基因工程技术-PPT.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程技术,Jackson,Symons,and Berg(1972),generated first,recombinant DNA molecules,Cohen and Boyer(1973),produced first plasmid vector capable of,being replicated within a bacterial host,vectors carriers of foreign DNA,The Nobel Prize in Chemistry 1980,定义：,基因工程（,gene engineering,）,重组,DNA,技术（,recombinant DNA technique,）：是指在各种酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组,DNA,分子，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为,“,克隆,”,）和 表达，这种有目的的应用分子克隆技术,人为的改造基因,改变生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程,基因克隆,(gene cloning),：,是指目的基因与载体,DNA,连接构成的,DNA,重组体在受体细胞内进行复制、扩增的技术。,基因表达,(gene expression),：,是指目的基因在受体细胞内表达，研究功能。,应用：,克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。,转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽产品。,转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调控机制等,基因工程基本步骤：,分、切 目的基因,+,载体分子,转 导入到合适的受体细胞（转化）,接 构成重组,DNA,分子,筛 筛选含有重组分子的克隆,鉴 鉴定重组分子片段,基因工程流程示意图,构建重组分子（连接）,原料,：,目的基因：,研究对象,载体：,目的基因的运载工具,工具酶：,连接酶、限制性内切酶,目的基因片段来源：,基因组,DNA,PCR,方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它表达或克隆构建或从商品化的,cDNA,文库扩增）,通过,RT-PCR,方法得到目的基因,cDNA,人工合成基因片段（价钱昂贵）,目的基因来源选择：,取决于解决什么问题？,基因功能研究,cDNA,RT-PCR,基因表达调控的研究,基因组,DNA,PCR,PCR,：,引入合适的酶切位点，一个,/,两个。,加保护碱基，,1-3,个。,加上想要的标签，如,Flag,Myc,His,HA,。,启始及终止密码子。,高保真聚合酶：,HF,Pfu,Probest,等。,片断的回收与纯化,载体：,载体,(Vector),是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。,种类：,按来源分：质粒载体,(plasmid vector),、噬菌体载体,(phage vector),、,柯氏质粒载体,(cosmid vector),、病毒载体,(virus vector).,按作用分：克隆载体,(cloning vector),、表达载体,(expression vector),、穿梭载体,(shuttle vector),克隆载体,(cloning vector),用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的,DNA,重组构建（,PBR322,）。,表达载体,(expression vector),使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体,DNA,导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译（,pCDNA3,）。,穿梭载体,(shuttIe vector),能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体,.,其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的,复制原点或酵母菌的自主复制序列（,ARS,），它即能在,原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用,于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移。,质粒载体,具有复制起始点，这是质粒自我增殖的必要条件。,具有较小的分子量，较高的拷贝数，是一个松弛型的质粒。,具有某种选择性标记以区别转化和非转化细胞。大多是一些抗菌素抗性基因，赋予受体细胞对某些抗生素的抗性，为转化子选择提供便利。（,Amp,r,；,Tet,r,）,具有若干限制性内切酶单一识别位点，便于外源基因插入。,是细菌染色体外能够自我复,制的双链环状,DNA,分子。,克隆载体,:,PBR322,特点：,分子量小，,4.3kb,，便于操作。,有两个抗性基因，便于转化子筛选。,有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，,7,种位于四环素选择标记上，,4,种位于,Amp,抗性基因上。外源基因的插入将破坏抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组和非重组分子。,松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停止时，它仍能继续复制。,TA,克隆,A,A,TOPO-TA,原核,His-tag:pQE,系列,(Qiagen),pET22(Novagen)GST-tag:pGEX,系列,(Pharmacia),表达载体：,带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件，如启 动子等，这些调控元件应与宿主细胞相适应。,pCDNA3,系列,(Invitrogen),，,真核表达载体：,大多是穿梭载体。,pFLAG-CMV,系列,(Sigma),Tet-On/Tet-Off Expression Systems,Tet-Off,pTet-splice(pTet-PTEN),pTet-TAK,PSVneo,DNA,分子的体外连接：方法,粘性末端：相同的粘性末端互相配对进行连接,两种情况：,（,a,）,目的基因和载体,用同一种限制酶切割后连接。载体,易自身环化。,用碱性磷酸酶,(,能除掉,DNA-5,端,P,基团，使,5,端带一,OH),处理载体，可防止载体自 环化。,（,b,）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶,切割后连接，可控制目的基因的插入方向,(,定向克隆,),。,碱性磷酸酶处理：,平头末端：,（,1,）增加连接酶的量（连接酶对平末端,DNA,的,Km,约高于粘性末端,DNA100,倍,（,2,）在末端加上一个人工接头，内含有一定的限制性内切酶位点，经酶切处理产生粘性末端，然后与载体连接。如加上一个人工接头内含,GAATTC,序列，用,EcoRI,酶切，产生,EcoRI,粘性末端。,Eco,R,Eco,R,Eco,R,加同聚物尾：,载体与片段没有共同的粘性末端时，可直接通过末端转移酶分别接上,poly,（,dA,）和,poly,（,dT,），然后退火，直接转化，分子间空缺部分可以在宿主体内修复。,同尾酶,(xho I;Sal I),其他方法：,Bgl,II,AGATCT,TCTAGA,BamH,I,GGATCC,CCTAGG,A GATCT,TCTAG A,G GATCC,CCTAG G,连接策略：,pCMV,选择连接位点：,（,1,）,HindIII,粘性末端 载体自身环化，四环素失活,方向不确定。,（,2,）,EcoRI-SalI-,定向，一般不会有载体自身环化，四环素失活,（,3,）,XbaI-SalI-,反向，不能进行表达。四环素失活,（,4,）目的基因片段：,Bgl II-SalI,，载体：,BamH I-SalI,反向，不能进行表达。四环素失活,（,5,）,Not I-,修平,SalI,一个粘性末端，一个平端,SmaI-,修平,-SalI,正向连接，四环素失活,PstI,？,SacI,？,连接浓度：,片段与载体连接机率自身环化,一般计算公式：,粘性末端：,载体片段含量（,ng,）,/,载体长度（,kb,）,1,DNA,片段含量（,ng,）,/DNA,片段长度（,kb,）,3-5,平末端,1,：,5-10,连接反应：,10ul,体系,H,2,O,Buffer,Vector,Insert,ligase,4/14,过夜,连接反应条件,连接酶的活性,;DNA,的纯度,载体与目的基因的比例,;PH,值,7.2-7.8,适宜,;14(,不高于,16),过夜,连接酶：两种,DNA,连接酶：,连接双链中两条,DNA,链之间形成磷酸二酯键，封闭双螺旋骨架缺口。需要一条,DNA,链的,3,-,末端具有游离的,OH,，另一条,DNA,链,5,-,末端的磷酸基团,-P,，吸能反应，需,ATP,存在。也可做,DNA,修复。但不能连接两条单链,DNA,分子和环化的单链,DNA,分子。而且只能连接粘性末端。,T4DNA,连接酶：,是从感染,T4,噬菌体的,E,coli,中分离得到的一种连接酶。粘性末端、平末端、平末端上加人工接头。用途比,DNA,连接酶广泛，是分子生物学研究及基因克隆中较常用的连接酶。,其他酶：末端修饰酶,末端脱氧核苷酸转移酶（,terminal deoxynucleotidyl transferase,）,简称末端转移酶。在合适的反应系统中，这种酶使,DNA,片段平末端的,3-OH,加上同聚核苷酸，产生具有,poly,（,A,）、或,poly,（,T,）、或,poly,（,G,）、或,poly,（,C,）的粘性末端。,碱性磷酸酶,根据,DNA,重组的需要，为防止两,DNA,片段末端之间连接，经常采用碱性磷酸酶处理，使,DNA,末端的,5-P,成为,5-OH,。目前采用的碱性磷酸酶有两种，即来源于大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（,BAP,）和来源于小牛肠的小牛肠碱性磷酸酶（,CIP,）。,CIP,的比活性比,BAP,高出,10,倍以上，而且对热敏感，便于加热使其失活。,重组子导入受体细胞：,把重组,DNA,导入受体细胞进行扩增,.,根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞（原核，真核）及选择适宜的转化或转染的方法。,受体细胞的要求：必须具备使外源,DNA,进行复制的能力（提供复制所需的原料）而且还应该能够表达由导入的重组体分子所提供的某种表型特征，这样才有利于转化子细胞的选择与鉴定。,重组子导入受体细胞：途径,转化：质粒,DNA,或以它为载体构建的重组子导入细菌（感受态菌）的过程,转染：噬菌体、病毒、或以它作为载体构建的重组子主动或被动被导入细胞的过程。,感染：以病毒为载体的重组子，在体外包装成具有感染力的病毒颗粒，通过感染受体细胞，然后整合到受体细胞基因组上。,转化,受体细胞：大肠杆菌，基因工程中最常用的宿主细胞,转化机理：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源,DNA,发生可遗传的改变。,转化效率：,只有很少比例的细胞有能力掺入质粒,DNA,转化时大约在,1000,个,DNA,分子中，只有一个,DNA,分子获得成功。一般每微克完整的,pBR322DNA,产生,10,5-,10,7,转化细胞,感受态菌制备,感受态：,细菌细胞处于一个容易吸收外源,DNA,状态，这种状态的细菌称为感受态菌。,氯化钙法,：,氯化镁法：,电转法：,氯化钙,法：原理,快速生长的细菌用低渗低浓,(50 100mM),的氯化钙（,CaCl,2,),处理，使细胞肿胀成球形,加入质粒后，即于细胞表面形成抗,DNAase,的羟基,-,磷酸钙复合物,经,42,热休克后，复合物被细胞吸收。,非选择性培养基上生长数小时，球状细胞复原开始增殖,抗生素基因表达。,重组子的筛选：,根据重组体,的表型筛选,抗性基因插入失活：生存或是毁灭？,互补现象：蓝白斑筛选,LacZ-,受体菌编码,半乳糖苷酶羧基端（,C,端）片断,载体编码,一半乳糖,苷酶氨基端（,N,端）的,肽,分解,X-gal,，蓝色克隆,不分解,X-gal,白色克隆,插入失活：,互补现象：蓝白斑筛选,42,90s,+900ul,LB,37 45min,Protocol:,3*1ml,菌液,沉淀,+0,.5mlCaCl2,6000rpm 5min,冰浴,30min,6000rpm 5min,沉淀,+0,.1mlCaCl2,+10ul,连接产物,+6ulPBR322,阴性对照,A+T,A+T,阳性对照,Amp,Tet,冰浴,30min,阳性克隆的鉴定：,挑菌落，小抽质粒，电泳,菌落,PCR,94,10 min,30s,40s,1min,72 ,8min,4,hold,X 30,碱裂解法,碱裂解法,原理：,pH,值介于,12.0-12.5,范围内，线形的,DNA,和环状的质粒,DNA,变性，中间的氢键短裂，线状,DNA,变性后互相分开，而环状分子双螺旋主链骨架彼此盘绕，互补两条链紧密合在一起。变性处理的质粒,DNA,和染色体,DNA,通过致冷或恢复中性,pH,，开始复性。环状分子由于本身合在一起，所以复性迅速而准确。线状,DNA,变性时彼此分开，复性慢而不准确，互相之间聚集形成较大的网状结构，离心后，与变性蛋白质和,RNA,一道沉淀下来，上清液中留存下的主要是环状,DNA,分子和少量的可溶性蛋白质和部分的,RNA,，这些可溶性蛋白质和部分的,RNA,可 通过苯酚抽提及,RNA,酶处理去除。,试剂作用：,溶液,I-,葡萄糖、,Tris.HCL,、,EDTA,。低渗，细胞变的脆弱而易于裂解，,EDTA,螯和金属离子，防止,DNA,降解。,溶液,II-NaOH,、,SDS,。,NaOH,使细胞裂解，释放出质粒,DNA,和染色体,DNA,。,溶液,III-,醋酸钾。降低反应,pH,值，起中和作用。,初步鉴定,后续：,测序确定插入序列与基因,bank,报告完全一致,检测外源基因有无整合宿主细胞？,检测外源基因转录水平表达？,检测外源基因蛋白水平表达？,