基因工程菌的稳定性教学教程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五节 基因工程菌的稳定性,基因工程菌在传代过程中常,出现质粒不稳定的现象。,质粒不稳定可分为：,分裂不稳定,结构不稳定,分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一 定比例不含质粒子代菌的现象。,结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变,一、质粒不稳定产生的原因,常见分裂不稳定的两个因素：,含质粒菌产生不含质粒子代菌的,频率；,这两种菌比数率差异的大小。,对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：,低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；,高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。,菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。,生长数率,/h,0.2,0.4,质粒拷贝数,1,0.5,10,950,40,0,-,半乳糖苷酶工程菌的连续养,3,质粒稳定性的分析方法,样品,不含抗性标记抗生素,平 板 培 养基,10-12h,100,个菌落,含抗性标记抗生素,平 板 培 养 基,10-12h,统计生长菌落数,重复三次,计算比值,(,稳定性,stability),二、提高质粒稳定性的方法,为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法：,先使菌体生长至一定密度；,再诱导外源基因的表达,由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。,在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。,调控环境参数如温度、,pH,、培养基组分和溶解氧浓度,有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。,第六节 基因工程菌生长代谢的特点,菌体的生长通常用比生长速率来表示。,工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。,控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。,大肠杆菌的蛋白,/,菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。,培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的和成和菌体的生长。,一、菌体的生长与能量的关系,碳源物质是组成培养基的主要成分。,碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的,pH,值下降，从而影响菌体的生长。适当提高,pH,，可减少乙酸的抑制作用,分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。,加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。,大肠杆菌中克隆携带氧能力的,VHB,蛋白的基因可提高菌体生长速率。,采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。,二、菌体生长与前体供应的关系,在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。,基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低。,质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（,56,拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。,高拷贝质粒的工程菌（,240,拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。,“严紧反应”是当氨酰,tRNA,不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的,ppGpp,的结果。,ppGpp,是一个重要的调控分子。它通过影响,RNA,链的延深过程减少转录。,它的浓度增加会导致在合成,mRNA,和,rRNA,时,RNA,聚合酶在模板上的移动产生停顿，,RNA,链延长速度减慢，使游离的,RNA,聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如,rrnA,等的转录减少。,也可能,ppGpp,是通过干扰,RNA,聚合酶与,PL,启动子专一识别反应。,第七节基因工程菌发酵,基因工程菌的培养过程包括,:,通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件,如温度、,pH,、培养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响,;,通过培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。,菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养,扩大培养,原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离,基配制,微生物工业发酵过程简图,一、基因工程菌的培养方式,基因工程菌的培养方式：,补料分批培养、,连续培养、,透析培养、,固定化培养。,补料分批培养,补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。,二、基因工程菌的发酵工艺,基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同,基因工程菌带外源基因,发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。,工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有：,培养基的影响,接种量的影响,温度的影响,溶解氧的影响,诱导时机的影响,pH,的影响,培养基的影响,培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。,不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖对,lac,启动子有阻遏作用。乳糖对,lac,启动子有利,。,在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对,trp,启动子控制的基因有影响。,无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。,接种量的影响,接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。,接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。,接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。,接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。,接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长,。,温度的影响,温毒对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。,温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。,适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。,温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。,溶解氧的影响,对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。,好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。,若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。,发酵时，随,DO,2,浓度的下降，细胞生长减慢，,ST,值下降，发酵后期下降幅度更大。,外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。,维持较高的,DO,2,值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。,采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。,诱导时机的影响,对于,P,L,启动子型的工程菌，使用,cI,阻遏蛋白的温度敏感型突变株（,clts857,），在,28,30,0,C,下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏,P,L,启动子的转录；,当,温度,升高,42,0,C,时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目的基因的表达效率。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。,在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到,10,9,/,个为止，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，,营养和氧,成了菌群旺盛代谢的限制因素。,pH,的影响,pH,对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对,pH,进行适当的调节。,如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳,pH,在,6.8,7.4,左右,;,培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其最佳,pH,为,6.0,6.5,。,总之,最佳化的工艺是获得,:,最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。,三、基因工程菌的培养设备,应用发酵罐大规模培养基因工程菌。它不同于微生物发酵，微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标，而基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。,发酵罐的组成有：,发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。,对发酵罐要求：,提供菌体生长最适生长条件，,培养过程不得污染，,保证纯菌培养，,培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等,。,