基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,-,无忧,PPT,整理发布,无忧,PPT,整理发布,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,-,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,-,*,无忧,PPT,整理发布,导 师,:,王红静教授,研究生,:,张晓燕,PTEN,基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究,1,-,研究背景,2,-,子宫内膜异位症（,endometriosis,，,EM,s,），是妇科常见疾病之一，组织学上虽然是良性的，但却有增生、浸润、转移及复发等恶性生物学行为。药物及手术治疗复发率均高。究其原因主要是,EM,s,的病因及发病机制尚未完全明了。,3,-,自,1921,年,Sampson,首先提出子宫内膜种植学说以来，在,EMs,众多的病因及发病机制中，种植学说虽被大多数学者所接受，但它无法解释盆腔外,EMs,的发生，也无法解释多数育龄妇女存在经血逆流，但仅少数（,10%-15%,）发病。,4,-,越来越多的研究表明,EM,s,与高血压、糖尿病、精神分裂症等一大类疾病一样被认为受多基因遗传及多因素的影响。,现今的研究表明，子宫内膜碎片必须通过粘附、侵袭及血管形成，方可以生存、生长。这一过程的完成是由在位内膜的不同生物学特征，即基因差异决定的。,5,-,因此，当前的研究重点在于寻 找和鉴定,EM,s,相关的遗传基因。,6,-,PTEN,(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,，,PTEN),是,1997,年发现的一种新的抑癌基因，,是继,P53,基因之后发现的在人类肿瘤中突变率最高的基因。也是子宫内膜腺癌中发现的突变率最高的基因，被认为是子宫内膜的“看家基因”,。研究发现,PTEN,与子宫内膜相关性疾病如,EM,s,的发病密切相关,。,7,-,PTEN,通过调控细胞周期，抑制细胞分化,抑制细胞,粘附和迁移,，,诱导凋亡等参与肿瘤的发生、发展。,内异症患者在位内膜可能因抑癌基因,PTEN,失活而表现出与正常内膜不同的生物学特性,如细胞粘附增强，凋亡减少，血管形成能力增强，从而容易在异位部位存活并生长，继而引起相应的症状和体征。,8,-,PTEN,基因突变、杂合性缺失及多态性,改变与多种肿瘤如食道癌、膀胱癌等的发病密切相关。其基因突变、杂合性缺失与,EMS,的相关性研究报道也较多，而,PTEN,多态性与,EMS,的相关性研究才处于探索阶段。,9,-,PTEN-9C/G,(,以下简读为,-9C/G,）单核苷酸多态性,(,SNP),及,PTENS4-/+,（以下简读为,IVS4-/+),为,PTEN,基因最常见的两个多态性位点，此两个位点多态性的改变与食道癌,、鼻咽癌的相关性研究已见报道。国内外目前尚无,此两个位点多态性的改变与,EM,s,的相关性研究报道。,10,-,PTEN-9C/G SNP,位于,PTEN,翻译起始点上游的第,9,位核苷酸处，,CG,的替换使得,G,周期性地出现，它非常接近翻译时使核糖体停留在阅读框架内的交感序列，因此,CG,的替换可能影响,PTEN,的表达。,PTENS4-/+,为第,4,内含子的一个插入性多态，可能通过不同剪切及通过与其它位点连锁来影响其基因表达。,11,-,本研究,首次,采用聚合酶链反应,-,限制性,片段长度多态性,(,polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP,),技术对,PTEN-9C/G,及,IVS4-/+,基因进行分型，旨在探讨此两个位点的多态性与,EMs,的关系。,12,-,材 料 与 方 法,13,-,主要实验仪器及设备,名称 型号 生产厂家,洁净工作台 上海力申科学仪器有限公司,高速离心机,TG19A.WS,美国,BECKMAN,公司,低温离心机,TGL-16H,珠海黑马医学仪器有限公司,普通冰箱,BCD-130H,青岛海尔股份有限公司,电子天平,PB3002-S,瑞士,Mettler,公司,PCR,扩增仪,PTC,一,200,美国,MJReseareh,公司,Eppendorf,移液器,0.1-1000ul,德国,Eppendorf,公司,紫外扫描仪,GelDoe1000,美国,BioRad,公司,稳压稳流电泳仪,DYY-III3,北京市六一仪器厂,电泳槽,Sub,一,CellModel96,美国,BioRad,公司,凝胶成像分析仪,AlphaImagerTM2200,美国,Alpha Innotech,公司,14,-,主要实验试剂,试剂名称 生产厂商,全血基因组,DNA,提取试剂盒 北京博大泰克公司,引物合成 上海生工,DNA,胶回收试剂盒 北京博大泰克公司,PCR,纯化试剂盒 上海生工,蛋白酶,K (Germany)Merck,公司,限制性内切酶,AflII New England Biolabs,限制性内切酶,DraII New England Biolabs,100bp DNA ladder,华美生物工程公司,15,-,研究对象,EM,s,组：,86,人，,无,肿瘤性及遗传性疾病病史，术后病检证实为子宫内膜异位症的患者。,对照组：,64,人，,同期因输卵管阻塞继发不孕、宫外孕及子宫脱垂等手术，术后病检排除,EM,s,，且无肿瘤性及遗传性疾病病史的患者。,16,-,标本采集,采集每位研究个体的外周血,3ml,，,EDTA,抗凝，置,4,冰箱保存，并于采血后,1,周内提取符合条件的研究对象的外周血白细胞,DNA,。,17,-,实验方法,微量全血基因组,DNA,提取试剂盒，,提取全基因组,DNA,聚合酶链反应,-,限制,性片段长度多,多态性,(PCR-RFLP),技术，,扩增,-9C/G,和,IVS4-/+,多态位点的,基因片段,分别,PCR-AflII,、,PCR-DraII,酶切消化后行,基因分型,18,-,DNA,的提取,用微量全血基因组,DNA,提取试剂盒，提取全基因组,DNA,。,19,-,100l,裂解液,20lRNaseA/,蛋白酶,K,，,55,温浴,30min,12000 rpm,离心,1min,，,弃尽上清,100lTE,10000 rpm,离心,1.5min,弃上清,300l,红细胞裂解液,300l,抗凝全血,等体积红细胞裂解液,加入,10l3MnaAC,、,1250l,结合缓冲液,加入,600l,漂洗液,加入,30l ddH2O,洗脱，,-20,保存,24,小时,将所提,DNA,进行,Agarose,电泳泳,20,-,PTEN,的基因分型,采用聚合酶链反应,-,限制性片段长度多态性,(PCR-RFLP),方法进行基因分型。,21,-,PTEN,IVS4-/+,引物,:,上游引物：,5-GGG GGT GAT AAC AGT ATC TA-3,下游,引物：,5-CTT TAT GCA ATA CTT TTT CCT A-3,22,-,dNTPs,5l,10X Buffer,5l,MgSO4,2l,上下游引物,各,2l,模板,DNA,100ng(1l),KOD-Plus,1l,ddH2O,32l,PCR,反应体系,23,-,72,延伸,1min,58,退火,45s,94,变性,30s,94,预变性,5min,35,个循环后，,72,继续延伸,5min,PCR,反应条件,扩增产物为,403bp,24,-,PTEN,IVS4-/+,PCR,产物酶切电泳后判断基因型,纯化,PCR,产物,10l,经限制性内切酶,AflII(2l),于,37,酶切过夜,行,2.5%,琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪下观,察判断基因型,-/-,纯合型显示,403bp,一条电泳带，,+/+,纯合型显示,335bp,和,73bp,两条电泳带，,-/+,杂合型显示,403bp,、,335bp,和,73bp,三条电泳带,25,-,PTEN-9C/G,引物为,:,上游引物：,5-GCA GCC GTT CGG AGG ATT-3,下游引物：,5-GCCGCAGAA,ATG GAT ACA GG-3,26,-,PTEN-9C/G PCR,反应体系及反应条件同扩增,PTEN,IVS4-/+,。,27,-,PTEN-9C/G PCR,产物 酶切电泳后判断基因型,纯化,PCR,产物,10l,经限制性内切酶,DraII(10l),于,37,酶切过夜,行,2.5%,琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪下观,察判断基因型,C/C,纯合型显示,371bp,的,一条电泳带,G/G,纯合型显示,266bp,和,105bp,两条电泳带,C/G,杂合型显示,371bp,、,266bp,和,105bp,三条电泳带,28,-,统计学分析,数据用,SPSS13.0,软件进行统计学分析，,P0.05,认为有统计学意义。,比较基因型频率的观察值与预期值，并进行卡方检验行,Hardy-Weinberg,平衡分析。病例组与对照组的基因型及等位基因分布采用卡方检验，,用,OR,值,及其,95%,可信区间，,分析,PTEN-9C/G,、,IVS4-/+,多态性与,EM,s,的关系。,29,-,结 果,30,-,一,.,研究对象的一般特征：,1.,平均年龄,EMS,组：,35.47.69,岁,对照组：,35.612.24,岁,两组比较，平均年龄差异无统计学意义,(t=0.122,P,0.05),31,-,2.,家族史,EMs,阳性家族史，,EMs,组为,24.4%,，对照,组仅,10.9%,，两者相比有统计学意义,(,2,=4.392,P,0.05),。,EMs,阳性家族史明显增加,EMs,的发病风险，,OR,值,2.6308,（,95%CI=0.8117-5.1771,）,。,32,-,二,.,PTEN,基因,S4,-/+,扩增产物,Afl,酶切电泳结果,PTEN S4-/-,纯合型产生,403bp,一条电泳带,PTEN S4+/+,纯合型产生,335bp,和,73bp,两条电泳带,PTEN S4-/+,杂合型产生,403b,、,335bp,、,73bp,三条电泳带,33,-,Fig.1 Genotype pattern for PTEN IVS4(-/+)polymorphism,analyzed by PCR-AflII digestion.,Lane 1:+/+homozygous genotype,Lane 2:-/-homozygous genotype,Lane 3,，,4,，,5,and 6:-/+heterozygous genotype,34,-,三,.,PTEN,基因,-9C/G,扩增产物,DraII,酶切电泳结果,:,C/C,纯合型产生,371bp,的,一条电泳带,G/G,纯合型产生,266bp,和,105bp,两条电泳带,C/G,杂合型产生,371bp,、,266bp,和,105bp,三条电泳带,35,-,Fig.2 Genotype pattern for PTEN-9C/G polymorphism,analyzed by PCR-DraII digestion.,Lane 1,4 and 6:C/G heterozygous genotype,Lane 2 and 3:G/G homozygous genotype,Lane 5:C/C homozygous genotype.,36,-,Genotype,Observed,Expected,2,and P,EMs,-/-,10,24.61,-/+,72,42.79,2,=32.25,+/+,4,18.60,P,0.05,Control,-/-,7,14.54,-/+,47,31.93,2,=14.25,+/+,10,17.53,P,0.05,Control,C/C,58,58.14,C/G,6,5.72,2,=0.154,G/G,0,0.14,P,0.05,五,.PTEN-9C/G,多态位点的基因型分布,38,-,Group,EMS,Control,2,P,OR,（,95%CI,）,C/C,76(88.4),58(90.6),C/G,9(10.4),6(9.4),G/G,1(1.2),0(0.0),C/G+G/G,10(11.6),6(9.4),0.195,0.658,0.7862(0.7044-5.9662),六,.PTEN-9C/G,基因型分布与,EMs,的发病风险,39,-,Group,EMS,Control,2,P,OR,（,95%CI,）,-/-,10(11.6),7(10.9),-,/,+,72(83.7),47(73.5),+,/,+,4(4.7),10(15.6),5.239,0.073,a,(-/-)+(-,/,+,),82(95.3),54(84.4),5.22,0.02,b,3.796(1.1328-12.7227),七,.PTEN IVS4-/+,基因型分布与,EMs,的发病风险,40,-,EMS,n(%),Control,n(%),OR(95%CI),2,P-value,a,-9C/IVS4+,71(41.28),62(48.44),1.00(reference),-9C/IVS4-,90(52.33),60(46.88),0.7634(1.2787-3.2865),1.258,0.262,-9G/IVS4+,9(5.23),5(3.90),0.6362(0.6523-6.4426),0.607,0.312,-9G/IVS4-,2(1.16),1(0.78),0.5726(0.1815-23.1593),0.208,0.555,八,.PTEN,单体型与,EMs,的发病风险,41,-,讨 论,42,-,一,.,研究对象的一般特征,1.,平均年龄,EMS,组：,35.47.69,岁,对照组：,35.612.24,两组比较，平均年龄差异无统计学意义,(t=0.122,P,0.05),说明病例组与对照组年龄分布具有可比性。,43,-,2.,家族史,阳性家族史,EMs,组为,24.4%,，对照组为,10.9%,，两者相比有统计学意义,(,2,=4.392,P,0.05),。,OR,值,2.6308,（,95%CI=0.8117-5.1771),说明,EMs,阳性家族史明显增加,EMs,的发病风险,。,进一步证实了,EMs,的家族遗传倾向。,44,-,二,.,分析,PTEN,基因,-9C/G SNP,及,IVS4-/+,基因型及等位基因频率分布情况,本研究中,PTEN-9C/G SNP,的基因型分布在,EMs,病例组及对照组中均符合,Hardy-Weinbery,平衡，,表明研究对象具有群体代表性。,45,-,PTENIVS4-/+,基因型分布在,EMs,病例组及对照组中均,不符合,Hardy-Weinbery,平衡，可能的原因有：突变、选择、随机遗传漂变、迁移及遗传异质性。,46,-,本研究人群中，,PTENIVS4-/+,杂合型,(73.5%),明显高于另两种类型,（,-/-10.9%,，,+/+15.6%,），这是,Hardy-Weinbery,平衡计算中影响其遗传平衡的主要因素，可能跟遗传选择中的,杂合子优势,有关，具体原因有待进一步研究。,47,-,本研究对照组中,-9C/G SNP,的基因型分布（,C/C 90.6%,、,C/G9.4%,、,G/G 0.0%,）与日本人群,(C/C 95.0%,C/G 5.0%,G/G 0%),相似；而,IVS4-/+,多态的基因型分布（,-/-10.9%,、,-/+73.5%,、,+/+15.6%,）与美国人群,(-/-43.1%,-/+45.7%,+/+11.2%),有显著差别。,48,-,在不同种族不同地区人群中,PTEN,基因的多态性可能分布相似或存在差异。,49,-,三,.,分析,PTEN-9C/,G,基因型分布与,EMS,发病风险,合并,PTEN-9C/,G,及,G/G,基因型,与,C/C,基因型相比，,携带,G,等位基因,(C/G+G/G),不改变,EMs,的发病风险，,与,张小爱及,Ge,等分别在,PTEN-9C/G,多态性与,鼻咽癌 及食道癌中的研究结果一样。,50,-,位于,PTEN,非编码区的,-9CG,多态性改变可能不改变抑癌基因,PTEN,的功能，不增加,EM,s,的发病风险。,51,-,四,.,分析,PTENIVS4-/+,基因型分布与,EMs,的发病风险,在合并,PTEN IVS4,基因,-/+,和,-/-,后与,+/+,相比，病例组与对照组差异有统计学意义,(P,0.05),。,52,-,PTENS4,基因多态性中，突变型,(+/+),可能降低,EMs,的发病风险。这与,S4+/+,基因型降低食管癌的发病风险的报道一致，但与,IVS4+/+,基因型可增加较年轻者患乳腺癌的风险的报道不同。,53,-,在不同类型肿瘤中,PTEN S4,多态性发挥不同的作用,同时也存在不同人群中这一多态存在着对肿瘤易感性的差异的可能性。因此有必要在某一确定的人群中进行不同类型疾病的研究,来评价,PTEN S4,多态性的作用。,54,-,五,.,分析,PTEN,单体型与,EMs,的发病风险,在,PTEN-9C/G,和,IVS4-/+,构成的单体中：,-9C/IVS4-,为,EMs,病例,组中最常见,-9C/IVS4+,为对照组中最常见,55,-,与,对照组中最常见的单体型,-9C/IVS4+,相比：,-9C/IVS4-,、,-9G/IVS4+,、,-9G/IVS4-,三种单体型在,EMs,组及对照组中的分布无统计学差异；也均不增加,EMs,的发病风险。这与,Ge,等的研究结论（,-9C/IVS4-,单体型增加食管癌的发病风险,),结果不同。,56,-,PTEN-9C/G,和,IVS4-/+,这两个多态位点构成的单体型中，是否可能通过相互连锁，共同影响对肿瘤及,EMs,的易感性,需要进一步扩大样本量并通过单体型,-,表型的关系来阐明。,57,-,结 论,58,-,1,EMs,家族史明显增加,EMs,的发病风险。,2,与,PTEN-9C/C,基因型相比，携带,G,等位基因,(,即,C/G/+G/G,基因型,),不影响,EMs,的发病风险。,59,-,3.PTEN IVS4+/+,基因型可以降低,EMs,的发病风险，是,EMs,发生的保护性因素。,4.,与,-9C/IVS4+,单体型相比：,-9C/IVS4-,、,-9G/IVS4-,、,-9G/IVS4+,单体型不影响,EMs,的发病风险。,60,-,致 谢,首先，感谢我的导师,王红静教授！在王教授的倾力支持和严格要求下，本课题得以顺利完成。导师无论在课题确定、实验设计还是论文撰写上都倾注了大量心血，特别是对我科研思维、科研实践能力的全面培养将使我受益终身。导师敏锐的科研思维、严谨的治学态度、忘我的工作作风以及宽厚善良的品德是我工作和学习的楷模。在此，谨向我的导师王红静老师致以我最诚挚的敬意和最衷心的感谢。,衷心感谢王平教授、何跃东副教授、师弟贾西彪、景彩霞硕士、检验科李文胜老师、杨琴硕士、杨堃硕士、方堃硕士、谢聪硕士、何蕾硕士等在学习和实验过程中的大力支持和帮助！,衷心感谢各位论文评阅老师、答辩主席、各位答辩委员在论文的评阅及答辩过程中付出的辛勤劳动！,感谢我的亲人对我学习的全力支持，感谢他们在我学习生活中所做出的牺牲，以及他们给予我的关心、理解、支持与帮助！,61,-,谢谢各位老师指导,62,-,