SN∕T 5637-2023 6种常见黑松露成分定性检测方法 实时荧光PCR法.pdf

I C S6 7.0 5 0C C SX4 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 6 3 72 0 2 3 6种常见黑松露成分定性检测方法 实时荧光P C R法Q u a l i t a t i v e d e t e c t i o n o f s i x s p e c i e s o f b l a c k t r u f f l e i n g r e d i e n t sR e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e P C R m e t h o d2 0 2 3-1 1-0 1发布2 0 2 4-0 5-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:大连海关技术中心、成都海关技术中心、大连民族大学、中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所、拱北海关技术中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心。本文件主要起草人:杨爱馥、万超、李扬、白景莲、胡江涛、郑秋月、邰丽梅、刘雪华、田卓、徐君怡、姚丽锋、陈丽萍、蔡一村、徐杨、姜丽、林华、赵永拓、韩宏乾、梁冰、邱向锋、王琦。S N/T5 6 3 72 0 2 36种常见黑松露成分定性检测方法实时荧光P C R法1 范围 本文件规定了印度块菌(T u b e r i n d i c u m C o o k e&M a s s e e)、中国块菌(T.s i n e n s e)、喜马拉雅块菌(T.h i m a l a y e n s e)、假凹陷块菌(T.p s e u d o e x c a v a t u m)、假喜马拉雅块菌(T.p s e u d o h i m a l a y e n s e)和黑孢块菌(T.m e l a n o s p o r u m)的实时荧光P C R检测方法。本文件适用于印度块菌、中国块菌、喜马拉雅块菌、假凹陷块菌、假喜马拉雅块菌和黑孢块菌成分的定性检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语和定义 下列术语和定义适应于本文件。3.1 黑松露 b l a c k t r u f f l e 隶属于真菌界(F u n g i)、子囊菌门(A s c o m y c o t a)、盘菌纲(P e z i z o m y c e t e s)、盘菌目(P e z i z a l e s)、块菌科(T u b e r a c e a e)、块菌属(T u b e r)的一类生于地表下的块状真菌。3.2 实时荧光P C R r e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e P C R 实时荧光聚合酶链式反应。在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个P C R扩增过程,实现对起始模板的定量及定性分析。3.3 C t值 c y c l e t h r e s h o l d 每个反应管内的荧光信号达到设定域值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适应于本文件。D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u l e i c a c i d)d NT P:脱氧核苷酸三磷酸(d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e)I T S:核糖体内转录间隔区(i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e)1S N/T5 6 3 72 0 2 3 O D:光密度值(o p t i c a l d e n s i t y)P C R:聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n)T a q D NA聚合酶:耐热D NA聚合酶(T a q D NA p o l y m e r a s e)T r i s:三(羟甲基)氨基甲烷(t r i s(h y d r o x y m e t h y l)a m i n o m e t h a n e)1 8 S rRNA:真核生物核糖体小亚基1 8 S基因(1 8 S r i b o s o m a l R NA)5 方法提要 样品经研磨后,提取D NA,采用黑松露I T S基因序列的特异性引物和探针对样品D NA进行T a qM a n探针实时荧光P C R扩增,根据C t值,判断该样品中是否存在黑松露成分。6 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合G B/T 6 6 8 2中一级水的规格。所有试剂均用无D NA酶污染的容器分装。6.1 黑松露成分扩增引物和探针序列详见表1。黑松露引物扩增的靶标序列见附录A。表1 黑松露成分扩增引物和探针序列信息表名称引物/探针序列(5-3)目的基因内参照5 端引物内参照3 端引物内参照探针T C T G C C C TA T C AA C T T T C GA T G G TAAA T T T G C G C G C C T G C T G C C T T C C T TF AM-C C G T T T C T C AG G C T C C C T C T C C G GAA T C GAA C-TAMR A真核生物1 8 S r R NA基因黑松露5 端引物黑松露3 端引物黑松露探针C T G T T C GAG C G T C A C TA C A C A CT GA TA T G C T TAAG T T C AG C G G G TAF AM-C AA TA T T T G T G G T C T T G G C AG GAG T GAA T T-TAMR A 黑松露I T S基因6.2 组 织 裂 解 液:2 0 mm o l/L t r i s-C l,5 mm o l/L E D TA,4 0 0 mm o l/L N a C l,1%(m/V)S D S,4 0 0 g/m l,用1 0%盐酸调p H至8.0,1 2 1,高压灭菌2 0 m i n,备用。6.3 T E缓冲液(T r i s-C l、E D TA缓冲液):1 0 mm o l/L T r i s-HC l(p H 8.0),1 mm o l/L E D TA(p H 8.0)。6.4 蛋白酶K:2 0 m g/L。6.5 T r i s饱和酚。6.6 三氯甲烷。6.7 异戊醇。6.8 异丙醇。6.9 7 0%乙醇。6.1 0 实时荧光P C R反应混合液:1 2.5 L反应体系包括1 U3 U的T a q酶、1P C R缓冲液、2.5 n m o l/L4.0 n m o l/L的M g2+、0.2 n m o l/L d NT P。如果具有等效的商品化试剂盒,也可使用等效产品。7 仪器和设备7.1 实时荧光P C R仪。2S N/T5 6 3 72 0 2 37.2 离心机:转速 1 2 0 0 0 r/m i n。7.3 微量移液器:0.5 L 1 0 L、1 0 L 1 0 0 L、2 0 L 2 0 0 L、1 0 0 L1 0 0 0 L。7.4 冰箱:2 8,-2 0。7.5 高压灭菌器。7.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.7 p H计:精密度为0.0 1。7.8 天平:感量0.0 1 g。7.9 恒温水浴锅:0 1 0 0。7.1 0 涡旋振荡器。7.1 1 研钵及粉碎装置。8 检测步骤8.1 D N A提取8.1.1 将待检样品研磨成粉末,称取1 0 0 m g于1.5 mL离心管中,加入7 0 0 L预热(5 6)的组织裂解液和2 0 L蛋白酶K,使用涡旋振荡器振荡混匀,5 6 水浴3 0 m i n,期间振荡混匀。8.1.2 1 2 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,吸取上清液至新的离心管中,加等体积的T r i s饱和酚三氯甲烷异戊醇(2 52 41)混合液,上下颠倒混匀。8.1.3 1 2 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,吸取上清液至新离心管中;加等体积的三氯甲烷异戊醇(2 41),上下颠倒混匀。8.1.4 1 2 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,吸取上清液至新离心管中;加入0.8倍体积异丙醇,室温下沉淀1 h2 h。8.1.5 1 2 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,弃上清液;加入1.0 mL 7 0%乙醇倾斜离心管,轻轻转动数圈后,1 2 0 0 0 r/m i n离心5 m i n,弃上清液;用7 0%乙醇按相同的方法重复洗1次,室温干燥。8.1.6 加入5 0 L T E溶解D NA沉淀,于-2 0 保存备用。注:也可采用等效的商业化D NA提取试剂盒并按照其说明制备模板D NA。8.2 D N A浓度和纯度的测定 样品D NA使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定2 6 0 n m和2 8 0 n m处的吸收值。D NA的浓度按照公式(1)计算。c=A2 6 0N5 0(1)式中:c D NA浓度,单位为微克每毫升(g/mL);A2 6 0 2 6 0 n m处的吸光值;N 核酸稀释倍数。D NA的纯度以A2 6 0/A2 8 0表示,该值在1.71.9之间时,适宜于实时荧光P C R检测。8.3 实时荧光P C R检测8.3.1 实时荧光P C R反应体系 实时荧光P C R反应体系见表2。每个样品进行检测时应设置两个平行。3S N/T5 6 3 72 0 2 3表2 T a q M a n实时荧光P C R反应体系试剂名称工作液浓度加样量/L反应体系终浓度P C R反应混合液(2)11 2.51正向引物1 0 m o l/L1.04 0 0 n m o l/L反向引物1 0 m o l/L1.04 0 0 n m o l/L探针5 m o l/L1.02 0 0 n m o l/LD NA模板2.0超纯水补足至2 5 L8.3.2 实时荧光P C R反应参数 9 5/1 0 m i n,1个循环;9 5/1 0 s,6 0/3 0 s,4 0个循环。注:以上参数根据不同型号实时荧光P C R仪和所选P C R扩增试剂体系不同进行适当的调整。设置P C R反应管荧光信号收集条件,与探针标记的报告基团一致。具体设置方法参照仪器使用说明书。8.3.3 实验对照 检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用含有黑松露成分的样品或含黑松露目标基因片段的阳性质粒(靶标序列见附录A)作阳性对照,以不含黑松露成分的样品或不含黑松露目标基因片段的阴性质粒作阴性对照,以等体积的超纯水代替模板D NA作为空白对照。对照设置两个平行的反应体系。9 质量控制 质量控制如下。a)空白对照:无特异性荧光对数增长,相应的C t值4 0.0。b)阴性对照:无特异性荧光对数增长,相应的C t值4 0.0。c)阳性对照:有特异性荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的C t值3 5.0。d)内参对照:有特异性荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的C t值3 0.0 以上质控条件有一项不符合者,实验结果视为无效,应查找原因,再次提取D NA进行实时荧光P C R扩增。1 0 结果判定及表述1 0.1 结果判定 在符合第9章的情况下,可做出如下结果判定。a)测试样品检测C t值3 5.0,则判定为检测结果阳性。b)测试样品检测C t值4 0.0,则判定为检测结果阴性。c)测试样品检测在3 5.0C t值4 0.0,应调整模板浓度,重做实时荧光P C R。再次扩增后C t值4 0.0,则判定检测结果阳性;如再次扩增后C t值4 0.0,则判定检测结果阴性。4S N/T5 6 3 72 0 2 31 0.2 结果表述1 0.2.1 结果为阳性者,表述为“检出黑松露成分”。1 0.2.2 结果为阴性者,表述为“未检出黑松露成分”。1 1 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8中附录D的规定执行。1 2 检出限 本方法所规定的最低检出限(L O D)为0.0 1%(质量百分比)。5S N/T5 6 3 72 0 2 3附 录 A(资料性)黑松露成分基因扩增参考序列A.1 印度块菌 T.i n d i c u m(G e n B a n k:G U 9 7 9 0 5 0.1)C T G T T C GAG C G T C A C TA C A C A C C T TAT C A C AATAT T T G T G G T C T T G G C AG GAG T GAAT T G CT G G T C T AT G GAAG TAT T C C AG C C G TA C A C AAT G C TAAAAAATAT G G GAAG G T TA C C AGATAT GAA C AA C AGA C T T T G TAAAT G G T T G TAG GA C C TAGAT C AG T C A C AAG T C AT G T C T G G TC C C T AAG GA C C T TAAG GA C C C C C AT C C TAGAT GAA C TAT G G G T T GA C C T C G GAT C AG G TAGGAAT A C C C G C T GAA C T TAAG C ATAT C AA.2 中国块菌 T.s i n e n s e(G e n B a n k:G U 9 7 9 0 6 2.1)C T G T T C GAG C G T C A C TA C A C A C C T TAT C A C AA C AT T T G T G G T C T T G G C AG GAG T GAAT T G CT AG T C T AT GAAAATAT T C C AG C T G T C C A C C AT G C T GAAAAT TAT G G GAAG G T TA C C AG G CG T GAA C AA C AGA C T T T G TAAAG G G T T G C AG GA C C T G TAT C AG T C A C C AG T C AT G T C T G G TC C T T A C C T TAG G GA C C C C C AT C C TAGAT GAA C TAT G G G T T GA C C T C GAAT C AG G TAG G GATA C C C G C T GAA C T TAAG C ATAT C AA.3 喜马拉雅块菌 T.h i m a l a y e n s e(G e n B a n k:MN 1 0 4 0 1 5.1)C T G T T C GAG C G T C A C TA C A C A C C T TAT C A C AATAT T T G T G G T C T T G G C AG GAG T GAAT T G CT G G T C T AT G GAAG TAT T C C AG C C G TA C A C AAT G C TAAAAAATAT G G GAAG G T TA C C AGATAT GAA C AA C AGA C T T T G TAAAT G G T T G TAG GA C C TAGAT C AG T C A C AAG T C AT G T C T G G TC C C T AAG GA C C T TAAG GA C C C C C AT C C TAGAT GAA C TAT G G G T T GA C C T C G GAT C AG G TAGGAAT A C C C G C T GAA C T TAAG C ATAT C AA.4 假凹陷块菌 T.p s e u d o e x c a v a t u m(G e n B a n k:HM 4 8 5 3 8 1.1)C T G C T C GAG C G T C A C AGAAAA C C C C AT C A C AG T T C C T G T G G T C T T G G TAT GAG T G G G T T GAT AG T AT G T G GAGA C AT G C T TATAA C A C T C TA C T GAAAT T TATAGA C AG GATA C C G GATATG G G C AAT AGA C T T T G TAAATAT C C A C AG GATATATAT C AG T C AT G T G T C AT G T T T G G T C CT GAT AT T AT G GA C T C C TAT T C TATA C AAA C AT T G G G T T GA C C T C GAAT C AG G TAG G GATAC C C G C T GAA C T TAAG C ATAT C AA.5 假喜马拉雅块菌 T.p s e u d o h i m a l a y e n s e(G e n B a n k:J X 4 5 8 7 1 6.1)C T G C T C GAG C G T C A C AGAAAA C C C C AT C A C AG T T C C T G T G G T C T T G G TAT GAG T G G G T T GAT AG T AT G T G GAGA C AT G C T TATAA C A C T C TA C T GAAAT T TATAGA C AG GATA C C G GATATG G G C AAT AGA C T T T G TAAATAT C C A C AG GATATATAT C AG T C AT G T G T C AT G T T T G G T C CT GAT AT T AT G GA C T C C TAT T C TATA C AAA C AT T G G G T T GA C C T C GAAT C AG G TAG G GATAC C C G C T GAA C T TAAG C ATAT C AA.6 黑孢块菌 T.m e l a n o s p o r u m (G e n B a n k:A F 1 0 6 8 7 8.1)C T G T T C GAG C G T C A C TA C A C A C C T TAT C A C AAAG T T T G T G G T C T T G G C AG GAG T GAAT T G C6S N/T5 6 3 72 0 2 3T AG T C T AT TAAAAT G T T C C AG C T G TA C A C T C T G C TAAAAAT TAT GAGAAG G T TA C C AG G CAT GAA C GA C C GA C T T TATAAA C G G T TATAAGA C C T G GAT C AG T C A C AAG T C T T G T C T G G TC C T T A C C T TAAG GA C C C C C AT C C TAGAT GAA C TAT G G G T T GA C C T C GAAT C AG G C AG G GATA C C C G C T GAA C T TAAG C ATAT C AS N/T5 6 3 72 0 2 3