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,*,人民卫生出版社,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,人民卫生出版社,卫生检验与检疫技术专业,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,人民卫生出版社,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,人民卫生出版社,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,人民卫生出版社,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,人民卫生出版社,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,人民卫生出版社,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,人民卫生出版社,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,免疫学检验,第1页,第二十一章,化学发光免疫技术,第2页,1.,化学发光剂概念及惯用化学发光剂。,2.,化学发光免疫分析基本原理及其技术类,型。,3.,化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技,术。,4.,电化学发光免疫分析基本原理。,5.,化学发光免疫技术临床应用。,本章关键点,第3页,目录,发光基本知识,1,化学发光免疫分析,2,化学发光酶免疫分析,3,电化学发光免疫分析,4,化学发光免疫技术临床应用,5,第4页,化学发光免疫,技术,是将含有高灵敏度化学发光测定技术与高特异性,抗原抗体,反应,技术,相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、维生素和药品等检测分析技术,。该技术含有,特异性高、,灵敏度,高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化,分析等特点，在免疫学检验中应用广泛。,前 言,第5页,放射免疫技术,酶免疫技术,荧光免疫技术,金免疫技术,化学发光免疫技术,标识免疫技术,第6页,第一节 基本知识,一、发光,发光是指分子或原子中电子吸收能量后，由低能级基态跃迁到高能级激发态，然后再返回到基态，释放出能量表现为光发射。依据形成激发态激发能不一样可将发光分为,光照发光,、,生物发光,和,化学发光,。,第7页,1.,光照发光（,photoluminescence,）,发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长可见光。,第8页,2.,生物发光（,bioluminescence,）,发生在生物体内发光现象，如萤火虫发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶催化下，利用,ATP,产能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多出能量以光子形式释放出来。,第9页,3.,化学发光,一些物质,(,发光剂,),在化学反应时，吸收了反应过程中所产生化学能，使反应产物分子或中间态分子中电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子形式释放出能量，这一现象称为化学发光。,第10页,一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以下条件：,该反应必须提供足够激发能,并由某一步骤单独提供,因为前一步反应释放能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光,要有有利反应过程,使化学反应能量最少能被一个物质所接收并生成激发态,激发态分子必须含有一定化学发光量子效率释放出光子,或者能够转移它能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子,第11页,在化学发光反应中参加能量转移并最终以发射光子形式释放能量化合物称为,化学发光剂,或,发光底物,。,二,.,化学发光剂,第12页,作为化学发光免疫技术化学发光剂应符合以下几个条件：,发光量子产率高,物理,-,化学特征要与被标识或测定物质相匹配,能与抗原或抗体形成稳定偶联结合物,其化学发光常是氧化反应结果,在所使用浓度范围内对生物体没有毒性,第13页,惯用化学发光剂或发光底物有,1.,直接化学发光剂,2.,酶促反应发光底物,3.,电化学发光剂,第14页,1.,直接化学发光剂,在发光免疫分析过程中不需酶催化作用，直接参加发光反应，它们在化学结构上有产生发光特有基团，可直接标识抗原或抗体。如惯用吖啶酯（,acridinium,，,AE,）,。,第15页,吖啶酯,在碱性条件下被,H,2,O,2,氧化时,发出波长,为,470nm,光，含有很高发光效率，其激发,态产物,N-,甲基吖啶酮是该发光反应体系发光体。,第16页,2.,酶促反应发光底物,是利用标识酶催化作用，使发光剂（底物）发光。,当前化学发光酶免疫技术中惯用酶有辣根过氧,化物酶（,HRP,）和碱性磷酸酶（,ALP,）。,HRP,惯用,发光底物为鲁米诺或其衍生物，,ALP,发光底物,为金刚烷（,AMPPD,）,第17页,（,1,）鲁米诺或其衍生物,鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化,学发光反应，辐射出最大发射波长为,425nm,光。,第18页,鲁米诺增强发光反应原理,第19页,（,2,）,AMPPD,3-(2,-,螺旋金刚烷,)-4-,甲氧基,-4-(3,“,-,磷酰氧基,),苯,-1,2-,二氧杂环丁烷,第20页,3,电化学发光剂,电化学发光剂是指经过在电极表面进行电化学反应而发光物质。如化学发光剂三联吡啶钌,Ru(bpy)32+,和电子供体三丙胺（,TPA,）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。,第21页,用化学发光剂（如吖啶酯）直接标识抗体,(,抗原,),，与待测标本中对应抗原,(,抗体,),和磁颗粒性抗体（抗原）发生免疫反应后，经过磁场把结合状态和游离状态化学发光剂标识物分离开来，这时只需加入氧化剂（,H,2,O,2,）和,NaOH,使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、统计单位时间内所产生光子能，可从标准曲线上计算出待测抗原,(,抗体,),含量,第二节 化学发光免疫分析,一、检测原理,第22页,化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图,第23页,1.,分离方法,惯用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒，与标本中对应抗体或抗原及吖啶酯标识抗体或,抗原经过一定模式免疫学反应后,最终经过在磁场,中冲洗将结合到免疫复合物中标识物和游离标识物,进行分离技术。,二、方法类型,第24页,2.,惯用免疫学反应模式,双抗原夹心法,固相抗原竞争法,双抗体夹心法,第25页,三、技术关键点,抗原抗体结合反应,结合物与游离物分离,(,磁颗粒分离技术,),化学发光反应,第26页,化学发光酶免疫分析（,CLEIA,）是用参加催化某一化学发光反应酶如辣根过氧化物酶（,HRP,）或碱性磷酸酶,(ALP),来标识抗原或抗体，在与待测标本中对应抗体,(,抗原,),发生免疫反应后，经洗涤将结合物与游离酶标物分离后，加入底物,(,发光剂,),，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物浓度。,第三节 化学发光酶免疫分析,一、检测原理,第27页,碱性磷酸酶化学发光酶免疫分析双抗体夹心法原理示意图,第28页,1.,依据标识酶不一样分类,可分为辣根过氧化物酶标识化学发光酶免疫分析和碱性磷酸酶标识化学发光酶免疫分析。前者常以鲁米诺或其衍生物作为发光底物，后者常以,AMPPD,作为发光底物。,2.,依据免疫学反应模式分类,同化学发光免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法等主要模式，所不一样只是对应抗原或抗体上标识是酶而不是直接标识发光剂。,二、方法类型,第29页,三、技术关键点,抗原抗体结合反应,结合物与游离物分离,（,磁颗粒分离法、微粒子捕捉法、包被聚苯乙烯反应珠或孔分离法）,酶促发光反应,第30页,电化学发光免疫分析（,ECLIA,）是以电化学发光剂三联吡啶钌标识抗体,(,抗原,),，经过抗原抗体反应和磁珠分离技术，依据三联吡啶钌在电极上发出光强度对待测抗原或抗体进行定量分析，它包含电化学和化学发光两个过程。,第四节 电化学发光免疫分析,一、检测原理,第31页,电化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图,第32页,电化学发光免疫测定示意图,第33页,1.,分离方法 惯用磁颗粒分离技术,2.,免疫学反应模式 其反应模式同发光免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种主要模式，所不一样只是对应抗原或抗体上标识是三联吡啶钌。,二、方法类型,第34页,三、技术关键点,抗原抗体反应,结合物与游离物分离,(,磁颗粒分离技术,),电化学发光过程,第35页,第五节 化学发光免疫技术临床应用,一、化学发光免疫技术特点,1.,敏感度高，甚至超出,RIA,；,2.,精密度和准确性均可与,RIA,相比；,3.,试剂稳定，无毒害；,4.,测定耗时短；,5.,测定项目多；,6.,已发展成自动化测定系统。,第36页,1.,甲状腺激素,T3,、,T4,、,hTSH,、,FT4,、,FT3,、抗,TPO,、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体等。,2.,生殖激素,-HCG,、催乳素、促卵泡激素、促黄,体激素、孕酮、雌二醇、非结合雌三醇、甲胎蛋白、睾丸酮、硫酸脱氢异雄酮。,3.,肾上腺,/,垂体激素,皮质醇、尿皮质醇、人生长激,素、甲状旁腺素、促肾上腺皮质激素。,二、化学发光免疫技术常见检测项目,第37页,4.,贫血因子,维生素,B12,、叶酸、红细胞叶酸、铁蛋,白等。,5.,肿瘤标识物,AFP,、,CEA,、,PSA,、游离,PSA,、,CAl9-9,、,CAl25,、,CAl5-3,等。,6,感染性疾病,衣原体抗原、尿衣原体抗原、衣原,体抗原确认、弓形体,IgG,抗体、弓形体,IgM,抗体、风,疹病毒,IgG,抗体、风疹病毒,IgM,抗体、巨细胞病毒,IgG,抗体、巨细胞病毒,IgM,抗体等。,二、化学发光免疫技术常见检测项目,第38页,7,糖尿病,胰岛素、,C,肽等。,8,心血管系统,肌酸激酶,MB,同工酶、地高辛、肌红,蛋白、心肌肌钙蛋白,-I,等。,9,病毒标识物,HIVl/2Ab,、,H,B,sAg,、,HBsAg,确认、,H,B,sAb,、,HCVAb,、,HAV IgM,、,HAVAb,、,H,B,cAb,、,HBclgM,、,HBeAg,、,HBeAb,等。,二、化学发光免疫技术常见检测项目,第39页,10,骨代谢,骨胶原酶、脱氧吡啶啉等。,11,过敏性疾病,总,IgE,、特异性,IgE,等。,12,治疗药品监测,茶碱、地高辛、环孢素、巴比,妥等。,二、化学发光免疫技术常见检测项目,第40页,化学发光是吸收了化学反应过程中所产生,化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分,析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检,测微量抗原或抗体标识免疫分析技术，分,为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫,分析和电化学发光免疫分析。,小 结,第41页,第42页,
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