GB∕T 40140-2021 葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 40140-2021 葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法Detection and identification of grape spike-stalk brown spot 2021-05-21发布国家市场监督管理总局申+国家标准化管理委员会保W2021-12-01实施GB/T 40140-2021 目IJ1=1 本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波海关。本文件主要起草人:吴品珊、段维军、雷荣、徐晗。I 葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法1 范围本文件规定了葡萄轴枯病菌的分离培养、形态学鉴定、分子生物学鉴定方法。本文件适用于葡萄上葡萄轴枯病菌的检疫和鉴定。2 规范性引用文件本文件没有规范性引用文件o3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 葡萄轴枯病菌的分类信息中文名:葡萄轴枯病菌英文名:grape spike-stalk brown spot 病原学名及中文名:Alternariaalternata (Fr.) Keissler，链格子包GB/T 40140-2021 异名:Alternariaaltenta var. rosicola V. G. Rao、AlternriajscicuLata (Cooke &. Ellis) L. R. J ones &. Grout 、Alternariarugosa McAlpine、Alterariatenuis N ees、Alteriatenu口f.chalaroidesSacc.、Alterariatenuis f. geuina Unamuno、Alternariatenuis f. trichosnthis D. Sacc.、Alternrzatenuis var. mali Marchal &. . Marchal、Macro吵oriumfasiculatum Cooke &. Ellis 、To门alternata Fr. 分类地位:真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，座囊菌纲Dothideomycetes，格抱腔菌目Pleosporales，格抱腔菌科Pleosporaceae0 葡萄轴枯病菌的其他信息见附录A。5 方法原理依据病害症状、分离菌的形态特征和分子生物学特性，根据该真菌DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大小或扩增曲线的变化，对病菌进行综合检疫鉴定。6 试剂、材料和培养基6.1 试剂和材料除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂。试剂包括:次氯酸纳溶液(活性氯10%)、琼脂粉、葡萄糖、琼脂糖、无菌双蒸水、CTAB提取缓冲液、Tris饱和盼、三氯甲皖、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、RNaseA、液氮、苯盼、氯仿、蛋白酶K、TaqDNAGB/T 40140-2021 聚合酶、dNTP、TqMan Master Mix，核酸染料、DNA分子质量标准物等。材料包括:植物基因组提取试剂盒、普通PCR反应试剂盒、TaqMan荧光PCR反应试剂盒、50X TAE电泳缓冲液。6.2 培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯胡萝卡琼脂培养基(PCA)，具体配方的信息见附录B。7 仪器和用具7.1 仪器生物显微镜(放大倍数400倍以上)、体视显微镜、二次纯水仪、光照培养箱、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、离心机、PCR仪、实时荧光PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、电子天平(感量0.01g)、冰箱。7.2 用具可调移液器(2.5L、1)L、20L、100t-tL、1000L)，吸头，离心管，Eppendorf管(0.2mL、0.5mL、1.5mL)，塑料研样，液氮罐。8 检疫鉴定方法8.1 症状检查与病害症状观察葡萄果穗分枝穗轴部位是否有变褐干枯，果粒是否失水萎焉，表皮是否有褐斑或霉状物。病害症状主要在幼穗的分枝穗轴上，初期有褐色水浸状斑点，后向主穗轴扩展形成褐色病斑，穗轴变褐坏死，不久失水干枯，花穗易在分枝处折断，严重时，整个穗轴及其果柄全部变褐坏死，花蕾或花几乎全部落光。幼小果粒发病表皮上有圆形深褐色小斑，果粒膨大，病斑表面皇疮咖状，病册脱落，果穗也萎缩干枯。温度大时病斑上可见黑色霉层，即病菌菌丝、分生于包子梗、分生于包子链和分生于包子。病害症状见图A.1。8.2 分离培养将葡萄穗轴用流水冲洗干净，在穗轴的病健交界处切取0.5cml.O cm左右的小段，用1%次氯酸铀消毒5min，无菌水冲洗3次，置于灭菌滤纸上吸去表面水分，放置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基CPDA)或带三层无菌湿滤纸的培养皿上，在25oc下，两支40W灯管(色温4200 K)l2 h光照、12h黑暗交替培养3d4 d，灯管距离培养物约40cm。有疑似菌落的培养皿置于体视显微镜50X下观察，用解剖针挑取具有典型产抱结构的单根子包子链上的单个子包子，转接于马铃薯胡萝卡琼脂培养基(PCA)上，在22oc下，两支40W灯管(色温4200 K) 8 h照射和16h黑暗交替进行培养，灯管距离培养物约40cm，培养物面向上，1周后观察。8.3 形态学鉴定8.3.1 培养物观察与测量将上述培养物在体视显微镜50X下观察分生抱于梗产生的分生于包子和分生于包子链的特征(产抱表型)，显微镜下测量分生J包子大小包括长、宽、嗦长、横纵(斜)隔膜数，于包子颜色，袍子表面有无突起等，测量分生于包子和暖胞的大小各30个。2 GB/T 40140-2021 8.3.2 病菌形态学特征葡萄轴枯病菌菌落深灰色至暗青褐色，菌丝密集，褐色，分隔，多分枝。分生于包子梗单生或簇生，直立或弯曲，有分隔，在其上部形成具短分枝的分生于包子链。分生于包子单生或短链生，近椭圆形、卵形或倒棍棒状，呈淡褐色至暗褐色，表面光滑或具微刺;成熟时具2个8个横隔膜，1个4个纵、斜隔膜;分生子包子一般2个8个串生在一起，单生较少，大小07.5m40.0m)X(5.0m12.5m)，平均26.5mX9.1m，短l撮圆柱形或锥形，褐色，大小(2.5m12.5m)X (2.5m5.0m)，部分转变为产抱细胞，可二次分枝或产血。形态图见附录A中A.4。8.4 分子生物学鉴定8.4.1 DNA提取将分离的疑似病菌收集，放入漫在液氮型的1.5mL离心管中，用一次性塑料样碾碎，按照C丁AB法或植物基因组提取试剂盒提取DNAoDNA提取方法按照附录C操作。8.4.2 常规PCR检测采用特异性引物AaltFor/AaltRev，按照附录D进行常规PCR检测。8.4.3 实时荧光PCR检测采用实时荧光PCR特异性引物OPAF/R和TaqMan探针OPAP，按照附录E进行实时荧光PCR检测。9 结果判定病害症状和分离物的形态特征与8.1和8.3描述的一致，且常规PCR特异性引物扩增结果符合附录D为阳性或实时荧光PCR检测结果符合附录E为阳性，可判定为检出葡萄轴枯病菌。10 样品和档案保存10.1 样品保存与处理样品经登记和经于人签字后妥善保存。检出葡萄轴枯病的样品经登记签字，保存于4oc冰箱中，至少保存6个月以备复核，保存期满后应经高压灭菌后方可处理。对不需要长期保存的染病材料应及时高压灭菌处理。10.2 结果记录与资料保存完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。GB/T 40140-2021 A.1 危害情况附录A(资料性)葡萄轴枯病的其他信息葡萄轴枯病也叫葡萄穗轴褐枯病，发病一般在开花前后。主要危害葡萄幼嫩的穗辅，使穗轴变褐枯死，危害严重。传播途径:病菌以分生抱子在葡萄枝蔓表皮以及在病残体越冬，为翌年初侵染来源。葡萄开花前至开花期为病菌的主要侵染时期，以分生于包子通过伤口或自然孔口侵入幼穗穗轴的表皮组织。病菌近距离传播主要靠染病穗轴上的分生抱子和农事操作，远距离传播主要靠葡萄贸易o葡萄轴枯病在我国一些葡萄产区有分布，多雨或空气湿度大的地区和年份发生较多。严重时，发病穗率可达20%40%，导致减产10%30%，严重的减产40%以上。该病害是新西兰和澳大利亚进口中国鲜食葡萄上关注的有害生物。A.2 病原菌情况引起葡萄轴枯病的致病病原菌一直存有争议，最早国内认为葡生交链子包菌(Alternariavitic叫a)是致病菌，国外研究认为是由链格子包菌CAlternriaalternata)引起。近年经广泛搜集资料和采集样本，发现引起国内葡萄轴枯病的致病菌非以往报道的葡生交链子包菌CAlternaria viticola) ，而主要是链格抱菌CALternria aLternata)。A.3 病害症状葡萄轴枯病菌病害症状见图A.lo图A.1葡萄轴枯病菌病害症状A.4 病菌形态特征葡萄轴枯病菌分生抱子链和分生于包子见图A.2。4 GB/T 40140-2021 a) 分生袍子链b) 分生于包子注:引自WoudenbergJ. H.C.等，20130图A.2葡萄轴枯病菌分生于包子链和分生于包子(图中标尺为10m)GB/ T 40140-2021 B.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基CPDA)附录B(资料性)培养基配制方法称取去皮马铃薯200g，切片，加适量蒸馆水煮沸20min左右，双层纱布过滤，在滤液中加入葡萄糖20 g，琼脂粉17g，加蒸馆水补足至1000 mL, 121 oc高压灭菌20min。B.2 马铃薯胡萝卡琼脂培养基CPCA)称取去皮马铃薯20 g，胡萝卡20g，切片，加适量蒸馆水煮沸20min左右，双层纱布过滤，在滤液中加人琼脂粉17g，加蒸馆水补足至1000 mL, 121 oc高压灭菌20min。6 C.1 i式剂附录C(规范性)DNA提取C.1.1 十六皖基三甲基滇化服(CTAB)DNA提取缓冲液GB/T 40140-2021 十六烧基三甲基澳化胶(CTAB)4g，乙二胶四乙酸二饷(Na2EDTA.2H20,0.5 mol/L)8 mL，氧化纳(NaCl)16.4 g, 1 mol/L三起基甲基氨基甲:境盐酸(Tris-HCl)20mL，琉基乙醇(C2H60S)4mL, 加蒸馆水定容至200mL，调pH至8.0，121oc高压灭菌30min C.1.2 蛋白沉淀;在蛋白沉淀液由Tris饱和国分:三氯甲:皖:异戊醇三种溶液以2524 : 1的体积比进行配制，置于4 oc保存。C.2 DNA提取步骤挑取菌丝约0.1g，用灭菌滤纸吸干水分，放人1.5mL漫在液氮里的离心管中，用塑料样碾碎待用o或将病组织0.1g0.2 g，在灭菌研钵中，加入液氮研磨后，放入1.5mL离心管中，待用。离心管中加人300f-1L500L CTAB DNA提取缓冲液和0.1g蛋白酶K，昆匀，65oc水浴1h, 12 000 r/min离心5min，保留上清液。取上清液于1.5mL离心管中，加500L的Tris饱和盼:三氯甲:皖:异戊醇(体积比为25: 24 : 1)混匀，12000 r/min离心5min。再取上清液于1.5mL离心管中，加500L的Tris饱和酣:三氯 甲皖:异戊醇(体积比为25: 24 : 1) 轻摇混匀，12000 r/mi口离心5min。取上清液，加人1mL异丙醇混匀，-70oc下放置1h，或20 oc过夜;12 000 r/min离心30min, 可见DNA沉淀。弃去上清液，70%乙醇洗DNA沉淀2次，室温干燥后，用30L50LTris-EDTA缓冲液溶解DNA，待用。用微量分光光度计测量DNA浓度，A260/ A280比值应接近1.8。注:或者按照等效DNA提取试剂盒进行操作。7 GB/T 40140-2021 附录D (规范性)常规PCR检测方法D.1 引物序列引物系列见表D.1。表D.1PCR引物序列引物名称引物序列(5-3)扩增片段长度AaltFor GTGCCTTCCCCCAAGGTCTCCG 184 bp AaltRev CGGAAACGAGGTGGTTCAGGTC D.2 PCR :j:ti曾0.2 mL PCR管中，包含2X TaqPCR Master Mix 12.5L.引物各1.0L(10mol/U.DNA模板2L (20 ng/U ,ddHzO 8.5L。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应条件为940C3 min;94 oC 30 s,72 oC 60 s，35个循环;720C5 min.4 oC保存。D.3 琼脂糖;疑胶电泳检测在1X丁AE电泳缓冲液中，2%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm，0.5%核酸染料染色20min，凝胶成像仪分析结果。D.4 结果判定如果阳性对照及检测样品出现约184怜的条带，阴性对照和空白对照未出现特异性条带，可判定样品为葡萄轴枯病菌阳性。如果阳性对照出现约184bp的条带，检测样品、阴性对照和空白对照未出现特异性条带，可判定样品为葡萄轴枯病菌阴性。8 E.1 冒|物和探针序列引物和探针序列见表E.L引物和探针附录E(规范性)实时荧光PCR检测方法表E.1实时荧光PCR引物序列和探针引物序歹IJ(5-3)GB/T 40140-2021 。PAFTCACTACAGACCAAATCCCTT OPAR CCTACATCTCAAATGCCAAA OPAP TATCTTCTCACGTCGGGCCCCTGA E.2 实时荧光PCR反应体系反应体系为:0. 2 mL离心管中加入2X TaqMan Universal PCR Master Mix 10L，OPAF (10 fLmol/L)、OPARClotmol/L)各0.5L，探针。PAP(10mol/L)0.5L，DNA模板2L，补水至20L。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。将反应体系混合均匀后置于荧光PCR仪中进行反应。反应程序:950C10 min;94 oC 15 s,60 oC 60 s，共40个循环。注PCR反应体系中各试剂的量可根据具体情况进行适当调整，也可采用 等效试剂盒。E.3 结果判定在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值30并出现典型扩增曲线的条件下:待测样品的Ct值35时，判定葡萄轴枯病菌阳性;待测样品的Ct值二三 40时，判定葡萄轴枯病菌阴性;待测样品的35Ct值40时，重新测试;增加DNA用量210倍再次测试，待测样品出现典型扩增曲线，且Ct值35，判定为阳性;否则判定为阴性oGB/T 40140-2021 参考文献 l J 马俊义，朱晓华，赵林忠，梅岩，由自提古丽，阿曼古丽，朱瑞荣，王勇.葡萄穗轴褐枯病初步研究.新疆农业科学，2004，41(5):353-354.2J 王凤军，张祥林，马海波，冯新忠，冯俊丽，华鹏.实时荧光PCR检测香梨黑斑病菌.食品科学，2013,34(20):170-173. 3J 杨超，张国丽，任毓忠，钟杨琼，高祥雷，李卓，张亚平，李国英.北疆沿天山北坡一带葡萄穗轴褐枯病病原菌的鉴定.植物保护，2017，43(3):129-135.4J 张秋娥，段胜男，严进.葡萄穗轴褐枯病研究进展.安徽农业科学，2014，42(4):1006，1008.5J Baslm E., Baslm H., Abdulai M., Baki 丑，OztrkN.ldentification and characterization of Alternaria alternta causing leaf spot of olive tree (Oleaeuroea) in Turkey J. 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