免疫球蛋白的粗提.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,免疫球蛋白的粗提,免疫球蛋白的粗提,第1页,试验目标：,学习免疫球蛋白粗提方法,实践,IgG,分离纯化过程,了解分离纯化抗体原理,免疫球蛋白的粗提,第2页,多克隆抗体血清,含有各种蛋白质组分，不适合用于试验室分析、检测应用。,依据试验目标不一样，可按照不一样方法对有效抗体成份进行分离、纯化。,免疫球蛋白的粗提,第3页,盐析法原理,水膜与同性电荷排斥作用是,蛋白质胶体稳定,基础，,在蛋白质胶体溶液中加入一定量（,NH,4,）,2,SO,4,或,Na,2,SO,4,盐类，使溶液中大个别自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子相互作用，破坏蛋白质水膜，,蛋白质溶解度,也随之降低。,蛋白质因为分子质量和携带电荷不一样，可在,不一样浓度高盐溶液内,分级析出。,33%,（,NH,4,）,2,SO,4,为沉淀,IgG,最适饱和度。,免疫球蛋白的粗提,第4页,盐析法沉淀抗原机理,免疫球蛋白的粗提,第5页,免疫球蛋白的粗提,第6页,材料与试剂配制,1,动物血清,2,硫酸铵饱和溶液,硫酸铵,800g850g,H2O 1 000ml,加热至绝大个别溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以,28,NH4OH,调,pH,至,7.0,（不调,pH,值也能够）。,注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少许重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入,H2S,，静置过夜后滤过，,加热蒸发,H2S,即可。,免疫球蛋白的粗提,第7页,3,0.01Mol/L pH7.4,PBS,液,A,液：,0.10Mol/L NaH2PO4,液,NaH2PO4,2H2O 15.60g,加,H2O,至,1 000.ml,B,液：,0.10Mol/L Na2HPO4,液,Na2HPO4,12H2O 35.80g,加,H2O,至,1 000ml,取,A,液,19ml,，,B,液,81ml,加水至,1 000ml,即可。,4,0.50 Mol/L,HCl,液和,0.50 Mol/L,NaOH,液。,5,透析袋（或玻璃纸）。,免疫球蛋白的粗提,第8页,试验步骤,1.,免疫血清,0.5 mL,加,0.5mL,生理盐水,/PBS,2.,逐滴加入饱和（,NH,4,）,2,SO,4,1 mL,（此时为,50%,饱和度）,4,，静置,20 min,3.3000 r/min,离心,20 min,取沉淀溶于,2 mL,生理盐水,/PBS,中,4.,逐滴加入饱和（,NH,4,）,2,SO,4,1 mL,（此时为,33%,饱和度）,4,，静置,20 min,3000 r/min,离心,20 min,免疫球蛋白的粗提,第9页,重复步骤,3,5,，,2,次,7.,取沉淀溶于,0.5 mL,生理盐水中,装入透析袋,透析除盐，在常水中透析过夜，,再在生理盐水,/PBS,中于,4,透析,24h,，中间换液数次。,取出放于聚乙二醇浓缩,10min,，取出打开将提取物放于,EP,管中，,-20,摄氏度保纯备用。,免疫球蛋白的粗提,第10页,免疫球蛋白的粗提,第11页,注意事项,（,1,）,.,盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中速度和方式，边加边迟缓摇动，并防止产生气泡。,（,2,）,.,注意区分前后,2,次盐析所采取饱和硫酸铵终浓度。,免疫球蛋白的粗提,第12页,作业与思索题,：,1,，常见分离、纯化免疫球蛋白方法主要有那几个？各自得到纯度怎样？,2,，五类免疫球蛋白分离纯化方法皆相同吗？,3,，分离纯化,IgG,时，为何硫酸铵饱和度先调至,50%,，然后调至,33%,？加入硫酸铵溶液时，为何要一滴滴地加？,免疫球蛋白的粗提,第13页,IgG,纯度判定 可采取以下方法之一判定。,区带电泳,琼脂双相双扩散判定,免疫电泳判定,圆盘电泳判定,免疫球蛋白的粗提,第14页,