第三章谷氨酸生产菌的特征育种及扩大培养-PPT.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章谷氨酸生产菌的特征育种及扩大培养,目录,contents,1,2,3,4,谷氨酸生产菌得主要特征,国内谷氨酸生产菌及其比较,谷氨酸生产菌在发酵过程中得形态变化,谷氨酸发酵得代谢控制育种策略,5,利用生物工程技术选育谷氨酸生产菌,6,菌种得扩大培养及种子得质量要求,第一节,、,谷氨酸生产菌得主要特征,一、现有谷氨酸生产菌得分类,现有谷氨酸生产菌主要就是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中得细菌。,1、,棒状杆菌属,(,Corynebacterium,),直到微弯得杆菌,一端膨大呈棒状,折断分裂形成,“,八,”,字形或栅状排列。葡萄糖发酵产酸,G,+,2,短杆菌属,(,Brevibacterium,),短得不分枝直杆菌。多数从葡萄糖发酵产酸,不发酵乳糖。,G,+,3,小杆菌属,(,Microbacterium,),形态与棒状杆菌相似。发酵葡萄糖产酸弱,主要产乳酸。,G,+,4,节杆菌属,(,Arthrobacterium,),培养过程中,细胞形态变化较大,球菌 杆菌,杆菌 球菌。,G,+,G,-,G,-,G,+,能液化明胶,从碳水化合物产酸极少或不产酸。,二、谷氨酸棒状杆菌基因组研究进展,谷氨酸棒状杆菌,ATCC 13032,GenBank NC-004369,目前应用发酵法生产,L-,乳酸常用得微生物仅有两大类,:,一类为细菌,多采用乳酸菌,另一类为根霉。根霉可以直接利用淀粉质原料生产,L-,乳酸,但就是产酸量低,副产物多,转化率低。,Sauer,等构建了包含乳杆菌,L-,乳酸脱氢酶基因得毕氏酵母,它利用木糖发酵,初始浓度为,100g/L,生产,L-,乳酸达到,58g/L,比利用葡萄糖产生乳酸得水平高。,基因工程育种(重组,DNA,技术),三、现有谷氨酸生成菌得主要特征,(,1,)细胞形态球形、棒状以及短杆状。,(,2,),G,+,无芽孢、无鞭毛,不能运动。,(,3,)需氧型、生物素缺陷型微生物。,(,4,),脲酶强阳性,(,5,)不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白以及明胶。,(,6,)发酵中菌体发生明显得形态变化,同时发生细胞膜渗透性得变化。,(,7,),CO,2,固定反应酶系活力强。,大家学习辛苦了，还是要坚持,继续保持安静,(,8,)异柠檬酸裂解酶活力弱,乙醛酸循环弱。,(,9,),-,酮戊二酸氧化能力微弱。,(,10,),NADPH2,进入呼吸链能力弱。,(,11,)柠檬酸合成酶、乌头酸梅、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强。,(,12,)能利用醋酸,不能利用石蜡。,(,13,)具有向环境中泄露谷氨酸得能力。,(,14,)不分解利用谷氨酸,并能耐高浓度得谷氨酸,产谷氨酸,5%,以上。,第二节 国内谷氨酸生产菌及其比较,1,、形态特征,短杆至小棒状,有时微弯曲,两端钝圆,不分枝,呈多种形态。,单个、成对及,“,V,”,字形排列。,G+,。胞内有横隔。不运动。无芽孢。,一、北京棒杆菌,(AS1299),得形态与生理特征,2,、培养特征,普通肉汁琼脂平板:菌落圆形,24h,白色,48h,淡黄色,中央隆起,表面湿润、光滑,有光泽,边缘整齐且呈半透明状,无黏性,不产生水溶性色素。,3,、生理特征,对氧得要求:好氧及兼性厌氧。,与温度得关系:菌株,2637,培养生长良好,不耐高温,41,生长较弱。,pH,得影响:,Ph510,均能生长,最适,pH67、5,。,还原硝酸盐:反映强烈。,石蕊牛奶培养:,7d,后微产碱。,不水解淀粉,不分解纤维素。,对尿素得耐力,2、6%,以上生长受抑制。,脲酶试验:强阳性反应。,产酸物质得测定:,G,、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖迅速产酸。,生长因素试验:生物素就是必需生长因素。硫胺素明显促生长。,二、钝齿棒杆菌,(AS1542),得形态与生理特征,1,、形态特征,短杆至棒状,有时微弯曲,两端钝圆,不分枝。单个、成对及,“,V,”,字形排列。,折断分裂。,G,+,。胞内有横隔。不运动。无芽孢。,2,、培养特征,普通肉汁琼脂平板:菌落圆形,近草黄色,表面湿润、光滑,无光泽,边缘顿齿状,较薄,半透明,无黏性,不产生水溶性色素。,对氧得要求:兼性厌氧。,与温度得关系:菌株,2037,培养生长良好,不耐高温,42,不生长。,pH,得影响:,pH69,生长良好,pH10,生长微弱,pH45,已不能生长。,还原硝酸盐:反映强烈。,石蕊牛奶培养:,7d,后微产碱。,水解淀粉,不分解纤维素。,对尿素得耐力,2、6%,以上生长受抑制。,脲酶试验:强阳性反应。,产酸物质得测定:,G,、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵等迅速产酸。,生长因素试验:生物素就是必需生长因子。,3,、生理特征,三、天津短杆菌,(T613),得形态与生理特征,典型得短杆状,有时微弯曲,两端稍钝圆,不分枝。单个、成对及,“,V,”,字形排列。折断分裂。,G,+,。不运动。无芽孢。,1,、形态特征,2,、培养特征,普通肉汁琼脂平板:菌落圆形,浅黄色,表面湿润、光滑,隆起,边缘整齐,较薄,半透明,无黏性,不产生水溶性色素。,3,、生理特征,对氧得要求:好氧及兼性厌氧。,与温度得关系:菌株,2637,培养生长良好,75,处理,10min,不再生长。,pH,得影响:,pH610,生长良好,pH5,生长微弱,pH4,与,pH11,已不能生长。,还原硝酸盐:反映强烈。,不水解淀粉,不分解纤维素。,对尿素得耐力,5%,以上生长受抑制。,脲酶试验:强阳性反应。,产酸物质得测定:,G,、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵,生长因素试验:生物素就是必需生长因子。硫胺素就是促生长作用。,四、北京棒杆菌,(7338),与钝齿棒杆菌,(B9),得比较,后提取容易,收率较高,质量较好,分泌色素较多,2、5,天津短杆菌,(T613),与钝齿杆菌,(B9),得比较,T613,感染噬菌体时,不能换用,B9,调换,7338、,第三节 谷氨酸生产菌在发酵过程中得形态变化,斜面与一、二级种子在不同培养条件下,细胞形态基本相似。斜面培养得菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮,革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状,有得微呈弯曲状,两端钝圆,无分枝,;,细胞排列呈单个、成对及,“,V,”,字形,有栅状或不规则聚块,;,分裂得细胞大小为,0、7,0、9*1、0,3、4um,。由于生物素充足,繁殖得菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。,一、种子得菌体形态,二、谷氨酸发酵不同阶段得菌体形态,长菌型细胞:发酵,0-8h,或,0-10h,。短杆至棒状,有得微弯曲状,细胞单个、成对及,V,字形排列。,转移期细胞:发酵,8-18h,或,10-20h,。细胞开始伸长、膨大。在生物素贫乏得条件下,从谷氨酸非积累型转变成谷氨酸积累型。转移期有长菌型细胞,也有产酸型细胞。,产酸型细胞:发酵,16-20h,后。细胞为含磷脂不足得异常状态,呈伸长、膨大、不规则状,缺乏,V,字形排列。发酵后期,细胞较长,呈有明显得横隔得多节细胞,产酸高。,过量生物素,不同阶段得细胞形态则基本上没有明显得变化。菌体较粗壮,类似于长菌型细胞。典型得异常发酵,长菌体、耗糖快、耗尿素快、发酵周期短、低酸或不产酸。,三、谷氨酸发酵感染噬菌体后得菌体形态,发酵前期感染噬菌体后,菌体细胞明显减少,细胞不规则,发圆、发胖,缺乏,字形排列,有明显得细胞碎片,严重时出现拉丝、拉网,互相堆在一起,几乎找不到完整得菌体细胞,类似蛛网或鱼翅状。,在发酵中、后期感染噬菌体后,菌体细胞形态不规则,边缘不整齐,有得边缘似乎有许多毛刺状得东西,有细胞碎片。,第四节、谷氨酸发酵得代谢控制育种,一、日常菌种工作,1,、定期分纯,1-2,个月分离纯化一次,2,、小剂量诱变刺激,用紫外线(,10-20s,)处理,可以淘汰生长微弱得菌株,并能激发溶原性噬菌体,使挑出来得菌产酸高、生长旺盛、无噬菌体感染。,3,、高产菌制作安瓿管,育种后分纯得高产菌种需保存到安瓿管中,防止菌种变异。,二、选育耐高渗透压菌种,耐高糖突变株,选育在含,20-30%,葡萄糖得平板上生长好得突变株。,耐高谷氨酸突变株,选育在含,15-20%,味精得平板上生长好得突变株。,耐高糖、高谷氨酸突变株,选育在含,20%,葡萄糖、,15%,味精得平板上生长好得突变株。,三、选育不分解利用谷氨酸得突变株,选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱得突变株。,四、选育细胞膜渗透性好得突变株,生物素亚适量,吐温,-60,青霉素,温度敏感株,五、选育强化,CO,2,固定反应得突变株,六、选育减弱乙醛酸循环得突变株,七、选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到,-,酮戊二酸代谢得突变株,八、选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反,馈调节得突变株,九、选育强化能量代谢得突变株,耐谷氨酸、谷氨酸结构类似物、谷氨酰胺抗性突变株,第五节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,一、应用原生质体融合技术,钝齿棒杆菌,B9,(,细胞个体大、易于提取;产酸率低,),天津短杆菌,TG-866,(,产酸率高,),融合子,F263(,细胞个体大、产酸率高,),二、应用转化法,三、应用转导法,四、应用重组,DNA,技术,第六节 菌种得扩大培养与种子得质量要求,一、菌种扩大培养得目得,接种量得需要,菌种得驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,二、菌种扩大培养得过程,1,、斜面菌种得培养,培养基:葡萄糖,0、1%,蛋白胨,1%,牛肉膏,1%,氯化钠,0、25%,酵母膏,0、5%,琼脂,2%,pH 7、0-7、2,培养基特点:有利于菌体得生长,原料比较精细。,生长斜面要求:,32,生长,18-24,小时,生长良好,所使用斜面连续传代不超过,3,次,2、,一级种子培养(摇瓶),培养条件:于,1000ml,三角瓶中,装液,200-250ml,32,培养,12,小时。,培养基:葡萄糖,2%,尿素,0、5%,玉米浆,2、5%,K,2,HPO,4,0、1%,FeSO,4,2mg/k,MnSO,4,2mg/kg PH7、0,培养基特点:有利于菌体得生长,所使用得原料,已经基本接近于发酵培养基,、,一级种子培养得质量要求:,种龄:,12h,PH,:,6、4,光密度:,OD,值净增,0、5,以上,残糖:,0、5%,以下,噬菌体检查:无,镜检:菌体生长均匀、,粗壮,排列整齐,革兰氏染色:阳性反应。,3、,二级种子培养,(,种子罐,),培养基:水解糖液,3%,尿素,0、4%,Na,2,HPO,4,0、3%,玉米浆,2、5%,KCl 0、14%,消泡剂,0、5-1kg,PH7、0,培养条件:在种子罐中培养(容积为发酵罐得,1%,),32,培养,7-10,个小时,二级种子培养操作流程,种子罐配料,培养基加至罐体积,60-75%,空消,0、2MPa,130,50min,打料,实消,接种,0、1 MPa,118,5min,二级种子培养得质量要求:,种龄:,7-8h,PH,:,7、2,光密度:,OD,值净增,0、5,以上,残糖:消耗,1%,左右,噬菌体检查:无,镜检:菌体生长旺盛,排列整齐,革兰氏染色:阳性反应。,三、影响种子质量得主要因素,培养基,温度,pH,值,溶解氧,接种量,种龄,本章作业:,一、简述现有谷氨酸生成菌得主要特征。,二、简述谷氨酸发酵不同阶段得菌体形态。,三、谷氨酸发酵日常菌种工作有哪些？,四、简述菌种扩大培养得一般过程。,五、简述二级种子培养操作流程。,