算只要算出斜率b和截距a即可求得直线回归方 程Exy-a=Y-bx b=r-xyZx2-22例如赖氏法制备血清ALT标准曲线。477 1500 L 325编号XYX2XY11000.10100001022000.18400003633000.27900008144000.3516000014055000.42250000210合计15001.32550000477平均3000.264550000-yZ xy-b 二-ZxZ xy-b=-Zx2 _zxyyn(Zx)2n477 1500 *2550000-1。，:;2004X 10s60000六、离心事故离心机转头损坏的原因（操作或使用不当所造成的）过速腐蚀金属疲劳不平衡第三节层析技术(chromatography technology)又称色谱技术、色层分离技术。第三节层析技术气相色谱(gas chromatography,GC)高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)薄层层析(thin layer chromatography,TLC)薄膜层析(thin memberane chromatography)亲和层析(affinity chromatography)凝胶层析(gel chromatography)离子色谱超临界流体色谱色谱-质谱联用色谱-红外光谱联用，层析的概念与分类（一）基本概念层析法是利用混合物中各组份的理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分 子亲和力、分配系数等）的差异，使各组分 以不同程度分布在固定相和流动相，从而以 不同速度移动而分离。（二）层析法分类1.按固定相和流动相所处的状态分类分为液相层析法和气相层析法两大类。2.按层析分离机制分类 吸附层析法 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析3.按操作形式不同分类 柱层析 薄层层析 纸层析 薄膜层析二、高效液相层析法(High Performance Liqiud Chromatography;HPLC)高效液相层析法是用特制微粒(vlOum)充填的层析柱作为固定相，通过高压使液 体流动相快速通过层析柱而达到快速有效 分离液相中各种物质的层析技术。HPLC分离效果好、分析速度快，检测灵敏度高 等特点。蛋白质、糖类、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等大分子以及高分子聚合物 度能用HPLC测定。HPLC输液系统、进样分离系统、检测系统和数 据处理系统等部分组成。流动相用一高压泵输入，由于流动相液体 中常溶有微量气体，脱去其中气体是很有 必要的。进样可以是注射器进样，也可以是进样阀 进木羊。HPLC使用的检测器最多应用的是紫外或紫 外可见分光检测器、荧光检测器、示差检 测器和电化学检测器等。1.液固吸附层析法：在色谱柱中填充固体吸附剂。待测组分通过色谱柱时，不断地被吸附剂吸附和被流动 相解吸附。基于不同组分被吸附和被解吸附的行为差异，从而达到 分离的目的。、常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、弗罗里硅土、分子晒 等。2.液液分配层析法：系在固体填充 颗粒上涂上一层薄薄的固定液，待测 组分在固定相和流动相之间进行连续 的分配萃取，由于其在两相间的分配 系数不同而达到分离目的。3.离子交换层析法 在色谱柱中填充离子交换树脂。带电离子随流动 相经色谱柱时，与带有异性电荷的树脂有一定的 亲和力而得以适当保留。由于各种离子与树脂的亲和力不同，其保留行为 也不同，从而得以分离。高效液相层析法是目前最好的血药浓度监 测方法，每次只能测定一种药物，至多只能测定一 类药物，无法测定性质不同的药物。高效液相层析法用于常规血药浓度监测，只适用于少量、常用的某些特定药物，大 大限制了它的推广应用。第四节临床生化自动化分析李艳教学目标和要求掌握：自动生化分析仪的分析方法类型及其 特点,连续监测法的理论K值，必选的分析参数。熟悉：分立式自动生化分析仪的基本结构，分析参 数，影响分析仪分析速度的因素和分析仪性能指标。了解：某些分析参数的特殊意义，分析仪的工作过 程和操作方法，干片式分析仪的结构和分析原理，常 用分析仪的分析性能。自动生化分析仪由电脑控制，将生化 分析中的取样(sampling)、加试剂、混匀、保温反应、检测(detect)、结果计算、可 靠性判断、显示和打印、以及清洗(cleaning)等步骤组合在一起自动进行操 作的分析仪器。自动生化分析技术的应用提高了临床生化检验质量和速度；减轻检验人员的劳动强度；节约样品和试剂；增加检验项目；提高检测精密度，减少实验误差；并且有利于临床检验标准化的实现。自动生化分析仪按其工作方式不同分为 连续流动式(continuous streaming movement style)或管道式：已很少用 离心式(centrifugation style):已很少用 分立式(discrete style):应用最广泛 干片式(drying style):急诊多用一、分立式自动生化分析仪的结构完全模仿手工操作方式设计，各部分结 构对应手工操作的每个步骤包括取样、加试剂、混匀、孵育、检测、结果计算、器材清洗等。工基本结构(一)样品盘或样品架样品盘(specimen disc):放置待测样品的转盘，可放置一定数量的 样品杯(specimen cup)或不同规格的采血试管，通过样品盘的转动来控制 不同样品的进样。样品架(specimen stock)：每个样品 架可放数只样品杯或采血试管(多为5只或10 只)。样品架的移动通过样品传送带来进行。样品架上的条形码(barcode)或编 码孔可识别样品架 号及样品位置号。标准品用QQJOJOQ 质控品用 ironroo 常规标本血清 Qrroro 常规标本尿犀onoro急诊标本用重测标本用清洗液用样品架的优点随着样品架移动及样品的被检测，可不断 追加已放置样品杯或采血试管的样品架；通过样品架的 移动能将样品传 送到另一个分析 模块(analysis die-block)甚至 另一台分析仪上 再进行分析。(二)试剂室和试剂瓶转盘式试剂室(reagent chamber)：内装 放置试剂瓶的转盘，一般可放置20种以上具有一 定形状的塑料试剂瓶，大型分析仪可放置3045 种试剂瓶。试剂瓶容量一般为10100山1。通过试剂转盘的 转动来选用不同 试剂。试剂架式试剂室：可放置容量为250nli 500nli的任意形状的试剂瓶，试剂瓶不能转动，但每个试剂瓶内引出一条试剂管路及其喷嘴，即每种试剂均有专用的加试剂装置，因而不同 试剂间无交叉污染。但试剂管路较长使试剂存在一定的死体积,因而适宜用于使用频率高、消耗试剂量大的检 测项目。大型分析仪同时备有第一试剂室和第二试 剂室，即具备对同一检测项目添加两次试剂的 功能，个别分析仪还具有加入第三试剂的功能。对有条形码装置的仪器可将带条形码的试剂瓶放在试剂室转盘 上的任意位置，仪 器能自动识别试剂 的种类、批号和有 效期。试剂室均具 有冷藏装置，可将 试剂保存在410。（三）反应杯和反应盘反应杯（reaction cup 是样品与试剂进行化学反应 的场所，同时用作比色杯。由透光特性好的硬塑料或石 英玻璃制成。比色杯光径不 同分析仪有0.5 0.7厘米不 等，大多数分析仪在计算时 将其折算为1厘米光径。反应盘(reaction disc):100只 或更多的反应杯围成一圈组成。在测定 过程中反应盘作恒速的圆周运动，在静 止时向反应杯中加入样品、试剂或进行 搅拌混匀，当反应盘恒速圆周运动经过 检测窗口的比色杯可进行吸光度检测。(四)取样和加试剂装置1.取样装置(sampling assembly):由取样针、取样臂、取样管路、取样注射 器和阀门组成，能定量 吸取样品并加入到反 应杯。不同分析仪的取样 容量有不同的范围，一般为235 口1，步 进0.1微升不等。取样针设有电子 液面感应器，取样针 于样品上方下降，一 旦接触到样品液面即 停止下降而开始吸样。适用于不同的采血试 管上机测定多数加样装置设有防撞功能，遇到阻 碍时取样针立即停止运动并报警。某些取样 针还设有阻塞报警功能，当取样针被样品中 的凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自 动报警、冲洗取样针，并跳过当前样品，进 行下一个样品的取样检测。取样针防交叉污染(crossing contamination)措施绝大多数采用水洗方式(又有瀑布式和涌 泉式之分)，在吸取另一个样品前对接触样品 的样品针内外壁进行冲洗；也有采用化学惰性液(chemical inertia fluid)膜的方式来隔绝样品与取样针内外壁之 间的接触。2.加试剂装置加试剂装置用于定量吸取试剂加入反应 杯，可加入试剂容量一般为20350 口1。步 进15微升不等，取样精度在1微升左右。注射器方式：组成部件与取样装置类似,其液面感应系统能检测并提示试剂剩余量。灌注式：具有许多条试剂管路及其喷嘴,每种试剂单独使用一条试剂管路和喷嘴，不 存在各试剂间的交叉污染。大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，可分别从两个试剂室吸取同一个检测项目的第 一试剂和第二试剂，大多数分析仪所有检测项 目加入第二试剂的时间点统一固定为1个或2个 点，也有分析仪有3个加入时间点可供选择。o八（五）混匀与搅拌装置反应杯里的样品与试剂通过搅拌棒搅拌而 充分混匀，搅拌棒的形状为扁平棒状或扁平螺 旋状，表面的疏水材料能防止反应液被搅拌棒 所携带。其工作方式大多为旋转式搅拌，也有 震动式搅拌方式。也设置了防止搅拌棒在不同 反应液之间携带交叉污染的清洗措施。（六）温控和定时系统温控系统使反应杯浸浴在恒温环境：恒温循环水浴方式：温度传递速度快，保 养要求较高。恒温空气浴方式：温度传递速度不如恒温 水浴循环方式，保养简单。温度控制器能使循环水或循环空气的温度 控制在规定温度0.1。规定温度可有37C 和30C两种选择，一般固定在37C。定时系统：不同分析仪对检测吸光度的间隔时间 有不同的规定，反应时间应该设定为此 间隔时间的倍数。总反应时间一般限制 在8.5-L0min内，个别分析仪可以设定为 15 或 22min 等。（七）光路和检测系统自动生化分析仪以紫外可见分光光度 法为其中心和主要的检测手段，与一般分 光光度计一样，其光路和检测系统由光源、单色器和检测器组成。1.光源(lightsource)一般为卤素鸽丝灯（halogentungsten filament lamp），也有采用 长寿命的氤灯（xe lamp）,要求在340800nm波长范围内能发射出稳定且较平坦的光能。落2.单色器(monochromato)干涉滤光片（interference f iIter）分 光系统：常带有340、380、405、500、550、600、660nni等几种滤光片，各滤光片固定在 转盘上，以转盘旋转的方式来选择波长。这 种分光系统在半自动和小型自动分析仪中常 用，且不能同一时刻进行多波长检测。光栅（raster）分光系统：常在340（或 293）800nm范围内选择1013种固定的单 色光。前分光和后分光方式光栅分光有前分光和后分光两种方式，光源首先经过单色器分光，然后透射到比色 溶液的方式为前分光。目前以后分光方式为 多见，其优点是单色器中没有转动部分，双 波长在同一时刻检测，因而提高了检测的精 度和速度。后分光方式光源先透过比色杯中的反应液再照射到 光栅上，经色散后所有固定单色光同时通过 各自的光纤传输到对应的检测器，微处理器 按该分析项目的分析参数，选择其中 一个或两个波 长（双波长方 式）的吸光度 值，用于分析 结果的计算。3.检测器(detector)由光敏二极管及放大电路组成，可按设定 的间隔时间连续测定各反应杯的吸光度值。&7(A)数据处理系统具有多种数据处理功能。计算测定结果 判断结果准确性 保存各种数据 自我诊断功能(九)清洗系统反应杯清洗装置：一个反应杯内的反应和 检测结束后，该反应杯就被冲洗系统及时冲洗。清洗过程：由废液针吸取反应杯内废液，加入清洗剂(detergent)冲洗并抽干后，再经 数次去离子水冲洗及抽干，然后做杯空白的吸 光度检查，若通过检查则此反应杯可继续循环 使用；更高级的仪器带有风干技术。如果不能 通过，分析仪将提示该反应杯异常，并跳过此 反应杯使用下一个反应杯，或提示更换反应杯。样品针、试剂针和搅拌棒清洗一般在用于下一个样品、试剂或反应杯前 即清洗一次，此时多数为去离子水冲洗，在一 批检测完成后，则自动进行清洗剂清洗。清洗剂可配有1至3种可供选择，除一种常 规清洗剂外，其它1至2种可按设定对试剂针、样品针或反应杯进行补充清洗。二、组合式自动分析仪(-)组合式自动生化分析仪将相同或不同的两台或两台以上的分析部分，即 分析模块进行组合连接，采用样品架方式使样品通过 传输线在不同分析模块间进行传递并检测。各分析模 块所分析项目的组合提高了分析效率，这些分析模块 除了基于紫外-可见光谱分析原理的分析模块外，还 有基于离子选择电极的电解质分析模块，甚至还可组 合建立在免疫发光分析原理的免疫分析模块。组合式分析仪(二)实验室自动化系统(laboratory automation system,LAS)包括样品前处理系统、样品输送系统和各样 品分析系统。不同功能的各模块以同一标准来连 接，通过计算机控制运行。随着检测样品量的增 加，只需添加需要的新模块，将其安装连接，即 可扩大处理能力。这样可避免同类硬件和功能的 重复投资，节省占地面积所需的基础投入。当一 模块发生故障时，其余模块仍在运行，在24小时 内任意时间对模块进行交替保养维护，不影响日 常工作。样品前处理系统能独立工作，由样品投入部、离心分离部、开栓部、在线分注部、非在线分注部、贴条码部、盖栓部、样品分注收存部、样品接收部等模块构 成前处理系统，每一模块既是系统的部分，又是 独立的单元，可根据不同需要选择使用，具有灵 活性和扩展性。也可通过样品输送部分与样品分析系统连接,组成类似工业领域的生产流水线，从而实现了从 采血到报告的实验室的全自动化。第二节生化自动化分析方法概要一、分析方法分类(一)终点法(end assay)被测物质在反应过程中完全被转变为产物,到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被 测物浓度，称为终点法。该法称为平衡法更为 恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点 或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数 设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。终点时间的确定根据时间-吸光度曲线来确定，根据被测物反应终点，结合干扰物的反 应情况来确定。1.一点终点法(one point end assay)在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上 吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。结果计算公式：待测物浓度。=（待测吸光度A-试剂空白吸光度Ar）XKK为校准系数图43 点终点法反应曲线A单试剂一点终点法B双试剂一点终点法2.两点终点法(two point end assay)在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择 第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择 第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结 果。计算公式为：，=（待测吸光度A?-待测吸光度A】）xKo图44两点终点法反应曲线A单试剂两点终点法时间B双试剂两点终点法时间图4-5血红蛋白、胆红素和脂浊的 光吸收曲线该法能有效地消除 溶血(hemolysis)、黄疸(icterus)和 脂浊(lipo-turbid)等样品本身光吸收造 成的干扰。Wavelength(二)固定时间法(fixed-time assay)指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度,这两点的吸光度差值用于结果计算。有时也 称此法为两点法。计算公式与两点终点法相同，cr(a2-ap xko图46固定时间法反应曲线A单试剂固定时间法B双试剂固定时间法该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。（三）连续监测法(continuous monitoring assay)又称速率法（rate assay）,是在测定酶 活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时 间-吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度 差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单 位吸光度变化值（AA/min）计算结果。图47连续监测法反应曲线A单试剂连续监测法B双试剂连续监测法酶促反应的线性段3及，值偏小,而62=63=64,故A1点至A4点属线性段连续监测法的优点可以确定线性期并计算AA/min，根据此 值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分 析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢 物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性（U/L）=A A/min x理论（或校准）K值。代谢物浓度，=A/min x校准K值。1.理论K值多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公 认的校准品可用。根据酶活性的国际单位定 义得出酶活性的计算公式为：酶活性（U/L）=AA/minx xTFE xSTxd将此式中以K来表示，即为理论K值 E xSTxd可作为分析参数输入到分析仪中。采用理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯 光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进 电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造 成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差，温度的影响有时也非常大。由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长 等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩 尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不 同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后来计算理论K值。(1)NADH(NADPH)摩尔吸光系数的测定NADH(NADPH)没有标准纯制品，而 且配成溶液后稳定性又较差，不能直接 用NADH或NADPH标准液来校正仪器，须 通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径。用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法 测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成 呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品。根据公式A=bC,已知比色杯光径b和葡萄 糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度 A后便可计算出NADH(NADPH)的摩尔吸光系 数s为A/bCo测定方法葡萄糖标准液浓度为10mmol/L(0.01mol/L),标准液加 入量为3.5)liL,酶试剂加入量为335 rL,比色杯光径为 0.7cm,在340nm测得吸光度为0.465,则实测NADH摩尔 吸光系数=-65 =6424,即在此台分析仪上0.7x0.01x-335+3.5340nm波长处测得NADH(NADPH)的摩尔吸光系数为6424,而理论上NADH(NADPH)的&为6220。(2)“色素原”酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定有许多酶底物为人工合成的“色素原”底物，其本身无色，经 酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰。ALP底物磷酸对硝基苯酚(4-Nitrophenyl phosphate,4-NPP)经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-NitrophenoL 4-NP)GGT底物丫-卜谷氨酰对硝基苯胺(y-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或Y-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(丫-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline,4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid,ANBA)o以对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定为例试剂：4-NP标准储存液（10mmol/L）4-NP标准应用液（2.5mmol/L,以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成）底物缓冲液（15mniol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37,pH 10.090.02）o测定方法4-NP标准液加入量为5rL,底物缓冲液 加入量为350 n L,波长405nm,光径0.7cm,温度37C,测定得吸光度为A1；另用蒸锵水 代替4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度 为卜2,4-NP标准液吸光度AA=AAr若测 得AA为0.460,则实测4-NP摩尔吸光系数=186622.校准K值酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动 计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件 的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏 差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使 用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准K 值为好，但必须有两个先决条件：必须使用 配套的试剂；必须使用配套的高质量的校准 品，该校准品应具有溯源性。(四)透射比浊法抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物,在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光 度法进行透射比浊(transmission turbidimetry)测定，可用于某些蛋白质和药 物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非 线性回归，求出抗原或抗体的含量。二、常用生化检测项目分析方法举例1.终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩腺法）、血清白蛋白（澳甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶 法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇 氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶 法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮种III法）、磷（紫外法）、镁（二甲 苯胺蓝法）等。2.固定时间法苦味酸法测 定肌酊采用此 法。3.连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法,如：丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移 酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、丫谷氨氨酰 基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢 物酶法测定的项目如：胭酶偶联法测定尿素 等，也可用连续监测法。4.透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应 的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗“0”、类风湿因子,以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结 合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。5.比浊法(Turbidity)通过检测物质对光的散射或透射强度 来测定物质的方法称比浊法。比浊法是一种浊度测定，不是比色测 定，可做终点分析、动态分析。比浊法V化学比浊法，免疫比浊法一透射比浊I散射比浊主要用于血清特种蛋白的检测，如载脂蛋白、微 量蛋白、急性时相反应蛋白、免疫球蛋白等，以 及某些药物监测。比浊法原理已知特异抗体与血清中相应的抗原结合形成抗 原抗体免疫复合物，并形成微细颗粒，混悬于 溶液介质中，光线通过这种浑浊介质溶液时被 吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正 比。在抗体量一定的条件下，抗原越多，抗原抗体 复合物越多，溶液越浑浊，吸收光越多，以此 对抗原进行定量该法是目前使用最为广泛的方法，快速准确，可在自动生物化学分析仪上作批量检测。Bacterial suspensionSpectrophotometerLight-sensitive detectorPercent light transmitted第三节分析参数设置各种测定项目的分析参数(analysis paramete)大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式,用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外 留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定 分析参数。因此必须理解各参数的确切意义。一、分析参数介绍（一）必选分析参数1.试验名称(test code)2.方法类型(也称反应模式)(assay mode)3.反应温度4.主波长(primary wavelength)5.次波长(secondary wavelength)6.反应方向(response direction)7.样品量(sampling volum)常量、减量和增量。8.第一试剂量(first reagent volum)一般20-300 二 19.第二试剂量(second reagent volum)同上。10.总反应容量(total reacting volum)一般180-350 Ri,个别仪器能减少至120 口1。11.孵育时间(incubate t ime)12.延迟时间(delay t ime)13.连续监测时间(continuous monitoring time)一般为60120s,不少于4个吸光度检 测点(3个吸光度变化值)14.校准液(calibrator)个数及浓度15.校准K值(calibrate coefficient)或理论K值16.线性范围(linearity range)17.小数点位数(decimal point digit)（二）备选分析参数这类分析参数与检测结果的准确性有关,一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能 检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等,检测结果可能不准确。1.样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀 释后样品量三个数值，便可在分析前自动对 样品进行高倍稀释。2.底物耗尽值(substrate exhaust 1 imit)在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底 物已太少，不足以维持零级反应而导致检测 结果不准确。3.前区检查免疫比浊法中应