蛋白类酶的分离纯化专家讲座.pptx

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四章 酶分离纯化,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第1页,1、酶分离纯化原因（3条）,2、酶分离纯化判定依据蛋白质物理化学特征（9条）,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第2页,内 容,1、酶提取与分离纯化技术路线,2、细胞破碎,3、酶提取,4、酶分离方法,5、酶组合分离纯化策略,6、,酶浓缩、干燥与结晶,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第3页,细胞结构与酶分布,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第4页,3.1 酶提取、分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心，过滤、沉淀、层析分离、电泳、萃取、结晶等分离方法,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第5页,酶,纯化过程，约可分为三,个阶段,：,(1)粗,蛋白质,(crude protein):,采样,均,质,打破细胞 抽出全蛋白，多使用,盐,析,沉淀,法,；能够粗略去除蛋白质以外物质。,(2)部分纯化(partially purified):初步纯化，使用各钟,柱,层,析法,。,(3)均,质酶,(homogeneous):,目标酶,进,一步精制纯化，可用,制备,式,电泳,或,HPLC,。,酶分离纯化不一样阶段,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第6页,3.2 细胞破碎,许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。,1）机械破碎,2）物理破碎,3）化学破碎,4）酶解破碎,JY92-II D超声波,细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第7页,机械破碎,捣碎法,研磨法,匀浆法,物理破碎,温度差破碎法,压力差破碎法,超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂：,甲苯、丙酮,丁醇、氯仿,表面活性剂：,Triton、Tween,酶促破碎,自溶法,外加酶制剂法,经过机械运动产生剪切力，使组织、细胞破碎,。,经过各种物理原因作用，使组织、细胞外层结构破坏，而使细胞破碎,。,经过各种化学试剂对细胞膜作用，而使细胞破碎,经过细胞本身酶系或外加酶制剂催化作用,，,使细胞外层结构受到破坏，而到达细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第8页,酶提取是指在一定条件下，用适当溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中过程。也称为酶抽提。,酶提取时首先应依据酶结构和溶解性质，选择适当溶剂,。普通说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。,酶都能溶解于水，,通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取,，有些酶与脂质结合或含有较多非极性基团，则可用有机溶剂提取。,3.3 酶提取,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第9页,提升温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提升酶分子扩散速度，从而增大提取效果。,为了提升酶提取率并预防酶变性失活，在提取过程中还要注意控制好,温度,、,pH,值等提取条件,。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第10页,为了使蛋白质充分溶解并保持蛋白质结构与活性，蛋白质提取缓冲液常包含成份,控制溶液pH值缓冲对；,控制溶液离子强度无机盐；,控制溶液氧化还原状态还原剂；,蛋白酶抑制剂,离子螯合剂,标准牛血清白蛋白,去污剂,水和防腐剂,甘油,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第11页,酶主要提取方法,提取方法,使用溶剂或溶液,提取对象,盐溶液提取,0.020.5mol/L盐溶液,用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大酶,酸溶液提取,PH26水溶液,用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性很好酶,碱溶液提取,PH812水溶液,用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性很好酶,有机溶剂提取,可与水混溶有机溶剂,用于提取那些与脂质结合牢靠或含有较多非极性基团酶,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第12页,大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度盐存在条件下，酶溶解度随盐浓度升高而增加，这称为,盐溶现象,。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第13页,3.4 酶分离方法,1、沉淀分离,2、离心分离,3、过滤与膜分离,4、层析分离,5、电泳分离,6、萃取分离,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第14页,1、沉淀分离,沉淀分离是经过改变一些条件或添加某种物质，使酶,溶解度降低,，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离技术过程。,沉淀分离方法,分离原理,盐析沉淀法,利用不一样蛋白质在不一样盐浓度条件下溶解度不一样特征，经过在酶液中添加一定浓度中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离,等电点沉淀法,利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不一样两性电解质有不一样等电点这一特征，经过调整溶液pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离,有机溶剂沉淀法,利用酶与其它杂质在有机溶剂中溶解度不一样，经过添加一定量某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离,复合沉淀法,在酶液中加入一些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离,选择性变性沉淀法,选择一定条件使酶液中存在一些杂质变性沉淀，而不影响所需酶，从而使酶与杂质分离,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第15页,在盐浓度到达某一界限后，酶溶解度随盐浓度升高而降低，这称为,盐析,现象。盐析主要原理在于高浓度盐离子与蛋白质争夺水化水，破坏蛋白质分子表面水化膜，同时因为反离子作用，也影响蛋白质分子所带电荷,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第16页,在一定温度和pH值条件下（为常数），经过改变离子强度使不一样酶或蛋白质分离方法称为,Ks分段盐析,；,而在一定盐和离子强度条件下（Ks,I,为常数），经过改变温度和pH值，使不一样酶或蛋白质分离方法，称为,分段盐析,公式,logS=logS,0,-KsI=,-KsI,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第17页,在蛋白质盐析中，通常采取中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为惯用。这是因为硫酸铵在水中溶解度大而且温度系数小，不影响酶活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子存在会干扰蛋白质测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。,在盐析时，溶液中硫酸铵浓度通常以,饱和度,表示（指溶液中加入饱和硫酸铵体积与混合溶液总体积比值）,解读蛋白质工程p204页表73,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第18页,有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是因为有机溶剂存在会使溶液介电常数降低。比如，20时水介电常数为80，而82乙醇水溶液介电常数为40。,溶液介电常数降低，就使溶质分子间静电引力增大，相互吸引而易于凝集，同时，对于含有水膜分子来说，有机溶剂与水相互作用，使溶质分子表面水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出,。,惯用于酶沉淀分离有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第19页,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第20页,2、离心分离,离心分离是借助于离心机旋转所产生离心力，使不一样大小、不一样密度物质分离技术过程。,在离心分离时，要依据欲分离物质以及杂质,颗粒大小,、,密度和特征不一样,，选择适当离心机、离心方法和离心条件。,常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物分离。也用于酶结晶等较大颗粒分离。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第21页,高速离心机,最大转速为（12.5）104 r/min，相对离心力到达 11041105 g，在酶分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等分离。,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机,超速离心机,最大转速达(2.512)104 r/min，相对离心力能够高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等分离纯化；样品纯度检测；沉降系数和相对分子质量测定等。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第22页,超速离心有三种：,差速离心,：采取不一样离心速度和离心时间，使不一样沉降速度颗粒分批分离方法,密度梯度离心：,使沉降系数比较靠近物质得以分离一个区带分离方法。必须预先配制好适宜密度梯度系统离心前将样品小心地铺放在预先制备好密度梯度溶液表面。（密度相近，分子量不一样）梯度较浅，密度较低,等密度梯度离心：,分离密度不一样颗粒，欲分离颗粒处于密度梯度中等密度点（平衡）才可停顿离心，操作时先把一定浓度介质溶液与样品液混合均匀,。（密度不一样，分子量相近）梯度陡峭，密度较高,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第23页,密度梯度离心前用密度梯度混合器预先配制密度梯度系统，贮液室与混合室截面积关系决定梯度类型。,配制中，,将稀溶液置于贮液室B，浓溶液置于混合室A,如图4-2(郭勇酶工程p96）流出梯度液经过导管小心搜集于离心管,，,假如浓溶液置于贮液室B，稀溶液置于 A室，梯度液导液管必须直插到离心管管底,，让以后流入浓度高混合液将先流入浓度较低混合液顶浮起来形成由管口到管底逐步升高密度梯度,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第24页,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第25页,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第26页,超速离心机按照其用途能够分为制备用超速离心机、分析用超速离心机和分析-制备两用超速离心机3种,蛋白质,分子在离心時，其,分子量、分子密度、组成、形状,等，均会影响其沉降速率，,沉降系数,即用来描述此沉降性质；其单位为,S,(Svedberg unit)。,每一种沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不一样沉降系数蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分离。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第27页,3、过滤与膜分离,过滤是借助于,过滤介质,将不一样大小、不一样形状物质分离技术过程,。,过滤介质各种多样，惯用有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，能够依据需要选取。,过滤,非膜过滤：采取高分子膜以外物质作为过滤介质,膜过滤：采取各种高分子膜为过滤介质,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第28页,过滤分类及其特征,(,依据过滤介质截留物质颗粒大小不一样,),类别,截留颗粒大小,截留主要物质,过滤介质,粗滤,2m,酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等,滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等,微滤,0.22m,细菌、灰尘等,微滤膜、微孔陶瓷,超滤,200.2m,病毒、生物大分子等,超滤膜,反渗透,20 (40,000),压力差，100kPa,筛分,超滤UF,120(10,000-40,000),压力差100kPa,筛分,纳滤NF,1,(1001000),压力差，100),压力差，1000kPa,优先吸附、溶解扩散,四种惯用膜分离技术基本特征,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第33页,四种惯用膜分离过程截留特征,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第34页,4、层析分离,层析技术，亦称色谱技术，是一个物理分离方法,。,它是利用混合物中各组分物理化学性质差异，使各组分以不一样程度分布在两个相中，其中一个相为固定(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不一样速度移动，从而到达分离,。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第35页,层析方法,分离依据,吸附层析,利用吸附剂对不一样物质吸附力不一样而使混合物中各组分分离（分子表面特征）,分配层析,利用各组分在两相中分配系数不一样，而使各组分分离（溶解度）,离子交换层析,利用离子交换剂上可解离基团（活性基团）对各种离子亲和力不一样而抵达分离目标（带电性质）,凝胶层析,以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分相对分子质量不一样而抵达物质分离（分子大小）,亲和层析,利用生物分子与配基之间所含有专一而又可逆亲和力，使生物分子分离纯化（分子形状）,层析聚焦,将酶等两性物质等电点特征与离子交换层析特征结合在一起，实现组分分离,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第36页,吸附层析,吸附层析是利用吸附剂对不一样物质吸附力不一样而使混合物中各组分分离方法,吸附层析通常采取柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成,吸附层析柱,。,层析时，欲分离混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。,在洗脱时，层析柱内不停发生解吸、吸附、再解吸、再吸附过程,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第37页,。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第38页,溶剂洗脱法,采取单一或混合溶剂进行洗脱，各组分按照由弱到强次序先后流出，以洗脱液对组分浓度作图呈峰状，两组分之间有一空白。若两峰重合或拖尾现象出现，可采取按一定规律改变pH梯度或浓度梯度洗脱,置换洗脱法,置换洗脱液中有一吸附力比被吸附组分更强物质取代被吸附成份，后者按照吸附力由弱到强次序流出，以洗脱液对组分浓度作图，可得到阶梯式洗脱曲线,前缘洗脱法,用含有各组分混合溶液本身作洗脱液，连续加入吸附层析柱，吸附剂饱和时吸附力最弱组分开始最先流出。其洗脱曲线即使也呈阶梯型，但只有吸附力最弱组分得以和其它组分分离，仅用于分析前缘组分分析,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第39页,分配层析,定义：分配层析是利用各组分在两相中分配系数不一样，而使各组分分离方法,分配系数,：是指一个溶质在两种互不相溶溶剂中溶解到达平衡时，该溶质在两相溶剂中浓度比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第40页,在分配层析中，通常采取一个多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一个溶剂为,固定相,，这种溶剂在层析过程中一直固定在多孔支持物上。另一个与固定相溶剂互不相溶溶剂可沿着固定相流动，称为,流动相,。当某溶质在流动相带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续动态分配,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第41页,按固定相介质分,纸上层析,分配薄层层析,分配气相层析,分配层析按固定相极性不一样分为,正相分配层析,（极性溶剂为固定相）,反相分配层析,（非极性有机溶剂为固定相）,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第42页,离子层析,离子交换层析,是利用离子交换剂上,可解离基团,（活性基团）,对各种离子亲和力不一样而到达分离,目标一个层析分离方法。,离子交换剂,是含有若干活性基团不溶性高分子物质。经过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第43页,离子交换层析介质由三部分组成：,惰性支持物；带电基团；（带电基团）平衡离子,通常所说离子交换实际上是,蛋白质分子与平衡离子间相互交换,，他们共同竞争离子交换层析介质中带电基团,阳离子交换层析,平衡离子为阳离子，层析介质带电基团带有负电,阴离子交换层析,平衡离子为阴离子，层析介质带电基团带有正电,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第44页,1、,离子交换剂选择,应依据欲分离组分特征和要求，过强吸附以及极端洗脱条件都可能造成活性分子变性失活；另外溶液pH直接决定离子交换剂活性基团及组分离子解离程度，从而影响了离子交换剂交换容量和交换选择性,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第45页,选择离子交换剂时考虑原因：,1）离子交换剂和组分离子物理化学性质；,2）组分离子所带电荷种类；,3）溶液中组分离子浓度高低；,4）组分离子质量大小；,5）组分离子与离子交换剂亲和力大小,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第46页,2、离子交换剂处理,1）溶胀、洗涤至澄清；,2)4V 2 mol/L HCl进行酸处理，洗涤；,3)4V 2 mol/L NaOH进行碱处理，洗涤；,4）装柱,5）用适当试剂进行转型处理，使离子交换剂上所带可交换离子转变为所需离子,比如，阳离子交换剂（如）用NaOH处理，转变为Na+型，用HCl处理，转变为H+型；,阴离子交换剂用NaOH处理，转变为OH-型，用HCl处理转变为Cl-型,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第47页,离子交换剂有离子交换树脂、纤维素、凝胶，一些大孔径离子交换树脂、纤维素、凝胶可用于酶分离纯化。,离子交换层析介质吸附蛋白量很大,，相比于分子筛层析，所用层析柱短而粗,处理好离子交换剂能够在交换槽中进行,分批离子交换,，也能够将离子交换剂装进离子交换柱进行,连续离子交换,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第48页,离子层析分离过程,包含,1、,装柱,：干法装柱和湿法装柱，装填成均匀、无气泡、无裂缝离子交换柱,2、,上柱,:转型后，用溶剂或缓冲液进行平衡，然后将欲分离混合液加入离子交换柱中。上柱时混合液中,盐离子浓度,不能过高、还要注意混合液温度和pH值上柱时要控制适当流速,3、,洗脱,：洗脱液应该含有与离子交换剂,亲和力较大,离子，要经过试验确定,洗脱流速,。洗脱过程中，组分离子按照与交换剂亲和力由大到小次序先后洗出。,对多组分为到达良好分离效果，,惯用浓度梯度或pH梯度洗脱法,，每一个又可选取阶段梯度洗脱或连续梯度洗脱，后者分辨率更高。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第49页,离子层析分离过程,包含,4、,搜集,：与离子层析柱亲和力最小组分先流出，经过紫外检测器检测从层析柱中流出液体在280nm光吸收值，同时用部分搜集器搜集。以洗脱体积为横坐标，以280nm光吸收值为纵坐标，绘制洗脱曲线。依据洗脱峰位置，确定不一样大小蛋白质所在试管，深入用电泳伎俩判定目标蛋白,5、交换剂再生：,酸碱酸处理,碱酸碱处理,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第50页,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第51页,凝胶层析,凝胶层析又称为,凝胶过滤,，,分子排阻层析,，,分子筛层析,等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分相对分子质量不一样而到达物质分离一个层析技术,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第52页,凝胶层析基本原理,凝胶层析柱中装有,多孔凝胶,，当含有各种组分混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质因为分子直径大，不能进入凝胶微孔，只能分布于凝胶颗粒间隙中，以较快速度流过凝胶柱。较小分子能进入凝胶微孔内，不停地进出于一个个颗粒微孔内外，这就使,小分子物质向下移动速度比大分子速度慢，,从而使混合溶液中各组分按照,相对分子质量由大到小次序,先后流出层析柱,，,而到达分离目标,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第53页,为了定量地衡量混合液中各组分流出次序，经常采取,分配系数,Ka,来量度,Ve,洗脱体积，表示某一组分从加进层析柱到最高峰出现时，所需洗脱液体积；,Vo,外体积，即为层析柱内凝胶颗粒空隙之间体积,V,I,内体积，即为层析柱内凝胶颗粒内部微孔体积,Ka,Ve-V,0,V,I,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第54页,假如某组分分配系数,Ka=0,，即,Ve=Vo,，说明该组分完全不能进入凝胶微孔，洗脱是最先流出；,假如某组分分配系数,Ka=1,，即,Ve=Vo+V,I,，说明该组分能够自由地扩散进入到凝胶颗粒内部全部微孔，洗脱是最终流出；,假如某组分分配系数Ka在01，说明该组分分子大小介乎大分子和小分子之间，能够进入凝胶微孔，不过扩散速度较慢，洗脱时按照Ka值由小到大次序先后流出。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第55页,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第56页,在凝胶对组分没有吸附作用情况下，且,Ve=Vo+VI，,全部组分都应该被洗脱出来，Ka最大值为1,当Ka大于1时，说明此层析不是单纯凝胶层析，还存在吸附层析或离子交换层析,对同一类型化合物，凝胶层析洗脱特征与组分相对分子量呈函数关系，洗脱时组分按相对分子质量由大到小次序先后流出。,Ve=K,1,-,K,2,lgM,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第57页,在实际应用中，常以相对洗脱体积Kav对lgM作曲线,，,称为,选择曲线,相对洗脱体积,是指组分洗脱体积与层析柱内凝胶床总体积之比值,KavVe/Vt,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第58页,lgM,K,av,3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0,0,1.0,0.5,选择曲线斜率说明凝胶特征。每一类型化合物都有其各自特定选择曲线。如此图所表示，,能够经过凝胶层析测定物质相对分子质量,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第59页,凝胶选择与处理,惯用凝胶材料主要有,葡聚糖凝胶、琼脂凝胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶,，层析用微孔凝胶是由凝胶材料与交联剂交联聚合而成，交联剂有环氧氯丙烷,选择凝胶主要是依据欲分离组分分子质量大小。凝胶颗粒直径大小对层析柱内溶液流速有一定影响，应选择大小比较均匀商品凝胶，使用前需将凝胶于洗脱液中充分溶胀。溶胀通常采取热水溶胀（23小时），这么也到达消毒和排出凝胶内气泡目标,溶胀后凝胶用倾泻法除去小颗粒，经减压排气即可装柱,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第60页,凝胶层析操作过程,凝胶层析操作普通包含装柱、上柱、洗脱等过程,装柱,：柱内先充满洗脱剂，然后一边搅拌一边迟缓而连续地加入浓稠凝胶悬浮液，让其自然沉降，分布均匀无气泡和裂缝，直至所需高度。装好后洗脱液浸没凝胶表面。,上柱,：在洗脱液液面恰好与凝胶床表面相平时加入混合液。混合液体积通常为凝胶床体积10%左右，浓度可高些，黏度应低。,洗脱,：,洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时使用一致，,体积普通为凝胶床体积120%，洗脱流出液分步搜集。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第61页,凝胶层析操作过程,（详见蛋白质工程p213）,洗脱完成后，凝胶柱已经恢复酶液上样前状态，,不需再生,处理就能够重复进行下一批分离纯化。假如使用次数较多，或要纯化不一样品时，用23倍柱体积非离子去污剂除去吸附在凝胶中杂质，或卸下凝胶，用0.2mol/L NaOH浸泡，再水洗。然后加入20%乙醇或0.04%NaN3在48长久保留,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第62页,亲和层析,亲和层析是利用生物分子与配基之间所含有,专一而又可逆,亲和力，而使生物分子分离纯化技术,。,酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗体、酶RNA与互补RNA分子或片段、RNA与互补DNA分子或片段等之间,，都是含有专一而又可逆亲和力生物分子对。故此,亲和层析在酶分离纯化中有主要应用,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第63页,亲和层析技术特点是,选择性很高,，,可降低提纯步骤,在亲和层析中,作为固定相一方称为,配基,(Ligand)，,配基必须偶联于不溶性母体,(Matrix)上，母体又称为载体或担体。普通采取琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素作母体,当小分子物质(金属离子等无机辅助因子、有机辅助因子等)作为配基时，因为空间位阻作用，难以与配正确大分子亲和吻合，需要在母体与配基之间引入适当长度,连接臂,（space arm）,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第64页,要使不溶性母体与配基偶联或经过连接臂与配基偶联，都必须进行,母体活化,。即经过某种方法，如溴化氰法、叠氮法、高碘酸氧化法、环氧化法、甲苯磺酰氯法、双功效试剂法等，使母体引入某种活泼基团，才能以共价键与配基偶联,因为亲和结合专一性强，,洗脱条件要求高,。在亲和层析过程中，应控制好,温度,（010）、,pH,等条件，以免酶变性失活，亲和层析剂免遭破坏。亲和介质昂贵，处理量不大，制备时只是在纯化后期使用,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第65页,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第66页,亲和层析四个要素,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第67页,惯用亲和介质及专一性配体,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第68页,依据欲分离组分与配基结合特征,亲和层析能够分为：,共价亲和层析,疏水层析(,要区分疏水层析与反相层析,),金属离子亲和层析,（试验方法见蛋白质工程p218）,免疫亲和层析,染料亲和层析,凝集素亲和层析,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第69页,金属离子亲和层析,金属离子亲和层析是利用蛋白类酶和其它蛋白表面组氨酸咪唑基团、半胱氨酸巯基基团、色氨酸吲哚基团可与金属离子发生可逆性亲和结合特征，用螯合在母体上金属离子对混合液中目标蛋白进行纯化。,要将酶或蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，,可改变盐浓度或pH,（降低金属离子和蛋白质间亲和常数），或采取,竞争性试剂,将蛋白置换下来，可采取分级洗脱或梯度洗脱方式,金属离子亲和层析主要优点是可用不一样金属离子结合到螯合载体上，实现,母体再生,。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第70页,层析聚焦,将酶等两性物质等电点特征与离子交换层析结合在一起，实现组分分离层析技术,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第71页,5、电泳分离,带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反电极移动过程称为电泳。,颗粒在电场中移动速度主要决定于其,本身所带净电荷量,，同时受颗粒形状和颗粒大小影响。另外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体特征等外界条件影响,。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第72页,纸电泳,自由电泳,薄层电泳,凝胶电泳,薄膜电泳,等电聚焦电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖电泳,连续凝胶电泳,梯度凝胶电泳,不连续凝胶电泳,SDS-凝胶电泳,电泳,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第73页,制备式电泳通常以不含 SDS 原态 disc-PAGE 进行，方便回收含有活性蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，不然效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶位置。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第74页,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第75页,电极缓冲液应依据欲分离组分而定。,一个为阴离子电泳系统，缓冲液pH为89，上槽接负极，下槽接正极，用溴酚蓝为指示剂，适合用于普通蛋白质和核酸分离；,一个为阳离子电泳系统，缓冲液pH为4左右，上槽接正极，下槽接负极，用亚甲基绿为指示剂，适合用于碱性蛋白质电泳分离,电泳试验方法主要要求看SDSPAGE和双向电泳（详见蛋白质工程p220-223）,凝胶层析详见蛋白质工程p213,金属离子亲和层析见蛋白质工程,p218,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第76页,高效液相色谱（HPLC）,高效液相色谱，将常规层析介质制备成特殊高效液相色谱柱，它使用基质珠更小，孔径更均一，基质填充比常规层析柱更致密，所以能够耐受更大压力，采取更加快洗脱速度，含有更高分辨率和重复性。,高效液相色谱依据凝胶介质分离原理不一样，又可分为高效凝胶过滤色谱、高效离子交换色谱、高效疏水色谱、高效亲和色谱,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第77页,6、萃取分离,萃取分离是利用,物质在两相中溶解度不一样,而使其分离技术。萃取分离中两相普通为互不相溶两个液相。有时也可采取其它流体。,按照两相组成不一样，萃取能够分为：,有机溶剂萃取,双水相萃取,超临界萃取,反胶束萃取,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第78页,有机溶剂萃取,在酶萃取过程中，有机溶剂要预冷至010，萃取过程在010低温条件下进行，并尽可能缩短酶与有机溶剂接触时间,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第79页,双水相萃取,双水相系统普通是指将两种亲水性聚合物都加在水溶液中，当超出某一浓度时，产生两相，两种聚合物分别溶于互不相溶两相中（每种聚合物在上下相中分配比率不一样）,成相是因为聚合物分子空间妨碍作用，无法相互渗透，不能形成均一相，从而含有相分离倾向。,双水相形成条件和定量关系可用相图表示，对于两种聚合物和水相组成系统，其相图如图4-8所表示。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第80页,各种双水相系统,聚合物P,聚合物Q或盐,聚丙二醇,甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖,聚乙二醇,聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖,甲基纤维素,羟甲基葡聚糖，葡聚糖,乙基羟乙基纤维素,葡聚糖,羟丙基葡聚糖,葡聚糖,聚蔗糖,葡聚糖,聚乙二醇,硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第81页,图47 双水相系统相图,在双节线TCB下方区域是单相区，上方是双相区。T点和B点分别表示到达平衡时上相组成和下相组成，在同一直线上各点分成两相，含有相同组成，但体积比不一样,当系线TMB下移，长度减小，两相之间差异逐步减小，到达临界点C点时，系线长度为零，到达均相。,聚合物P%,B,T,B,C,T,聚合物Q或盐%,M,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第82页,双节线位置和形状与聚合物分子质量相关，聚合物分子质量越高，相分离所需浓度越低。,在高分子聚合物上引入亲和配基，能够进行双水相亲和萃取,双水相萃取不足：,分离后酶液浓度低,高分子聚合物在分离后需要分离除去,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第83页,超临界萃取,超临界萃取,又称超临界流体萃取，是利用,欲分离物质与杂质在超临界流体中溶解度不一样,而到达分离一个萃取技术,在相同压力和温度条件下，同一物质液相和气相物理特征是截然不一样。当温度和压力到达某一特定数值时，气体和液体物理特征就会趋于相同，这个数值称为,超临界点,。,当温度和压力超出其超临界点时，两相变为一相，这种状态下流体称为,超临界流体,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第84页,p,T,G,L,S,SCF,图4-8 超临界系统相,超临界流体显著特点：,其,物理特征和传质特征,介于液体和气体之间，适于作萃取溶剂；,其含有和液体一样溶解能力，含有,很高萃取速度,；,随温度和压力改变，其,对物质萃取含有选择性，萃取后易分离,；,其黏度靠近于气体黏度，,利于物质扩散,；,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第85页,作为萃取剂超临界流体必须具备以下条件,：,具备良好化学稳定性，对设备没腐蚀性；,临界温度不能太高或太低，最好在室温或操作温度附近；,操作温度应低于被萃取溶质分解温度；,临界压力不能太高，节约压缩动力；,选择性要好，轻易制得高纯度制品；,溶解度要高，可降低溶剂循环量；,萃取剂要轻易取得，价格廉价,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第86页,CO2超临界萃取工艺工程由萃取和分离两个步骤组成，按分离方法不一样，分离工艺过程分为：,等压分离：压力相同，温度升高，溶质在CO2中溶解度降低而分离析出分离,等温分离：温度相同，压力下降，溶质在CO2中溶解度降低而分离析出,吸附分离：温度压力不变，分离罐中吸附剂吸附溶质而分离溶质,在超临界流体萃取中，为提升分离效果，在超临界流体中添加少许另一溶剂，称为,夹带剂,，如水、乙醇、丙酮。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第87页,一些超临界流体超临界点和超临界密度,流体名称,临界温度(),临界压力,(Mpa),临界密度,（g/ml）,乙烷C,2,H,6,32.3,4.88,0.203,丙烷C,3,H,8,96.9,4.26,0.220,丁烷C,4,H,10,152.0,3.80,0.228,戊烷C,5,H,12,296.7,3.28,0.232,乙烯C,2,H,4,9.9,5.12,0.227,氨NH,3,132.4,11.28,0.236,二氧化碳 CO,2,31.1,7.38,0.46,二氧化硫 SO,2,157.6,7.88,0.525,水H,2,O,374.3,22.11,0.326,笑气N,2,O,36.5,7.17,0.451,氟里昂C,28.8,3.90,0.578,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第88页,反胶束萃取,反胶束萃取是利用反胶束将酶或蛋白从混合液中萃取出来一个分离纯化技术，更含有选择性。,反胶束是超出临界胶束浓度表面活性剂分散于连续有机相中形成纳米尺度一个聚集体。,反胶束中，表面活性剂非极性基团在外，与非极性有机溶剂接触，而极性基团排列在内，形成一个极性核，极性核含有溶解极性物质能力，极性核溶解水后，形成水池。当含有此种反胶束有机溶剂与蛋白质水溶液接触后，蛋白质及其它亲水物质能够进入此水池中，酶不会造成失活。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第89页,反胶束萃取中，首先要选择适宜表面活性剂（惯用阴离子表面活性剂AOT）和有机溶剂,另外，反胶束萃取还受以下原因影响：,（1）水相pH,：对于带正电荷表面活性剂，水相pH高于蛋白质等电点（带负电）时，有利于蛋白质溶于反胶束中，对于阴离子表面活性剂则相反,（2）离子强度,：水相中离子强度决定带电表面所赋予静电屏蔽程度：降低表面活性剂头部基团间静电斥力，造成反胶束颗粒变小；降低了带电蛋白质分子和反胶束带电界面间静电相互作用,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第90页,3.5 酶组合分离纯化策略,Resolution（分辨率）,Speed,Capacity（容量）,Recovery（回收率）,设计分离纯化工艺基本要求,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第91页,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第92页,3.6 酶浓缩、干燥与结晶,浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离过程。在酶分离纯化过程中是一个主要步骤。,离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也能够到达浓缩效果。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第93页,蒸发浓缩是经过加热或者减压方法使溶液中部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩过程。因为酶在高温条件下不稳定，轻易变性失活，故酶液浓缩通常采取,真空浓缩,即在一定真空条件下，使酶液在60以下进行浓缩,。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第94页,在固体酶制剂生产过程中，为了提升酶稳定性，便于保留、运输和使用，普通都必须进行干燥。惯用干燥方法有：,真空干燥：边抽真空边加热，,温度控制在60摄氏度以下酶液蒸发干燥,冷冻干燥：,固态冰在低温真空下直接升华为气体,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第95页,喷雾干燥：,酶液喷成小雾滴，分散于热气流中，水分在几秒钟内蒸发，雾滴周围空气温度较低，得到干燥酶制剂。要控制好气流进口温度,气流干燥：,热气流直接与固体或半固态物料接触使物料水分蒸发得以干燥。干燥时间长，酶活力损失大，要控制气流温度、速度和流向，同时要经常翻动物料，使之干燥均匀,吸附干燥：,密闭容器中用各种干燥剂吸收物料中水分到达干燥目标，如硅胶、无水氯化钙、无水硫酸钙等等,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第96页,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第97页,结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出过程。酶结晶是酶分离纯化一个伎俩。它不但为酶结构与功效等研究提供了适宜样品，而且为较高纯度酶取得和应用创造了条件,酶在结晶之前，,酶液必须经过纯化到达一定纯度,。假如酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶纯度应该在50%以上，方能进行结晶。总趋势是酶纯度越高，越轻易进行结晶。,蛋白类酶的分离纯化专家讲座,第98页,