蛋白质与核酸相互作用的试验方法学研究.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,DNA-,蛋白质相互作用研究,实验,引言,1.,很多细胞的生命活动涉及到特定的,DNA,区段与特殊蛋白质,结合因子之间的相互作用：,DNA,的复制和重组；,mRNA,的转录和修饰；,病毒的感染与增殖等,2.,随着人类基因组测序工作的基本完成，,功能基因组学的研究显得尤为重要。而基因表达调控是,功能基因组学的一个重要研究领域。而要深入研究基因表,达调控的分子机制必须要研究,DNA,与蛋白质的相互作用。,3.,在重组,DNA,技术发展以来，已相继分离到大量的具有重要生,物学意义的基因。在这种情况下科学工作者开始把自己的研,究兴趣逐渐转向,DNA,结合蛋白这一课题上。,凝胶阻滞试验,DNaseI,足迹试验,甲基化干扰试验,体内足迹试验,酵母单杂交技术,染色质免疫沉淀技术,噬菌体展示技术,核酸适体技术,生物信息学方法,蛋白质芯片技术及纳米技术,一、凝胶阻滞试验（,DNA,迁移率变动试验,DNA mobility shift assay,）,1,原理：,在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的,DNA,朝正电,极移动的距离与其分子量的对数成反比。,如果此时,DNA,分子与某种蛋白质结合，,由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞,在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。,2,主要步骤及内容：,制备探针,DNA,（,P,32,放射性同位素标记,DNA,）,同细胞蛋白质提取物一道温育，形成,DNA-,蛋白质复合物。,将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳分离。,应用放射自显影技术显现具放射性标记的,DNA,条带位置,不存在与,DNA,结合的蛋白质时,存在与,DNA,结合的蛋白质时,凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定,DNA,片段结合的蛋白质分子,(,比如特异的转录因子等,),，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的,DNA,序列的特异性,超量的非标记的竞争,DNA(competitor DNA,）,材料及试剂：,2X,结合缓冲液：,20 mM Tris pH 7.5,、,100 mM NaCl,、,2 mM EDTA,、,10%,甘油、,poly(dI-dC)(5 mg/ml in TE),、,BSA(10 mg/ml),、,P32-,标记探针,缓冲液,C,：,20 mM HEPES pH 7.9,、,25%glycerol,、,420 mM NaCl,、,1.5 mM MgCl2,、,0.5 mM,二硫苏糖醇、,0.5 mM,苯甲基磺酰氟化物、,0.2 mM EDTA,4%,天然的聚丙烯酰胺凝胶,(50 ml),：,5 ml 40%,丙烯酰胺,(30:1),、,2.5 ml 5X,四溴乙烷，,41.95 ml H20,、,0.5 ml 10%APS,（过硫酸铵）、,50 ml,四甲基乙二胺、,0.25X,四溴,烷电泳缓冲夜。,填充染料：,0.2%,溴酚蓝、,0.2%,二甲本蓝、,50%,甘油,操作步骤：,1.,配置反应混合液：探针,DNA(1 ng/ml)0.1ml,、,dH20 6.3 ml,、,2x,结合缓冲液,12.5 ml,、,BSA(10 mg/ml)1.0 ml,、,poly(dI-dC)(5 mg/ml)0.1ml,、,2.,在细胞提取物中加入缓冲液,C,至,5 ml,。,3.,加,1015 mg,上述溶液（,5 ml),到反应混合物中，总体积应不大于,25 ml,。,4.,在室温下培养,20min,。,5.,加入,2.5 ml,的填充染料。,6.,装载样品到,4%,的聚丙烯酰胺凝胶柱中。,7.,室温下跑电泳,2.5h,，至溴酚蓝距底部,1cm,处停止。,8.80,下干燥凝胶，进行放射自显影处理。,二、,DNaseI,足迹试验,(DNaseI footprinting assay),DNaseI,足迹试验是一种测定,DNA,结合蛋白在,DNA,上的准确,结合位点的技术。,首先是单链标记，,然后用,DNaseI,水解单链标记的双链,DNA,，,产生“,DNaseI,保护”，,尿素变性，,PAGE,分离及放射性显影，,形成以相差一个核苷酸为梯度的一系列,DNA,条带，,在此显影图中相应于,DNA,结合蛋白的位置上由于,DNA,结,合蛋白的保护作用而形成了,空白区域,。,如果在电泳时结合,DNA,化学测序，则可准确判断出结合区,的精确序列。,三、甲基化干扰试验,根据,DMS,（二甲基亚蓝）,能使,G,残基甲基化，,而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的,G,残基这一原理而设计,先用,DMS,处理,DNA,；,（并控制反应条件，使之达到平均每条,DNA,分子只有一个残基被甲基化）,将这些局部甲基化的,DNA,群体同含有,DNA,结合蛋白的适当细胞提取物,一道温育；,并做凝胶阻滞试验。,经电泳分离后，,从凝胶中切除具有结合蛋白的,DNA,条带和没有结合蛋白的,DNA,条带，,并用六氢吡啶处理之。,检测靶,DNA,中特异,G,残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用会有什么效应，从而更加详细地揭示,DNA,与蛋白质之间的相互作用模式。,DMS,化学干扰只能在,G,和,A,残基甲基化，不能使,T,和,C,甲基化。,故本实验为足迹实验的补充手段。,四、酵母单杂交技术,真核生物中，转录因子中,DNA,结合结构域,(DNA-binding domain BD),与转录激活结构域,(activationdomain AD),能够相互独立发生作用。,酵母中的转录因子,GAL4,的,DNA,结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用同样可通过转录激活结构域激活,RNA,聚合酶启动下游报告基因的转录,。,设计含目的基因,(,称为诱饵,),和下游报告基因的质粒并将其转入酵母中,;,将文库蛋白的编码基因片段与,GAL4,转录激活域融合表达的,cDNA,文库质粒转化入同一酵母中,;,若文库蛋白与目的基因相互作用可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来,.,注：这里作为诱饵的目的基因就是启动子,DNA,片段,，,文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白,.,酵母单杂交技术广泛用,DNA,与蛋白相互作用的研究。,不足以充分反映生理条件下，,DNA,与蛋白质相互作用的真实情况。,因为，高等生物的基因组有染色质结构，,用以上所提到的方法分析得到的某段,DNA,与蛋白质，在生理状态下，,这段,DNA,很可能并不与其相对应的因子相结合。,另外，染色质结构本身是动态的，,DNA,与非组蛋白在生理状态下的相互作用通常是瞬时的，,以上方法难以捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事件,以上技术都有一定的局限性,八、染色体免疫沉淀技术,Chromatin immunoprecipitation,（,ChIp,）,1.,技术介绍,在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来,2,、主要步骤及内容,细胞的甲醛固定,超声波断裂染色质,氯化铯等密度离心纯化交联的染色质,染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化,交联反应的逆转和,DNA,的纯化,染色质免疫沉淀的,DNA,的分析和蛋白质在,DNA,上结合位点的鉴定,目的蛋白和,DNA,靶序列特异结合的进一步验证,1.,细胞的甲醛固定,在,1%,甲醛的作用下，,DNA,碱基上的氨基或亚氨基和蛋白质上的氨基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸的侧链氨基与另外的,DNA,和蛋白质上的氨基或亚氨基交联在一起，在几分钟内形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。,加入甘氨酸来终止交联反应。,2.,超声波断裂染色质,甲醛交联后的染色质对限制酶和,DnaseI,高度抵抗，,因此通常使用超声波使得染色质断裂。,打断后的染色质片段的平均长度应该在,500-1000bp,左右。,（可以用琼脂糖凝胶电泳来鉴定）,3.,氯化铯等密度离心纯化交联的染色质,氯化铯等密度离心可以除去未交联的蛋白质、,DNA,和,RNA,样品中加入,0.5%,的十二烷基肌氨酸钠，,通常在,4000rpm,离心,72h,。,离心后，用连接到蠕动泵的,0.25mm,毛细管从梯度的底部分步收集染色质组分，在,4,透析过夜。,4.,染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化,用目的蛋白特异性的抗体进行染色质免疫沉淀。,抗体的量要进行优化防止非特异的结合。,用,ProteinA/G-Agarose/Sepharose,回收免疫沉淀复合体。,经过洗涤除去非特异结合的染色质后，,用,1%SDS+NaHCO3,洗脱免疫沉淀复合体。,5.,交联反应的逆转和,DNA,的纯化,在免疫沉淀复合体中加入不含,Dnase,的,Rnase,，,proteinase K,。,65,保温,6h,使交联逆转。,经酚氯仿抽提,-,乙醇沉淀纯化,DNA,。,纯化的,DNA,极少，可用色谱定量。,6.,染色质免疫沉淀的,DNA,的分析和蛋白质在,DNA,上结合位点的鉴定,染色质免疫沉淀的,DNA,的分析方法有许多种。,如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列,是目的蛋白的靶序列，可以采用狭缝杂交和,PCR,分析,;,如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋,白在基因组上的分布情况,找出反式作用因子的结合位,点,可以采用,Southern,杂交、,ChIP,克隆和,DNA,芯片方法。,7.,目的蛋白和,DNA,靶序列特异结合的进一步验证,染色质免疫沉淀分析得到的结果有很大一部分是假阳性，需要采用其他方法验证结果的真实性。,用,PCR,方法进行独立的,ChIP,分析、电泳迁移率变动分析、酵母单杂交系统及荧光素酶报告系统最终确定目的蛋白与靶,DNA,序列的特异性结合。,近年来发展起来的基因芯片（,chip,）染色质免疫沉淀,ChIP,技术,相结合,(chip-ChIP),的方法,要一个,PCR,步骤来扩增染色质免疫沉淀富集的,DNA,。,特异性染色质免疫沉淀的,DNA,和对照,DNA,的,PCR,产物,分别用,Cy5,和,Cy3,荧光光标记，,用于与含有整个基因组的,DNA,芯片进行杂交。,通过比较两种荧光信号的强度筛选出目的蛋白可能的结合序列,在基因组的水平上绘制出目的蛋白的分布图谱。,chip-ChIP,法大大促进了在基因组水平上高通量,对,DNA,和蛋白质的相互作用的研究,。,前景与展望：,进一步研究,DNA,蛋白质的相互作用需要,生物学、化学、医学、物理学、计算机学及电子学等多学科的协作。,随着各种新技术在这个研究领域的应用，,人类一定能在不远的将来揭开蛋白质与核酸相互作用的规律。,谢谢！,