DB3301∕T 1089-2018 甘薯脱毒种苗标准化生产技术规程(杭州市).pdf

ICS 65.020.20B 21DB3301浙江省杭州市地方标准DB 3301/T 10892018甘薯脱毒种苗标准化生产技术规程2018 - 06 - 20 发布2018 - 06 - 20 实施杭州市质量技术监督局发 布DB3301/T 10892018I前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由杭州市农业局提出并归口。本标准起草单位：杭州市农业科学研究院、建德市种子管理站、余杭区农业技术推广中心、淳安县农业技术推广中心、临安区农林技术推广中心、浙江大学。本标准主要起草人：石江、赵琳、严百元、方文英、余建忠、骆乐谈、朱月清、孙钟毓、马华升。DB3301/T 108920181甘薯脱毒种苗标准化生产技术规程1范围本标准规定了甘薯脱毒种苗的术语和定义、生产技术、控制和淘汰的病虫害、病虫害防治、抽样、扩繁苗的检测、质量要求和收获。本标准适用于甘薯脱毒种苗繁育、生产和质量管控。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 7413甘薯种苗产地检疫规程NY/T 402脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程NY/T 1200甘薯脱毒种薯3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1脱毒组培苗应用茎尖分生组织培养技术获得，经检测确认不带甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯褪绿斑病毒（SPCFV）、甘薯病毒G（SPVG）、甘薯病毒2（SPV2）、甘薯褪绿矮缩病毒（SPCSV）的组培苗。3.2脱毒种苗在有保护措施的基质中用脱毒组培苗扩繁后的种苗， 在本规范中， 包括初级至四级繁育的脱毒种苗。4生产技术4.1基地选择应选择周边500 m内无村庄，无甘薯及旋花科、茄科、葫芦科作物种植，无检疫性病虫害发生的区域，选用背风向阳、排灌方便、前作非以上作物种植及有隔离条件的地块，建立塑料大棚，大棚外完全覆盖60目尼龙网，其中入口处设拉链，方便人员进出。4.2育苗基质根据条件选用商用育苗基质。4.3基质槽建立与基质铺设DB3301/T 108920182在保护大棚内，按基质槽宽80 cm，操作道宽40 cm，建立基质槽，槽底用约10 cm细石子与土壤隔离，基质铺设厚度约20 cm。移栽前1天浇水至基质含水量70%左右。4.4基质消毒脱毒组培苗移栽前40天，密闭大棚，用二氧化氯土壤消毒剂（2 kg/667 m2）通过喷灌或滴灌对基质进行消毒，直到基质底层完全湿润后关闭阀门，大棚密闭消毒7天，随后通风排除残留氯气。4.5种性鉴定将脱毒苗种植于防虫网室内，每株系3株，对照原品种的特征特性及生产力鉴定，剔除变异株系和混杂株系，选用生产力强的株系进行扩大繁殖。4.6脱毒种苗繁育4.6.1初级脱毒种苗繁育大棚基质槽加设小拱棚，当小拱棚内温度稳定在20以上时，选取植株长势好、经鉴定无病毒携带的脱毒组培苗，洗去根部培养基后即刻移栽至大棚，基质槽内密度为20 cm20 cm。边移栽边浇水活苗，并遮荫3天。注意大棚、小拱棚内通风管理，保持苗生长温度在25-30，当大棚内温度稳定在20以上时，拆掉小拱棚。根据基质类型、种苗生长情况对其进行肥水管理。4.6.2次级脱毒种苗繁育当初级脱毒种苗生长至10节以上，以每2节作1株剪取种苗，母株留12个节位，用作次级脱毒种苗生产。剪取的种苗立即在次级脱毒种苗繁育大棚内移栽，在基质槽内脱毒组培苗移栽密度约为40 cm10cm。管理同4.6.14.6.3三级脱毒种苗繁育当次级脱毒种苗生长总节数至20节以上时，按照4.6.2的方法繁育三级脱毒种苗。4.6.4四级脱毒种苗繁育参照4.6.3 三级脱毒种苗繁育的方法。5控制和淘汰的病虫害5.1控制的病虫害通过控制病害的发生程度以达到脱毒种苗质量要求的病害:a)甘薯羽状斑驳病毒（sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）；b)甘薯褪绿斑病毒（sweet potato chlorotic flecks virus,SPCFV）；c)甘薯病毒 G（sweet potato virus G,SPVG）；d)甘薯病毒 2（sweet potato virus 2,SPV2）；e)甘薯褪绿矮缩病毒（sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）；f)黑斑病（Black rot，病原 Ceratocystis fimbriata ELL. Halst）；g)疮痂病（Scab,病原 Sphaceloma batatas Sawada）；h)蔓割病Stem rot, Fusarium wilt；病原 Fusarium oxysporum f.sp.batatas (Wollenweber)Snyderet Hansen；DB3301/T 108920183i)茎线虫病（Stem nematode,Brown ring；病原 Ditylenchus destructor Thorne）。5.2淘汰的病虫害不能在达到质量要求的脱毒种苗上发生的病虫害：a)根结线虫病Root-knot nematode，病原 Meloidogyne incognita(KofoidWhite)Chitwood；b)细菌性萎蔫病（甘薯瘟）（Bacterial wilt,病原 Pseudomonas solanacearum E.F.Sm.）；c)根腐病Root rot,病原 Fusarium solani(Mart.)Sacc.f.sp.batatas Mc Clure；d)甘薯小象甲（蚁象）Weevil, Cylas.formicarius(Fabricius)；e)茎腐病（bacterial stem and root rot；病原 Erwinia cA/ysanfAmi）。6病虫害防治6.1主要病虫害主要病虫害有甘薯黑斑病、根腐病、病毒病、蚜虫、地老虎、蛴螬等。6.2防治原则按照“预防为主，综合防治”的方针，坚持以“农业防治、物理防治和生物防治为主，化学防治为辅”的无害化治理原则。6.3农业防治保持防虫网的完整，加强操作人员进入卫生与进出管理，及时关闭防虫网，合理调节环境因子、改善栽培条件、优化水肥管理，创造有利于甘薯生长发育而不利于病害发生的环境条件。6.4物理防治采用杀虫灯、黄板以及性诱剂诱杀害虫。6.5生物防治释放天敌，保护天敌，创造有利于天敌生存的环境，选择对天敌杀伤力低的农药。6.6化学防治6.6.1防治原则对症下药，适期用药，交替使用。运用适当的浓度与剂量，合理混配，严格控制用量。6.6.2黑斑病用60%唑醚代森联1000倍液或25%嘧菌酯1500倍液浸泡茎基部6 cm10 cm处10 min12 min，然后再进行扦插。6.6.3根腐病用77%氢氧化铜可湿性粉剂500倍液等喷雾防治。6.6.4蚜虫用10%啶虫脒3000倍液喷雾防治。DB3301/T 1089201846.6.5地老虎和蛴螬用0.2%联苯菊酯颗粒剂亩施35 kg或1%联苯噻虫胺颗粒剂亩施5-6 kg， 可结合后期施肥一同施下。7抽样7.1脱毒组培苗抽样7.1.1脱毒核心材料必须每株都进行检测。7.1.2扩繁组培苗随机抽取 1%2%。7.2甘薯脱毒种苗抽样采收前1周，在目测全田基础上，采用五点取样法，抽样数量为：1000 m2以下200株；110010000hm2500株；病毒检测每株取茎蔓上、中、下部叶片各1片，应液氮或干冰保存，一天内检测。8检测8.1生物学方法8.1.1目测法（外观症状诊断法）可根据甘薯叶片上出现的典型症状判断甘薯是否带毒。甘薯病毒病的主要症状详见附录 A。8.1.2指示植物检测法用于辅助检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒。 方法： 以待检样品茎蔓为接穗，巴西牵牛为砧木。将待检样品茎蔓中下部茎段切成 3 段5 段，每个接穗带一个单芽及叶片，去叶后将底端削成楔形，插入巴西牵牛砧木切口内，封口膜扎紧。巴西牵牛生长出 12 片真叶时嫁接，嫁接后白天保持气温 2632，相对湿度 80%90%，适当遮荫，嫁接成功后，给予充足光照。嫁接后2 周3 周显症，在所有嫁接指示植物中只要有一株植物叶片表现羽状斑驳症状即存在羽状斑驳病毒，叶脉变黄则存在甘薯潜隐病毒，叶片褪绿斑则存在甘薯褪绿斑病毒。8.2酶联免疫吸附法（ELISA）当组培苗展开叶达6片以上时进行检测，检测方法见附录B。8.3RT-PCR 技术运用RT-PCR技术对提取的甘薯叶片总RNA进行检测。9质量要求凡酶联免疫检测、RT-PCR检测或指示植物检测呈阳性者为带毒（苗），其中原种病毒病株允许率2.0%，生产用种病毒病株允许率10%。脱毒种苗分级以繁殖田播种的种薯级别、带病植株比率、混杂植株比率为定级标准。只要检出根腐病、根结线虫病、甘薯瘟、甘薯茎腐病、甘薯小象甲（蚁象），即不能作为种苗。具体见附录A。10生产用脱毒种苗收获DB3301/T 108920185次级脱毒种苗及三、四级脱毒种苗均可作为生产用脱毒种苗，作生产用脱毒种苗时，应剪取34节为1株苗。不同品种单收单放，做好标记严禁混杂。11生产模式图生产技术模式见附录C。DB3301/T 108920186AA附录A（资料性附录）甘薯主要病虫害症状甘薯主要病虫害症状参见表A.1。表 A.1甘薯主要病虫害症状病害名称植株块根甘薯病毒病苗期叶片褪绿斑点或轻微褪绿半透明斑，边缘上卷，生长后期，有些斑点四周呈紫褐色或形成紫环斑，多数品种沿叶脉形成紫色羽纹状；发展到一定时期，叶片皱缩黄化，叶缘不整齐或扭曲，有与中脉平行的褪绿半透明斑，个别植株有丛生现象。薯块上产生黑褐色或黄褐色龟裂纹，排列成横带状或贮藏后内部薯肉木栓化，剖开病薯可见肉质部具黄褐色硬脆斑块。甘薯细菌性萎蔫病 （甘薯瘟）从育苗到结薯均能发病。晴天中午，病苗顶部叶片萎垂，茎基呈现黑褐色水烂状，维管束从上而下黄褐色条纹状，严重时，茎内全部腐烂，仅残留纤维。成株发病，叶色暗淡，无光泽，蔓出现水渍状斑点，呈黑褐色，剖视维管束，褐色条纹用手拉易脱皮，留下纤维。轻病薯块乳汁明显减少，有臭味，煮后不烂，外表症状常部明显，仅薯蒂附近呈黑褐色或尾根呈不同程度病变，剖开横切面为分散的褐色小斑点或黄褐色至深褐色斑块，纵切面从藤头或自尾根始，维管束呈黄褐色条纹状，可挤出乳状菌脓。重症薯块，整块呈黑褐色腐烂或一端腐烂，有脓液状或淡黄色菌液，臭味浓烈。甘薯黑斑病茎基部形成黑褐色梭形或椭圆形病斑，稍凹陷，病斑初期有灰色霉层，后变为黑色粉状物，病斑逐渐扩大，重者基部全部变黑，枯死。薯块上形成黑色近圆形病斑，病部稍凹陷，病健交界明显，组织坚实，如用刀横割病斑部，可见薯皮下的薯肉呈青褐色或黑褐色， 深0.5 cm2 cm，有强烈的臭味。病部木栓化，坚硬，干腐，在适当条件下，病斑中央会长出黑色刺毛状物-子囊壳。甘薯疮痂病叶片卷皱呈木耳形；芽僵缩；茎蔓和叶柄生出凸凹粗糙的病斑，病蔓先端硬化僵直不再完全伏地；顶芽受害病斑初为透明深红色，扩大后逐渐变黑褐色而枯死；新梢和幼叶不能长大，整个顶梢收缩僵硬而直立，表现粗糙成麻脸状。薯块表面产生暗褐色至灰褐色小点或于斑，干燥时疮痂易脱落，残留疹状斑或疤痕。甘薯蔓割病幼苗、叶脉间叶肉变黄，茎内维管束变褐色。潮湿时，病部产生白色至粉红色的霉层。轻者分枝增生和节间缩短，茎基膨大，出现青晕，表皮似裂呈丝状。罹病植株发生全株性枯萎、死亡，地上部叶片自下而上变黄脱落，茎开裂。维管束变褐，横切薯块蒂部，可见褐色圆环形斑点，严重时，上部茎蔓枯死，而薯块并不腐烂，且在土表抽出很多幼蔓。甘薯根腐病根系腐烂，多从不定根的尖端或中部开始变黑，逐渐向上蔓延至根茎部位12个叶节，形成黑褐色病斑。病斑表皮纵裂，重病株地下根茎大部分变黑，地上部茎蔓缩短，分枝少或无分枝，形成独杆苗，一般不结薯，轻病株结薯畸形，呈大肠状或葫芦状，表皮松软，表面小病斑，用手一拉就下来，未向薯肉深入。DB3301/T 108920187叶片发黄、反卷、叶变小，组织硬化且脆，叶片自下而上干枯脱落，植株大量现蕾开花，常造成大片死苗，重者全部死亡。甘薯根结线虫病根系形成绳结状，使地下部多牛蒡状，毛根纵生，细跟上有米粒大小的根结，有的成串，剥开根结，可见一至数个雌虫。龟裂型：块根畸形，褐色纵裂口棒根型：粗1 cm2 cm，棒状块根线根型：只有线状牛蒡根，不膨大成薯块。甘薯茎线虫病苗期：发病重的出苗稀、矮小、发黄，剖视茎基部，内有褐色空隙，剪断后不流或很少流白浆。后期侵入部位表皮裂成小口，髓部呈褐色干腐状，剪断后无白浆。茎蔓症状：主蔓基部髓部先白色干腐，后渐变褐色，严重时基部蔓短、叶黄，甚至主蔓枯死。根部症状：根部表皮坏裂。糠心型：薯苗、种薯带病，先块根纵剖面内部呈稀絮状白色糠道，后期由于伴随其他杂菌形成褐色相间的褐色糠道。有时内部虽毁坏，但外表接近健者。裂皮型：发病轻肉眼不易看出，开始外皮褪色，不久变青，有的稍凹陷，有的有小裂口，皮下组织变褐，最后皮色呈暗紫色，并多龟裂，内呈褐白相间的干腐。甘薯茎腐病甘薯茎枝在发病初期，病株生长较为缓慢，在与土壤接触的茎基部会产生褐至黑色、水渍状的病斑，最后软化解离，导致枝条末端的部分萎凋。此外，根茎维管束组织有明显的黑色条纹、并有恶臭。在高温高湿的条件下，茎部腐烂迅速向上扩展，呈黑色，茎、叶组织开始变软、腐烂，整个植株发病倒伏，最后全株枯萎死亡。薯块表面有黑色凹陷病斑,或外部无症状，内部腐烂，受侵染组织呈水浸状。甘薯小象甲（蚁象）外露的块根和茎叶被啃食，常使植株变黄，重者死亡，造成田间缺苗。幼虫危害薯块，取食成蛀道，且排泄物充斥于蛀道中，能诱导薯块产生萜类和酚类物质，使薯块变苦。DB3301/T 108920188BB附录B（资料性附录）斑点酶联免疫检测法（DOT-ELISA）B.1试剂所用化学试剂为分析纯级规格，用水为蒸馏水。B.1.1三羟甲基氨基甲烷（TBS） （pH7.5）Tirs Base4.84g氯化钠（NaCl）58.44g叠氮钠（NaN3）0.40g溶于1990ml蒸馏水中，用盐酸（37%）调pH至7.5，定容至2000ml。B.1.2洗涤缓冲液（T-TBS）1.0ml吐温-20（Tween-20）溶于2000mlTBS中。B.1.3抽提缓冲液亚硫酸钠（Na2SO3）0.2g溶于TBS中，定容至100ml。B.1.4封闭缓冲液（现用现配）脱脂奶粉0.50g粹通X-100（Triton X-100）0.5mlTBS25ml先将脱脂奶粉溶于少量TBS中，再用TBS定容至25ml。加入Triton X-100混合均匀。B.1.5抗体稀释缓冲液脱脂奶粉1.00gTBS50ml先将脱脂奶粉溶于少量TBS中，再用TBS定容至50ml。B.1.6底物缓冲液（pH9.5）Tris Base6.05g氯化钠（NaCl）2.92g氯化镁（MgCl26H20）0.51g叠氮钠（NaN3）0.05g溶于450ml蒸馏水中，用浓盐酸调pH至9.5，定容至500ml。B.1.7硝基蓝四唑盐（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（BCIP）储备液NBT储备液：NBT0.04gDB3301/T 10892018970%N,N-二甲基甲酰胺1.2ml混合均匀，4避光保存。BCIP储备液：BCIP0.02g70%N,N-二甲基甲酰胺1.2ml混合均匀，4避光保存。B.1.8底物溶液（现用现配）底物缓冲液25mlNBT储备液75lBCIP储备液75l先将NBT储备液溶于25ml底物缓冲液中，再逐滴加入BCIP储备液，边加加振摇混匀。B.2样品制备将待检叶片用清水清洗干净，从每一样品叶片上各取一直径约1cm圆片，放入样品袋中，加入3ml抽提缓冲液充分研磨，4静置30min40min，取澄清汁液点样。样品为块根时，催芽处理后取幼芽、叶制样。B.3操作步骤B.3.1点样将打好方格的硝化纤维素膜用TBS缓冲液处理后放在洁净的滤纸上，每个样品各吸取17l上清液滴在膜上方格的正中，干燥15min30min。同时设阳性、阴性和空白对照，可根据需要设置重复。B.3.2封闭将干燥后的膜浸泡在封闭缓冲液中，室温下摇床振荡（50r/min）1h。B.3.3孵育第一抗体将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的抗血清中，室温下摇床振荡（50r/min）过夜。B.3.4洗涤用洗涤缓冲液洗膜3次，每次摇床振荡（100r/min）3min。B.3.5孵育第二抗体将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的酶标抗体中，室温下摇床振荡（50r/min）1 h。B.3.6洗涤洗涤4次，方法同A3.4。B.3.7显色将膜置于NBT/BCIP 底物溶液中，室温下摇床振荡（50r/min）孵育30min。DB3301/T 1089201810B.3.8终止反应弃去底物溶液并用蒸馏水洗膜3次，每次摇床振荡（100r/min）3min。B.3.9阳性判断晾干后观察颜色反应，出现蓝紫色颜色反应的样品为阳性。DB3301/T 1089201811附录C（资料性附录）甘薯脱毒种苗标准化生产模式甘薯脱毒种苗标准化生产模式参见图C.1。图 C.1甘薯脱毒种苗标准化生产模式图_