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中国农业科技导报，2023，25（10）：91-98Journal of Agricultural Science and Technology滇西槽舌兰内生真菌多样性及其共生真菌对叠鞘石斛种子萌发的效应李爱花1，王涛1，王苗苗1，邓军育1，刘佳1，亚吉东2，张毓1*（1.国家植物园北园，植物迁地保护国家林业与草原局重点实验室，北京市花卉园艺工程技术研究中心，北京 100093；2.中国科学院昆明植物研究所中国西南野生生物种质资源库，昆明 650201）摘要：兰科植物种子萌发甚至整个生长阶段依赖于共生真菌。滇西槽舌兰（Holcoglossum rupestre）是我国特有极度濒危物种，为了更好地开展其种质资源保护，采集云南香格里拉、楚雄、昆明盘龙、昆明呈贡的滇西槽舌兰植株，基于ITS rDNA序列对其根部的内生真菌进行分离、鉴定和多样性分析，并研究这些内生真菌对叠鞘石斛（Dendrobium denneanum）种子萌发的影响。结果表明，滇西槽舌兰4个分布地植株的根内共分离、鉴定出68株内生真菌，分别属于粪壳菌纲（Sordriomycetes）、伞菌纲（Agaricomycetes）和座囊菌纲（Dothideomycetes）3 个纲 18 个属。其中，镰刀菌属（Fusarium）、间座壳属（Diaporthe）、胶膜菌属（Tulasnella）、角担菌属（Ceratobasidium）的相对丰度分别为27.94%、10.29%、8.82%、8.82%，为主要优势内生真菌。胶膜菌属和角担菌属为滇西槽舌兰首次分离到的兰科共生菌，且胶膜菌属的P2和P47菌株可以显著促进叠鞘石斛种子萌发进程及萌发一致性。关键词：滇西槽舌兰；内生真菌；多样性；胶膜菌属；共生萌发doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0078 中图分类号：S182文献标志码：A文章编号：10080864（2023）10009108Diversity of Endophytic Fungi in Holcoglossum rupestre and Effects of Symbiotic Fungi on Seed Germination of Dendrobium denneanumLI Aihua1，WANG Tao1，WANG Miaomiao1，DENG Junyu1，LIU Jia1，YA Jidong2，ZHANG Yu1*（1.Key Laboratory of National Foresty and Grassland Adminstration on Plant Ex situ Conservation，Beijing Floriculture Engineering Technology Research Center，North Garden of China National Botanical Garden，Beijing 100093，China；2.Germplasm Bank of Wild Species in Southwest China，Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650201，China）Abstract：The germination and growth of orchid seeds depend on symbiotic fungi.Holcoglossum rupestre is an endemic，narrowed distributed and critical endangered species of Orchidaceae.Aiming to better ex situ conserve H.rupestre，the plants were collected from Shangrila，Chuxiong，Kunming Panlong and Kunming Chenggong in Yunnan.The endophytic fungi in its roots were isolated and identified based on ITS rDNA sequences，and their effect on seed germination was studied.The results showed that 68 culturable fungal endophytes were isolated and identified from roots of H.rupestre from 4 localities of Yunnan province，which belonged to 18 genera of 3 classes，i.e.，Sordriomycetes，Agaricomycetes and Dothideomycetes.Among all strains，Fusarium，Diaportha，Tulasnella and Ceratobasidium were the dominant fungal endophytes with 27.94%，10.29%，8.82%and 8.82%of relative abundance.Some orchids mycorrhizal fungi as well as Tulasnella and Ceratobasidium were firstly found in H.rupestre roots.And Tulasnella strains P2 and P47 could significantly promote symbiotic germination of Dendrobium denneanum seeds by advancing germination process and improving germination consistency.Key words：Holcoglossum rupestre；endophytic fungi；diversity；Tulasnella；symbiotic germination收稿日期：20230208；接受日期：20230412基金项目：北京市植物园园管课题项目（BZ202103）；北京市公园管理中心课题项目（ZX2022009）；国家林草局机构运行保障专项（XM-JZ03）。联系方式：李爱花 Email：；*通信作者 张毓 E-mail：中 国 农 业 科 技 导 报25 卷兰科植物是被子植物的第二大科，由于生物多样性丧失、人类过度采集等原因，许多兰科植物生存状况受到威胁，是全球生物多样性保护的“旗舰”类群。植物内生真菌对植物的生长、适应性、进化及植物群落的结构和多样性产生影响1-3。多数兰科植物与真菌共生，其种子萌发和原球茎发育需要依赖共生真菌4，且大多数兰科植物在成年阶段也会维持这种共生关系56。高度依赖于特异共生真菌的兰花，往往会因为其潜在生境的可用性和分布限制，导致物种濒危7。滇 西 槽 舌 兰 Holcoglossum rupestre(Hand.-Mazz.)Garay是中国特有物种，仅发现 23 个居群，位于金沙江干热河谷地带高山栎树上。由于工程建设、全球气候变化、人为破坏等原因，滇西槽舌兰所依存的高山栎林正处在快速消失中，因此，目前滇西槽舌兰被评为极度濒危物种，并被列入国家极小种群植物名录（2002版）。如果没有抢救性措施，滇西槽舌兰有可能成为长江流域灭绝的兰科植物8。因此，亟需对滇西槽舌兰及其生态环境开展保护性研究。了解滇西槽舌兰的内生真菌多样性及其与兰科植物的共生关系，可以为滇西槽舌兰的物种濒危原因提供理论参考，但相关研究较少。Tan等9对9个槽舌兰属物种进行了内生真菌的分离和鉴定，共鉴定得到46株内生真菌，但是滇西槽舌兰中仅鉴定得到5株，且均为非共生真菌。因此，有必要对已知分布地及栽培地滇西槽舌兰的内生真菌进行分离和多样性分析，并进行功能鉴定，为滇西槽舌兰的保育及濒危机制研究奠定理论基础。1材料与方法1.1研究材料2021年56月，从云南香格里拉、楚雄、昆明盘龙、昆明呈贡4个生长地收集健康、新鲜、粗壮滇西槽舌兰植株的气生根37段，用湿纸巾包裹，放到干净的盒子内，快速运回实验室。1.2试剂及仪器采用 PDA培养基对内生真菌进行培养。配置方法如下：PDA培养基粉末46.0 g，加入到1.0 L超纯水中，于121 高压蒸汽灭菌20 min，制备固体PDA培养基。18S rDNA扩增所用试剂均购自TaKaRa公司；PCR Purification Kit 购自Promega公司；PCR仪为Biometra 公司生产的Tgradient；凝胶成像分析仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000。1.3试验方法1.3.1滇西槽舌兰根部内生菌的分离选用组织块分离法分离内生真菌，流程如下：首先用自来水冲洗干净根段，去除根表面泥土及附属物，用吸水纸吸干水分；然后将根切成 23 cm 的小段，用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗1次，5%（质量体积分数）NaClO消毒5 min，无菌水冲洗3次，吸干水分；最后用无菌双面刀片将根段切成12 mm的薄片，放到PDA培养基中，每皿放置12小片，密封放置在25 暗培养。及时观察培养皿中菌丝生长状态，待菌丝长出后用接种针挑取菌丝尖端转接到新的PDA培养基中进一步纯化，待菌落无杂菌，生长均匀后，进行保藏和检测。1.3.2内生真菌的鉴定分离的共生真菌分别进行形态学鉴定10和分子鉴定。通过光学显微镜（Olimpus CX31）观察内生真菌的菌丝形态，方法如下：用透明胶带粘取少量菌丝，置于涂有10%（质量体积分数）KOH的载玻片上，观察菌丝的直径、分枝、念珠状细胞、孢子、隔膜等特征。采用通用菌类18S rDNA鉴定方法11 进行分子鉴定。样品DNA提取、PCR扩增及测序均由北京博友顺生物技术有限公司进行。引物为真菌通用引物组合 ITS1/ITS4，由上海生工有限公司合成。PCR体系包括：处理后的样品(20 ng L-1)模板2 L，dNTP Mixture(2.5 mmol L-1)2.5 L，引物(20 mol L-1)各 1.5 L，10Ex Taq Buffer(Mg2+plus)5 L，Ex Taq 酶（5U L-1）0.2 L，ddH2O 补足到50 L。PCR程序：94 3 min；94 1 min，55 1 min，72 2 min，30 个循环；72 5 min。PCR产物经1.5%（质量体积分数）琼脂糖检测后，回收目的条带，纯化后，用扩增引物进行双向测序。获得的序列在GenBank中进行BLAST比对，查找相似性最高的序列信息，并结合菌株的形态学特征，以确定真菌种类。当所测菌株的ITS序列与NCBI库中片段相似性大于99%，则认为是同一物种；所测菌株ITS序列与NCBI库中片段相似性大于95%，则认为是同一属的物种；相似性小于95%，认为是未鉴定物种12。1.3.3胶膜菌对叠鞘石斛种子共生萌发的作用胶膜菌菌株P2、P24、P35、P47用无菌打孔器打成9210 期李爱花等：滇西槽舌兰内生真菌多样性及其共生真菌对叠鞘石斛种子萌发的效应直径5 mm左右的圆片；将约八成成熟的叠鞘石斛果实灭菌后，接种到放有纤维网的固体燕麦培养基上，将菌株圆片放到播种的燕麦培养基上，每皿放4块；同时设置1个阴性处理（仅燕麦培养基），1个阳性对照（1/2MS固体培养基）。每个处理重复5次。1.4数据统计与分析通过 Mega 11.0 软件利用 Kimura2-parameter模型进行系统分析。使用 NJ（neighbour-joining)法1314构建系统树，Bootstrap设置为500。用分离率（isolation frequency，IF）来衡量特定植物组织样品中内生真菌的丰度以及植物组织样品中多重侵染的频率14；内生真菌的多样性通过香农多样性指数（H）表示，计算公式如下。H=-(PilnPi）（1）式中，i=1k,k 指滇西槽舌兰的第 k 个生长地，Pi指第i个生长地滇西槽舌兰内生真菌个体数占总个体数比例。2结果与分析2.1滇西槽舌兰根部内生真菌的分离从滇西槽舌兰根部分离得到94个菌落，香格里拉、楚雄、呈贡、盘龙分别获得 22、12、8、52个（表1）。2.2滇西槽舌兰根部内生真菌的分子鉴定分子鉴定结果（表2）显示，从滇西槽舌兰根部共鉴定内生真菌68株，其中盘龙居群最多，为29株；香格里拉和楚雄居群次之，分别为18和12株；呈贡居群最少，为9株。68株内生真菌经初步分子生物学鉴定归属于18个属。其中27.94%属于镰刀菌属（Fusarium）；10.29%属于间座壳属（Diaporthe）；8.82%属于胶膜菌属（Tulasnella）；8.82%属于角担菌属（Ceratobasidium）；8.82%属于交链孢属（Alternaria）（表2）。镰刀菌属真菌在楚雄和呈贡居群的可培养内生真菌中均占 50%以上，在香格里拉和盘龙居群中的占比也较高；胶膜 菌 属 真 菌 仅 在 盘 龙 居 群 分 离 得 到，占 比19.35%；角担菌属真菌仅在香格里拉居群分离得到，占比31.58%（图1）。香格里拉和盘龙居群可培养内生真菌的Shannon多样性指数较高，分别为2.93和3.23，不同种群在不同属间分布较均匀；楚雄和盘龙居群的 Shannon 多样性指数仅为 1.38 和 1.44，即分离的内生真菌种类少且分布不均匀，仅分布在 3个属。系统聚类分析（图2）表明，68株内生真菌属于2门、3纲、8目、12科（图2）。其中有12株内生真菌属于担子菌门（Basidiomycota）；有 56 株内生真菌属于子囊菌门（Ascomycota）。在纲水平，分 别 属 于伞 菌 纲（Agaricomycetes）、座 囊 菌 纲（Dothideomycetes）和粪壳菌纲（Sordariomycetes）。属于伞菌纲的12个菌株中，菌株P2、P21与美孢胶膜菌（Tulasnella calospora）序列的一致性较高，菌株 P24、P35、P12、P49 与胶膜菌属（Tulasnella）序列的一致性较高，因此将其鉴定为胶膜菌属；菌株 D4、D5、D6、D10、D13、D19 与 角 担 菌 属（Ceratobasidium）具有较高的相似性，因此将其鉴定为角担菌属真菌，这些菌株聚为1支，属于鸡油菌目（Cantharellales）。在属于粪壳菌纲的47株内生菌中，除毛壳菌属（Chaetomium）的菌株P17、P19外，其他45株内生菌被聚为4个分支。其中，属于镰刀菌属、木霉属（Trichoderma）和生赤壳属（Clonostachys）的 23个 菌 株 被 聚 为 1 支（），属 于 肉 座 菌 目（Hypocreales）；属于炭角菌属、Obolarina、炭垫菌属（Nemania）、Biscogniauxia、拟 盘 多 毛 孢 属表14个分布地/栽培地滇西槽舌兰根部内生真菌分离结果Table 1Isolation results of fungal isolates from roots of Holcoglossum rupestre in 4 localities地点Locality香格里拉Shangrila楚雄Chuxiong呈贡Chenggong盘龙Panlong样品编号Sample No.DCKP分离率IF/%36.6725.4516.0020.80菌落数Number of fungi221285293中 国 农 业 科 技 导 报25 卷（Pestalotiopsis）和新拟盘多毛孢属（Neopestalotiopsis）的 13 个菌株被聚为 1 支（），属于炭角菌目（Xylariales）；菌株D2单独聚为1支（），它属于刺盘孢属(Colletotrichum）、小丛壳目（Glomerellales）；属于间座壳属和拟茎点霉属（Phomopsis）的 8个菌株被聚为 1支（），属于间座壳目（Diaporthales）。属于座囊菌纲的 9个菌株被聚为 2个分支。表2不同地区滇西槽舌兰根部内生真菌的种类及数量Table 2Fungal taxon and amount in roots of Holcoglossum rupestre from different regions属Genus镰孢属Fusarium间座壳属Diaporthe角担菌属Ceratobasidium胶膜菌属Tulasnella交链孢属AlternariaBiscogniauxia拟盘多毛孢属Pestalotiopsis木霉属Trichoderma新拟盘多毛孢属Neopestalotiopsis炭角菌属Xylaria新壳梭孢属Neofusicoccum刺盘孢属Colletotrichum生赤壳属Clonostachys旋孢腔菌属Cochliobolus炭垫菌属Nemania毛壳菌属Chaetomium拟茎点霉属PhomopsisObolarina总计TotalShannon多样性指数Shannon s diversity index香格里拉Shangrila326011010011110000182.93楚雄Chuxiong700023000000000000121.38呈贡Chenggong50002002000000000091.44盘龙Panlong450610402210001111293.23合计Total197666443222111111168图1不同地区滇西槽舌兰根部内生真菌的相对丰度Fig.1Relative abundance of cultured endomycetes in root of Holcolglossum repestre from different regions9410 期李爱花等：滇西槽舌兰内生真菌多样性及其共生真菌对叠鞘石斛种子萌发的效应其中，菌株D12和P29被聚为1支（），属于新壳梭孢属；属于交链孢属（Alternaria）和旋孢腔菌属（Cochliobolus）的7个菌株及属于粪壳菌纲毛壳菌属的P17、P19被聚在1支（）。2.3叠鞘石斛种子共生萌发的效应胶膜菌P2与叠鞘石斛种子的共生萌发试验显示，P2对叠鞘石斛种子萌发有促进作用，即共生菌P2能够促进叠鞘石斛种子萌发（图3）。萌发60 d后，对照种子全部处于萌发第1阶段（图3C）；与胶膜菌P2共生的叠鞘石斛种子已长出生长点（图3D），处于典型附生兰种子萌发的第3阶段15；1/2MS培养基上萌发的叠鞘石斛部分原球茎也长出生长点，但仍有少量种子仅吸水膨大，处于萌发的第1阶段（图3E）。与P2共生菌共生萌发处理的种子86.16%处于种子萌发第2阶段，13.84%处于种子萌发第3阶段；对照大部分种子萌发至第2阶段（84.09%），仍有15.01%种子胚处于第1阶段（图3F）。综上所述，胶膜菌菌株P2对叠鞘石斛种子萌发有显著促进作用。3讨论本研究在4个生长地的滇西槽舌兰根内均分离得到多种内生真菌，且不同生长地分离得到的内生真菌存在差异，镰刀菌属、间座壳属、胶膜菌属、角担菌属、链格孢属是占比较高的真菌类群；且不同分布地的内生真菌在属水平也存在差异。其中，角担菌属、刺盘孢属、生赤壳属和旋孢腔菌注：内圈不同颜色表示科水平；外圈不同颜色表示目水平。Note：Different colors of inner circular indicate the family level；different colors of outer circular indicate the order level.图2滇西槽舌兰根部内生真菌的系统聚类树Fig.2Phylogenetic tree of cultured endomycetes in root of Holcolglossum rupestre95中 国 农 业 科 技 导 报25 卷属为香格里拉居群的特有菌属；胶膜菌属、拟盘多毛孢属、新拟盘多毛孢属、炭角菌属、炭垫菌属、毛壳菌属、拟茎点霉属、Obolarina为盘龙居群的特有菌属；而楚雄和呈贡居群未检测到特有菌属。这可能与居群所在地（栽培地）的环境有关，同时与采样的广度和强度也有关16。对滇西槽舌兰根部内生真菌进行 ITS rDNA序列测定，鉴定其亲缘关系发现，在门水平分离菌株分别属于担子菌门和子囊菌门2大类；在目水平属于鸡油菌目、肉座菌目、炭角菌目、粪壳菌目、葡萄座腔菌目、格孢腔菌目、Glomerellales、间座壳目8个目，这几个目也是热带、亚热带附生兰常见的内生真菌类群11；在属水平，间座壳属、角担菌属、Biscogniauxia、拟盘多毛孢属、木霉属、新拟盘多毛孢属、炭角菌属、新壳梭孢属、旋孢腔菌属、炭垫菌属、毛壳菌属、Obolarina等内生菌属，均为槽舌兰属植物首次报道的内生真菌类群。其中，兰科典型的共生真菌胶膜菌属、角担菌属为首次在滇西槽舌兰中分离得到，且角担菌属还是首次在槽舌兰属植物中分离得到。胶膜菌属中的无性态瘤菌根菌属（Epulorhiza）曾 在 短 距 槽 舌 兰（Holcoglossum flavescens）、舌唇槽舌兰（Holcoglossum subulifolium）、维西槽舌兰（Holcoglossum weixiense）、中华槽舌兰（Holcoglossum sinicum）中分离得到9。Tan等9在 9个槽舌兰属物种中分离得到 16个属的内生真菌，其中赤壳属（Cosmospora）、枝孢属（Cladosporium）、拟隐孢壳属（Cryptosporiopsis）、亚 格 孢 壳 属（Didymella）、小 球 腔 菌 属（Leptosphaeria）、蚁霉属（Myrmecridium）、拟盾壳霉属（Paraconiothyrium）、须壳孢属（Pyrenochaeta）、Stephanonectria在本研究中未检测到；而本研究分离得到的间座壳属、角担菌属、拟盘多毛孢属、木霉属、新拟盘多毛孢属、炭角菌属、新壳梭孢属、旋孢腔菌属、炭垫菌属、毛壳菌属、Obolarina共12个属的内生真菌在Tan等9 的研究中未检测到。说明槽舌兰属植物的内生真菌具有较高的物种多样性，且已分离得到的内生真菌与宿主间的专一性较低。研究表明，植物组织状态、水分、碳氮营养条件等均影响兰科植物根际真菌多样性17-19。本研究在香格里拉居群分离得到镰孢菌属、间座壳属、角担菌属等共10个属的菌株，而Tan等9于2011年在该地采集的滇西槽舌兰中仅分离得到 4 个菌属。其中，仅镰刀菌属是2个研究中都分离到的菌属，且本研究中该居群分离得到较多前人未报道的菌株类群，包括兰科典型的共生真菌角担菌A：菌株P2；B：P2菌丝；C：阴性对照种子；D：P2共生萌发原球茎；E：非共生萌发原球茎；F：不同阶段种子萌发统计A：Fungus strain P2；B：Euhypha of P2；C：Nagative control；D：Symbiotic germinating protocorms with P2；E：Non-symbiotic germinating protocorms；F：Germination percentage of different stages图3胶膜菌菌株P2与叠鞘石斛种子的共生萌发Fig.3Myco-germination of Dendrobium denneanum with mycorrhiza fungus P29610 期李爱花等：滇西槽舌兰内生真菌多样性及其共生真菌对叠鞘石斛种子萌发的效应属。这可能是因为兰科植物内生真菌的多样性会随生长季节的变化而变化，从而满足植株生长发育的营养需求20。Jacquemyn等21认为，亲缘关系较近的兰科物种中的共生真菌相似性较高，即兰科植物与共生真菌间存在一定的专一性。附生兰大多与胶膜菌科、角担菌科、腊壳菌科等担子菌门的真菌类群有较强的专一性22-24。在香格里拉的滇西槽舌兰居群分离得到角担菌属、盘龙居群分离得到胶膜菌属，这些是典型的兰科共生真菌类群，而在 Tan等9研究的滇西槽舌兰中未分离到这类菌群。由此可见，滇西槽舌兰内可培养共生真菌在属水平上具有较低的物种专一性，这可能是由于兰科根部共生真菌对生境具有较高敏感性，进一步表明光合自养型兰科植物具有较低的内生真菌专一性21。胶膜菌是典型的兰科植物共生真菌，它们可显著促进兰科植物种子萌发和幼苗生长2526；分离 自 兜 唇 石 斛（D.aphyllum）和 硬 叶 兰（Cymbidium mannii）的内生真菌能够促进齿瓣石斛（D.devonianum）的种子萌发及圆球茎形成27。本研究发现，6株胶膜菌中，有2株（P2、P47）能够显著促进叠鞘石斛种子萌发，缩短叠鞘石斛种子的萌发时间，增加种子萌发的一致性，与前人研究结果一致。这可能是因为这2株共生菌能够提供叠鞘石斛种子萌发过程所需要的营养物质。滇西槽舌兰中分离的共生菌能够促进叠鞘石斛种子萌发，说明菌株P2和P47对宿主植物在种水平上不存在专一性，即宿主特异性较低，这在一定程度上支持Hadley28关于兰科植物与共生菌不存在专一性的观点。关于兰科植物与共生真菌之间的互作关系，一直以来是兰科植物的研究热点和争论焦点。本研究发现，滇西槽舌兰内生真菌的多样性较高，且内生真菌的宿主植物具有广泛性，由此表明，滇西槽舌兰与内生真菌间的共生关系存在广泛性。参考文献1 RODRIGUEZ R J,WHITE JR J F,ARNOLD A E,et al.Fungal endophytes:diversity and functional roles J.New Phytol.,2009,182(2):314-330.2 NAIK B S.Functional roles of fungal endophytes in host fitness during stress conditions J.Symbiosis,2019,79:99-115.3 BARBERIS L,MICHALET S,PIOLA F,et al.Root fungal endophytes:identity,phylogeny and roles in plant tolerance to metal stress J.Fung.Biol.,2021,125(4):326-345.4 MCCORMICK M K,WHIGHAM D F,ONEILL J P,et al.Abundance and distribution of Corallorhiza odontorhiza reflect variations in climate and ectomycorrhizae J.Ecol.Monographs,2009,79(4):619-635.5 SMITH S E,READ D J.Mycorrhizal symbiosis 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