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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。,细胞系与细胞克隆,1/28,教学目：,1、掌握传代培养概念和方法,2、了解细胞系建立过程,3、掌握克隆细胞几个方法,2/28,细胞系,cell line,：原代培养物经首次传代后即成。,有限细胞系,finite cell line:,不能继续传代或传代数有限。,连续细胞系,continuous cell line,：可连续传代细胞系，即已建成细胞系。,细胞株,cell strain,：经过选择法和克隆形成法从原代培养物或细胞系中取得含有特殊性质和标志培养物。,有关概念,3/28,一、传代培养（,passage）,概念：不论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。,4/28,（一）传代培养方法,1、从生长器皿上解离细胞方法：,1）震荡法。,2）胰蛋白酶消化法,3）胰蛋白酶-柠檬酸盐,4）用EDTA洗细胞再用胰蛋白酶-柠檬酸盐处理,5）EDTA洗再用胰蛋白酶-EDTA消化,6）,EDTA洗再用胰蛋白酶-胶原酶配合柠檬酸盐或,EDTA消化,7）机械刮削法（scraping）,8）分散酶（0.1mg/ml)或蛋白酶(0.1-1.0 1mg/ml),5/28,2.单层培养细胞普通传代步骤:,倒出旧液,PBS洗涤,胰蛋白酶消化,吸出消化液,加入培养液,吹散细胞,计数,稀释,培养,6/28,离心法：离心后去上清，加培养液，吹 打，传代。,直接传代法：将细胞慢慢沉淀，将上清吸去,1/2-2/3，加培养基，传代。,3、悬浮细胞传代培养,7/28,(二)传代培养注意事项,1、传代时机与传代培养细胞密度：细胞没生长到足以覆盖瓶底壁大部分表面前，不要急于传代。,2、传代数或代数：指对培养物传代次数。,3、尽可能少传代，防止转化。,8/28,二、细胞系建立,正常细胞系建立程序包含：,原代培养 第一次传代 常规传代和冻存、,复苏等阶段。,9/28,细胞系维持,细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传代时间等；,传代换液有规律，否则会引起生物学特征改变；,多种细胞维持传代，要防止交叉污染；,要有充足冻存贮备，防止因污染造成绝种；另外，细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。,10/28,1、证实细胞系种系。染色体分析、同工酶分析、DNA指纹技术。,2、明确细胞系组织起源 细胞抗原标识方法,3、细胞是否是正常细胞，有没有发生恶性转化正常细胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体。,4、,细胞有没有交叉污染 。同工酶方法是快速有效，每一个细胞系在琼脂糖电泳上有特异同工酶带型。,DNA指纹技术也能够判定。,判定细胞系内容：,11/28,三、细胞克隆,细胞克隆（,clone）是指单个细胞经过有丝分裂形成细胞群体，他们遗传特征相同。,细胞克隆化培养（cell cloning culture）：又称单个细胞分离培养，是指将单个细胞在一定支持物上增殖培养而产生细胞群落过程。,12/28,（一）,克隆培养技术,稀释铺板法,喂养层克隆法,胶原膜板,琼脂克隆法等,分类：,13/28,14/28,1.稀释铺板法：最惯用,消化,低密度细胞悬液制备接种标识与培养分离扩大培养观察移植瓶或皿内培养,稀释铺板法图解,15/28,注意事项：,1）确保一个细胞,2）轮廓清楚完整，体积适宜健康,3）不需换液,16/28,2、喂养层克隆法,喂养细胞（,feeder cell）：也称滋养细胞，是一层经过射线或丝裂霉素C处理过供其它细胞附着细胞层。成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞。,注意：3周内喂养细胞即死亡，要及时应用,17/28,喂养层克隆图解,18/28,3、胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法：,1）胶原膜板或血纤维蛋白膜板制备,2）消化、稀释、接种和培养待克隆细胞,血纤维蛋白膜板制备,A液：0.2g凝血酶,100ml培养液,B液:250mg 牛血纤维蛋白原、800mg NaCl、25mg 柠檬酸钠、1000毫升双蒸水,A：B=4：1,19/28,4、琼脂克隆法：,用于病毒转化细胞、恶性转化细胞。,2%琼脂母液-45水浴-混合成0.33%琼脂培养液加入试管内 2.5ml-45水浴,20/28,琼脂克隆法图解,21/28,5、在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化,2%琼脂母液-45水浴（琼脂母液和2倍浓度培养液）-1：1混合-45水浴,铺板,细胞悬液内加等体积,1.5%甲基纤维素混合后铺于琼脂层上培养,22/28,在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化图解,23/28,（二）影响克隆形成率原因,克隆形成率,(cloning efficiency)是指向底物接种单细胞悬液能形成细胞小群百分数,影响原因：,1、细胞密度。10个/ml,2、培养液。HamF12k,3、血清,4、喂养细胞,5、激素和生长因子：胰岛素，地塞米松，EGF，BFGF。,6、CO27、适应性生长基质：胶原层，血浆纤维蛋白层，多聚右旋赖氨酸，纤维连接蛋白，琼脂,24/28,（三）克隆分离,克隆化环分离法,25/28,2、射线照射分离克隆法,将培养瓶倒置放于,X射线或,钴,60,源下，用,2mm厚铅片盖住选中克隆。,3、悬浮细胞克隆分离,24孔板加入1ml培养液用毛细吸管吸收群落吹入培养板内,26/28,1、概念：细胞系，细胞株，传代培养，细胞克隆，克隆形成率,2、判定细胞系应包含内容,3、常见克隆培养技术有哪几个，简明叙述其技术关键点,4、影响克隆形成率原因,5、克隆分离方法和技术关键点,作业,27/28,谢谢大家！,28/28,
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