免疫实验专题知识讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,免疫实验专题知识讲座,免疫实验专题知识讲座,第1页,免疫标识技术（,immunolabelling technique,）,:,是指用荧光素、放射性同位素、,酶,、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标识抗体或抗原进行抗原抗体反应。,特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位,分类：,免疫酶技术,、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。,免疫实验专题知识讲座,第2页,免疫酶测定法,(,E,nzyme,I,mmuno,A,ssay,EIA),用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。,辣根过氧化物酶,(HRP),，碱性磷酸酶,(AP),特点：,高度特异性：保持抗原抗体反应特异性,高灵敏度：酶催化底物显色高效性，,pg,水平微量检测,定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值,分类：,酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,酶免疫组化法：组织中或细胞表面抗原。,免疫实验专题知识讲座,第3页,一、原理,酶联免疫吸附试验（,ELISA,）是一个固相酶免疫测定方法，当前广泛应用于各种抗原和抗体检测。其基础原理是：将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标识抗体或抗原联结，并保持并保留酶活性，然后加入酶反应底物，后者被酶催化变为有色产物，,反应颜色深浅可与对应抗原或抗体量相关,。,在本试验中，以,辣根过氧化物酶,标识,抗人,IgG,抗体，与对应抗原,IgG,结合，标识酶可催化底物（,邻苯二胺,）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应存在。,免疫实验专题知识讲座,第4页,二、材料：,1,、人,IgG,包被微量酶标反应板,，,（,1,：,1,万，,1,：,2,万，,1,：,4,万，,1,：,8,万，,1,：,16,万）,2,、酶标抗人,IgG,抗体稀释液、洗涤液（,PH7.4,，,0.01MPBS-Tween20,）、底物溶液，,3,、微量移液器、移液头、吸水纸、洗瓶、湿盒、,37,恒温箱等。,免疫实验专题知识讲座,第5页,三、方法：,1.,人,IgG,包被微量酶标反应板：取人,IgG,各,100ul,，分别加入第,1,至,5,孔，设第,6,孔为对照。置,37,恒温箱,2,小时，取出，移入,4,冰箱过夜。取出，用洗涤液洗,3,次，,5,分钟,/,次。,(,略）,2.,用含小牛血清（,BSA,）,PH7.4PBS,封闭，置,37,恒温箱，,30,分钟，取出。用洗涤液洗,3,次，,35,分钟,/,次。（略）,3.,用微量移液器吸收,100ul,酶标抗人,IgG,抗体，分别加入第,6,至,1,孔。置湿盒中，于,37,恒温箱中孵育,30,分钟。,4.,取出酶标板，用洗涤液洗,3,次，,35,分钟,/,次。,5.,按第,6,孔至第,1,孔次序，每孔各加,100ul,底物溶液，置,37,恒温箱中,10-15,分钟。,6.,观察显色反应。,免疫实验专题知识讲座,第6页,用,PBS,洗涤,3,次（将洗板液加入每孔，,3,min,后倾去），以洗去未结合游离酶标抗体。,不一样浓度,IgG,100ul/,孔,酶标板,1,2,6,5,4,3,酶标抗人,IgG,抗体,底物,观察显色,免疫实验专题知识讲座,第7页,四、结果,1,6,5,4,3,2,15,孔，伴随包被抗原浓度降低，颜色逐步变淡,6,孔（对照）无色,五、结论,ELISA,可简便、快速、定量地检测抗原或抗体,免疫实验专题知识讲座,第8页,操作注意事项：,1,、正确掌握微量移液器使用方法：一档取样，二档加样。,2,、正确洗涤酶标板：勿使洗涤液溢出，造成交叉污染洗涤后应尽可能甩干孔内残液。,3,、注意加样次序，加样品时应注意从最高稀释度逐一加至最低稀释度。,4,、底物,OPD,有一定致癌作用，故操作时应小心，勿使底物沾染试验台等器材。,5,，枪头（移液头）忌丢入试验台微生物专用废液缸内。,免疫实验专题知识讲座,第9页,ELISA,分类,直接法（,Competitive ELISA),：,将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标识抗原或抗体,检测液相中可溶性抗原或抗体,间接法（,Indirect ELISA,）：,将已知抗原吸附于固相载体，酶标识二抗,检测液相中未知抗体,双抗体夹心法（,Sandwich ELISA),：,将已知抗体吸附于固相载体，酶标识一抗,检测液相中可溶性抗原,免疫实验专题知识讲座,第10页,Sandwich ELISA,indirect ELISA,免疫实验专题知识讲座,第11页,ELISA,检测抗原,Ag+Ab*Ag-Ab*,免疫实验专题知识讲座,第12页,ELISA,检测抗体,Ab+Ag*Ab-Ag*,免疫实验专题知识讲座,第13页,ELISA,检测抗体,Ag +Ab1 Ag-Ab1,Ag-Ab1+Ab2*Ag-Ab1-Ab2*,免疫实验专题知识讲座,第14页,免疫实验专题知识讲座,第15页,间接,ELISA,（可测各种细菌或病毒抗体，用途广泛）,显色,免疫实验专题知识讲座,第16页,免疫技术：,以抗原,-,抗体反应原理为基础，对样品中对应抗原或抗体进行检测。,标识技术：,将可被探测示踪物质用化学方法与化合物连接。,标识免疫分析：,用可微量或超微量检测示踪剂标识抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。,免疫标识技术,补充,免疫实验专题知识讲座,第17页,放射免疫技术,免疫荧光技术,酶免疫技术,三大经典标识技术,三大经典标识技术,免疫实验专题知识讲座,第18页,放射免疫,RIA,以标识抗原与反,应系统中未标识,抗原竞争结合特,异性抗体来测定,待检样品中抗原,量。,免疫放射,IRMA,以过量标识抗体,与抗原非竞争结,合，采取固相免,疫吸附载体分离,游离和结合标识,抗体。,放射受体分析,RRA,放射配体结合,分析,RBA,其它,放射免疫技术原理,免疫实验专题知识讲座,第19页,二、放射免疫技术常见放射性核素,125,I,3,H,射线,理化性,活泼,差,核素丰度,90%,半衰期,60.2d 12.3y,标识方法 简单 复杂,标识设备 低廉 昂贵,测量条件 简单 复杂,常见标识核素,免疫实验专题知识讲座,第20页,荧光抗体技术,荧光免疫测定,均相荧光免疫测定,（,homogeneous fluorescence immunoassay,）,非均相荧光免疫测定,（,heterogeneous fluorescence immunoassay,）,荧光免疫技术,荧光免疫技术是将抗原抗体反应特异性与荧光技术敏,感性相结合，反抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。,荧光免疫技术类型,免疫实验专题知识讲座,第21页,荧光抗体技术基础原理,荧光素标识抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察展现特异荧光抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对本身抗体进行定性和滴度测定。,免疫实验专题知识讲座,第22页,Immunofluorescence,IF,免疫实验专题知识讲座,第23页,荧光显微镜,利用一定波长激发光对样品进行激发，产生一定波长荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,免疫实验专题知识讲座,第24页,病原体检测,寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）,细菌（藤黄微球菌,),荧光抗体技术应用,免疫实验专题知识讲座,第25页,免疫病理检测,肿瘤（人肝癌细胞）,荧光抗体技术应用,免疫实验专题知识讲座,第26页,主要试剂,:,酶标识抗体或抗原,酶标物特点：,免疫学活性,酶对底物催化活性,抗原抗体反应特异性,+,酶高效催化反应专一性,酶免疫测定法原理及特点,免疫实验专题知识讲座,第27页,特点：,灵敏度高、特异性强、准确性好,酶标识试剂能够较长时间保持稳定,操作简便、对环境没有污染。,易与其它技术偶联,衍生出适用范围更广新方法,。,原理：,酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）特异性反应,酶对底物显色反应,反抗原或抗体进行定位、定性或定量测定分析,原理及特点,免疫实验专题知识讲座,第28页,辣根过氧化物酶（,HRP,）,糖蛋白（主酶）,亚铁血红素（辅基）,主酶与酶活性无关,辅基是酶活性中心,RZ,值：,403nm,（辅基）与,275nm,（主酶）,OD,值之比,RZ,值与酶活性无关，酶活性单位比,RZ,值更为主要,ELISA,中应用最为广泛标识用酶,常见酶,酶和酶作用底物,免疫实验专题知识讲座,第29页,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均 相,非均相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,组织切片或其它标本中抗原定位,液体标本中抗原或,抗体定性和定量,酶免疫技术分类,免疫实验专题知识讲座,第30页,碱性磷酸酶（,AP,）,菌源性,AP,肠粘膜,AP,半乳糖苷酶（,-Gal,）,用于均相酶,免疫测定,常见酶,酶和酶作用底物,免疫实验专题知识讲座,第31页,HRP,底物,DH,2,+H,2,O,2,D+2H,2,O,HRP,供氢体,DH,2,习惯上被称为底物，底物有各种,H,2,O,2,为受氢体，,HRP,对受氢体专一性很高,常见底物,酶和酶作用底物,免疫实验专题知识讲座,第32页,HRP,常见底物,邻苯二胺,OPD,四甲基联苯胺,TMB,5-,氨基水杨酸,5-ASA,2,2-,氨基,-,二,(3-,乙基,-,苯并噻唑啉磺酸,-6),铵盐,ABTS,常见底物,酶和酶作用底物,免疫实验专题知识讲座,第33页,OPD,反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长,492nm,。不稳定，致癌性。,TMB,反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长,450nm,，稳定，无致癌性，,ELISA,中应用最广泛底物。,HRP,常见底物,酶和酶作用底物,免疫实验专题知识讲座,第34页,AP,底物,-Gal,底物,对,-,硝基苯磷酸酯（,pNPP,）,4-,甲基伞酮基,-D,半,-,乳糖苷（,4MUG,）,经,AP,作用后产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为,405 nm,。,酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计 测量。,常见底物,酶和酶作用底物,免疫实验专题知识讲座,第35页,酶免疫技术关键组成个别,酶结合物（,conjugate,）,酶标识物,经过化学反应或免,疫学反应，让酶与,抗体或抗原形成,结合物,酶标识抗体或抗原,免疫实验专题知识讲座,第36页,酶联免疫吸附试验,免疫实验专题知识讲座,第37页,底物显色,定性或定量分析,原理,包被,反应,加入待测抗体或,抗原和酶标抗原,或抗体,洗涤,使结合在固相上,抗原抗体复合物,与未结合分离,1,2,3,4,一、基础原理,免疫实验专题知识讲座,第38页,固相抗原或抗体,酶标识物（酶结合物,）,酶反应底物,三个必要试剂,二、方法类型及反应原理,免疫实验专题知识讲座,第39页,双抗体夹心法,方法：,用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色,应用：,二价或二价以上较大分子抗原测定,乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、,HCG,等,ELISA,检测抗原方法,免疫实验专题知识讲座,第40页,免疫实验专题知识讲座,第41页,1,、已知抗体包,被于载体表面,3,、加酶标抗体,与抗原结合,4,、加酶作用底物,产生颜色,2,、加待检物,抗原与抗体结合,4,、加酶作用底物,不产生颜色,洗涤,洗涤,洗涤,洗涤,双抗体夹心法测抗原,1,、已知抗体包,被于载体表面,2,、加待检物无抗,原与抗体结合,3,、加酶标抗体,无抗原结合,+,-,Y,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,免疫实验专题知识讲座,第42页,竞争法,方法：,用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色,。,应用：,用于只有一个抗原决定簇小分子半抗原（药品、激素等）,ELISA,检测抗原方法,免疫实验专题知识讲座,第43页,免疫实验专题知识讲座,第44页,洗涤,洗涤,竞争法测抗原,+,-,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,E,Y,E,Y,E,2,、加待检物,抗原与酶标抗,原竞争与抗体,结合,3,、加酶作用,底物不显色,或显色弱,3,、加酶作用,底物显色,1,、已知抗体包,被于载体表面,1,、已知抗体包,被于载体表面,2,、加待测物,和酶标抗原，,酶标抗原与抗,体结合,Y,E,免疫实验专题知识讲座,第45页,间接法,方法,用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标抗人,IgG,（抗抗体或二抗）加底物显色。,优点,一个酶标抗抗体检测各种与抗原对应抗体,应用,常见于,HCV,抗体、,HIV,抗体和梅毒螺旋体抗体等测定,ELISA,检测抗体方法,免疫实验专题知识讲座,第46页,免疫实验专题知识讲座,第47页,1,、已知抗原吸,附于载体表面,2,、加待检物,无抗体与抗原结合,3,、加酶标抗,Ig,与抗体结合,4,、加酶作用底物,产生颜色,1,、已知抗体吸,附于载体表面,2,、加待检物,有抗体与抗原结合,3,、加酶标抗,Ig,抗体,4,、加酶作用底物,不产生颜色,洗涤,洗涤,洗涤,洗涤,间接法测抗体,-,Y,E,Y,Y,Y,E,Y,E,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,E,Y,+,免疫实验专题知识讲座,第48页,双抗原夹心法,原理：,类似双抗体夹心法,操作步骤,：,类似,应用：,乙型肝炎表面抗体,ELISA,检测抗体方法,免疫实验专题知识讲座,第49页,竞争法,原理：,类似检测抗原竞争法,应用,：,乙型肝炎病毒关键抗体,(HBcAb),和乙型肝炎病毒,e,抗体,(HBeAb),检测,ELISA,检测抗体方法,免疫实验专题知识讲座,第50页,捕捉法,应用：,病原体急性感染诊疗中,IgM,型抗体,甲型肝炎,HAV-IgM,抗体,乙型肝炎病毒关键,HBc-IgM,抗体,ELISA,检测抗体方法,免疫实验专题知识讲座,第51页,捕捉法,原理：,抗人,IgM,链抗体包被,捕捉待测标本中,IgM,类抗体,加入特异性抗原和酶标识特异性抗原抗体,底物显色,免疫实验专题知识讲座,第52页,洗涤,洗涤,洗涤,洗涤,捕捉法原理,+,-,E,Y,E,Y,E,Y,E,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,1,、固相化抗人,IgM,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,1,、固相化抗人,IgM,2,、加待测物,特异性,IgM,与,非特异性,IgM,和抗人,IgM,结合,3,、加特异性,抗原，与特异,性抗体结合,4,、加酶标抗体,与特异性抗原结,合，加底物显色,2,、加待测物,只有非特异性,IgM,和抗人,IgM,结合,3,、加特异性抗,原，不能与非,特异性,IgM,结合,4,、加酶标抗体,无抗原结合，,加底物不显色,免疫实验专题知识讲座,第53页,人,IL-2,定量酶联检测,BAS-ELISA (,生物素,-,亲和素,ELISA),免疫实验专题知识讲座,第54页,一、原理,ELISA(enzyme linked immunosorbent assay),是一个固相酶免疫测定方法，广泛应用于各种抗原或抗体微量检测，其基础原理是将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，经过洗涤将固相上抗原抗体复合物与液相中游离成份分离，再利用各种操作方法，测定可溶性抗原或抗体。,BAS-ELISA,是在常规,ELISA,原理基础上，结合生物素,(B),与亲和素,(A),间高度放大作用，而建立一个检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取一个碱性糖蛋白，分子量为,68kDa,，由,4,个亚单位组成，对生物素有非常高亲和力,(,结合常数高达,1015M-1),。生物素很易与蛋白质,(,如抗体等,),以共价键结合。这么，结合了酶亲和素分子与结合有特异性抗体生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又因为酶在碰到对应底物时催化作用而呈色，到达检测未知抗原,(,或抗体,),分子目标。,免疫实验专题知识讲座,第55页,本试验采取双抗体夹心,ELISA,法。抗人,IL-2,单抗包被于酶标板上，标准品中,IL-2,会与单抗结合，游离成份被洗去。加入生物素化抗人,IL-2,抗体和辣根过氧化物酶标识亲和素。生物素和亲和素特异性结合；抗人,IL-2,抗体与结合在单抗上人,IL-2,结合而形成免疫复合物，游离成份被洗去。加入显色剂，若反应孔中有,IL-2,，辣根过氧化物酶会使无色显色剂现蓝色，加终止液变黄。在,450nm,处测,OD,值，,IL-2,浓度与,OD450,值之间呈正比，绘制标准曲线,。,免疫实验专题知识讲座,第56页,二、材料（人,IL-2ELISA,试剂盒）,1.1ng/ml,人,IL-2,标准品,2.,标准品稀释液,3.,生物素化抗人,IL-2,抗体（,1:100,）,4.,酶结合亲和素（,1:100,）,5.,洗涤液,6.,显色剂（过氧化氢四甲基联苯胺）,7.,终止液,8.,抗人,IL-2,单抗包被板条,9.,封板胶纸,免疫实验专题知识讲座,第57页,三、操作步骤,1.,包被抗体,：用,0.05M PH9.6,碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板反应孔中加,0.1ml,，,4,过夜,(18-24,小时,),。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗,3,次，每次,3,分钟。,2.,配制不一样浓度标准品,：,孔号,1,2,3,4,5,6,7 8,NS(ml),0.1,0.1,0.1,0.1,0.1,0.1,0.1 0.1,人,IL-2,(ml),0.1,0.1,0.1,0.1,0.1,0.1,0.1 0.1,稀释度,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128 1:256,免疫实验专题知识讲座,第58页,3.,加样,：将稀释不一样浓度标准品各,100ul,加入反应孔,18,孔中，同时第,9,孔作空白孔。,37,孵育,60,分钟，洗涤,4,次，,0.5,分钟,/,次。,4.,加,B-Ab,（生物素化抗,IL-2,）,：将生物素化抗,IL-2,，加于每孔,100ul,，,37,孵育,30,分钟。洗涤,4,次，,0.5,分钟,/,次。,5.,加,A-HRP,（酶结合亲和素）,：将辣根过氧化物酶标识亲和素,(A-HRP),，于每孔加,100ul,，,37,孵育,30,分钟。洗涤,4,次，,0.5,分钟,/,次。,6.,底物显色：,于各反应孔中加入显色剂,100ul/,孔，于,37,温育,10,分钟。再加终止液,100ul/,孔以终止反应,.,7.,结果判定,：目测或在,ELISA,比色仪上测,OD,值。,免疫实验专题知识讲座,第59页,四、注意事项,1.,反应物浓度及百分比：因为本法敏感性很高，所用抗原或抗体均较,ELISA,法为少，对生物素标识抗体浓度更应严格掌握，增加抗体浓度可使敏感性提升，但过大又可使非特异性随之增大。,2.,生物素稳定性：生物素标识上抗体结合物，其稳定性均比酶标识抗体为好，宜长久保留，加入等量,60,甘油于,-20,可保留,2,年左右。保留时切忌重复冻融，重复冻融会使制剂活性受到损害。,3.,亲和素稳定性：亲和素在普通条件下稳定，对热及各种蛋白质能耐受，但在一些金属离子存在下对光敏感，轻易失活。所以在配制亲和素溶液时宜采取无离子水，在,4,置,2,个月或在,-30,置放六个月，重复冻融其活性仍保持不变。,免疫实验专题知识讲座,第60页,4.,亲和素非特异性吸附：亲和素在,PH,中性环境中是带正电荷，可经过静电作用非特异性地吸附到固相载体上，这是引发试验非特异性显色主要原因。假如增加亲和素稀释液,PH,和离子强度，均可显著降低亲和素非特异性吸附，而对特异性显色也影响不大。也可用戊二醛或醋酸酐对亲和素进行化学修饰，使之乙酰化而降低其非特异性吸附。,5.,反应物作用时间及温度：因为亲和素与生物素之间有很高亲和力，故二者标识物反应时间较抗原,-,抗体反应时间大为缩短。为了降低非特异性吸附，反应时间不宜过长，普通于,37,以,20-30,分钟为宜。,免疫实验专题知识讲座,第61页,